回 顧 論 文
生物材料應用於人工血液的發展與應用
林中英 蔡偉博
* 國立台灣大學化工所 摘要：血液替代品目前在緊急輸血上的需求有日益增加的趨勢，而人工替代血液的產品與研發也尚在臨床 試驗的階段。目前研發中的血液替代物的三種作法，有以血紅素為基礎的產品、具免疫辯識能力的紅血球 型的產品以及化學合成的過氟碳化合物 (PFC)。本文將針對不同型態的人工替代血液及其使用材料的發 展，進行討論及說明。 關鍵字：血液替代品、血紅素、過氟碳化合物、紅血球簡 介
1628 年 William Harvey1首先提出血液循環之研 究，1933 年 Bisceglie3成功地將修飾後的腫瘤細胞植入 猪的腹腔，讓細胞的存活時間除了有效延長之外，並且 也降低了免疫系統的辨識能力，從此開啟了人工血液之 研發構想。 目前有數以萬計1,2發生意外事故的受傷者、手術中 的病患、罹患白血病、癌症或鐮刀型細胞疾病以及地中 海型貧血等慢性疾病病患，需要依賴輸血以維持生命或 治療疾病。但是，因為異體血液捐血人愈來愈少以致醫 療院所經常出現血液庫存不足的情形，依美國血庫 1的 資料指出，每年全世界捐血量約 8,000 萬單位的血量， 而全球血量的需求量估計約在一億單位，是以世界人口 所獲的捐血量不足以支持日益增加的醫療疾病的血液需 求量。 推動血液替代品的發展，乃因感於異體血液輸血的 危險及醫療院所經常出現血庫存血不足之情形 4。除了 時有所聞各地捐血中心常因捐血來源不穩定、血型不符 及血漿保存期限有限等問題而面臨血荒的窘境外，在臨 床上由於傳染病和病毒（特別是愛滋病和肝炎）經由輸 血的途徑感染而增加散播之危險性的新聞也不時聽到， 加上血液儲存的時間增加，污染的危險與儲存的時間便 會成正比。以上需求使得人們逐漸重視並且朝向研發可 以攜帶氧氣及養料至身體組織以維持身理機能的血液替 代品(blood substitute)5,6,7。 綜合以上所知，血液替代品除了可替代真實血液作 為急救、手術輸血、疾病治療、器官移植及器官保存等 方面的應用之外，亦可杜絕因為輸血時所造成之交叉感 染。因此，血液替代物在往後幾年臨床上的需求及應用 將日漸增加。文中表一為所列為血液替代物應用在臨床 上所具有的功效。臨床應用
血液替代物的生物材料與動物體本身是直接的接觸 或施打，因此需有無負作用且在生物體內具有安全性，無毒性、高度的生物相容性不引發免疫反應，長期植入 體內能以穩定的結構存在的特性。目前常被應用的生物 材料可分為合成材料(如高分子聚合物、聚乳酸等)與天 然材料(幾丁質、幾丁聚糖、葡萄聚糖等)二類。 表一 血液替代物的功效6 減少異體血液輸血傳染疾病的危險 表現更佳的器官功能性 降低照料時因輸血所需的費用 縮短住院治療時等待輸血的時間 減少身體因免疫所引發的一些症狀 較少併發症出現 更好的攜氧功能至組織 適合大量生產與長期保存 在 許 多 被 考 慮 做 為 血 液 的 材 料 中 ， 血 紅 素 (Hemoglobin)為首先被使用而成為攜氧者的角色。絕大 多數的血液替代物也都是以血紅素為基礎而研究開發出 來的產品，因此改質血紅素的生物材料也多針對其物理 與化學結構上來設計，使的血紅素的性質不致於因為離 開了紅血球而減少了其半生期，並且具有其原來生理功 能。在本文中，將綜合分析、討論幾個已經在臨床試驗 上的血液替代物的生物材料。 血液替代物 6在研究發展上通常可分為三類。以血 紅素為基礎的(based on hemoglobin)產品，其中也包含了 與 原 始 血 紅 素 功 能 最 相 近 的 脂 質 體 包 覆 的 血 紅 素 (liposome-encapsulated hemoglobin)、化學合成的過氟碳 化合物(based on perfluorocarbons)和直接用紅血球細胞進行修飾的 產品(Immunocamouflaged red blood cells)。而扮演修飾的 生物材料也依進行反應的方式有不同功能，其中脂質體 (liposomes)雖與血紅素功能相近，可惜受限於製造上的 價格與複雜度高，所以無法有大量臨床發展上的應用。 表二為已在臨床試驗階段的血液替代物，顯示人工血液 的商品化的腳步已經不遠了。 表二 已在臨床試驗階段的血液替代物 產品(製造商) 組成 適應症 臨床試驗階段 PHP(Apex Bioscience) PEG-Hemoglobin(Enzon) PolyHeme(Northfield Lab.) HemopureTM (Biopure) HemolinkTM (Hemosol) HemAssistTM (Baxter) OptroTM (Somatogen) OxygentTM (Alliance Pharm-aceutical)
OxyfluorTM (HemaGen/
PFC)
Pyridoxylated human Hb conjugated to polyoxyethylene Bovine Hb conjugated to polyethyl- ene glycol
Glutaraldehyde-polymerized, pyrido- xylated human Hb Glutaraldehyde-polymerized, bovine Hb
o-Raffinose-polymerized, human Hb
Human Hb internally cross-linked with bis(3,5-dibromosalicyl)fum- arate (DBBF)
Recombinant dialpha human Hb Emulsified perflubron Emulsified perfluorodichlorooctane 敗血症的休克 放射敏感的實性 腫瘤 外科手術 血液稀釋；鐮刀 型細胞疾病 外傷；血液稀釋 血液稀釋 血液稀釋；紅血 球生成 血液稀釋；心肺 分流術 心肺分流術 III Ib III III II 中斷 中斷 II 中斷
( 一 ) 以 血 紅 素 為 基 礎 的 產 品 (Hemoglobin-based products)6-16 血紅素係由 4 個次單位多 鏈6 (Subunit polypeptide chains)所形成的一個中性攜氧者，每一個鏈係由大約 140 個氨基酸所組成。正常包裹於紅血球中，當它游離於溶 液時，則變的易碎的：有氧化的傾向，結構不穩定的及 有毒性的，會被腎臟所排泄，因為次單元所解離(subunits dissociate)成二聚物(Dimers)或單分子(Monomers)所致。 此外，游離態的血紅素在血管裡可能會遭遇到其他蛋 白質而來的膠質壓力4,8 (oncotic pressure) 使的調節血漿 體積與組織液平衡的因子失調；還有，對氧氣的親合力也 與被紅血球細胞包覆時來的不同，係因紅血球外部的異位 效 應 劑 (allosteric effectors) 、 2,3-Diphosphoglycerate
(2,3-DPG)和腺 三磷酸皆不存在所致。為解決這些問 題，使的血紅素在血漿中不致被分解又能成為一個良好的 攜氧者。針對血紅素的化學修飾所採用的生物材料作法也 可以區分為以下三類： (1)表面修飾型的血紅素(surface-modified hemoglobin) 血紅素與葡萄聚糖(dextran)(圖一) 8；或聚乙二醇 (polyethylene glycol；PEG)分子產生共軛鍵結來達成修飾 的目的。透過這些材料的修飾能延長血紅素在血管裡的 存活時間。葡萄聚糖為一聚 1-6-α-葡萄糖(poly-1-6-α- D-glucose)的分子與 1-3-α- gluco- pyranosyl 分支錯綜交 互連接著的聚合物。葡萄聚糖與生物體的生物相容性良 好，已被醫藥界廣泛應用在臨床血漿容積擴張上。與血 紅素共軛鍵結後的產品具有使免疫反應降低、分子結構 穩定、對生物體無毒性且與水溶液的溶解性高等優點 10,11。製備的方法會先將葡萄聚糖分子反應成帶溴分子的 葡萄聚糖，然後在室溫下便能與血紅素反應形成共價鍵 結，不需煩雜的去氧化程序。 聚乙二醇也是一種無毒的生物高分子。將聚乙二醇 與 Pyridoxylated 血紅素共軛鍵結後的產品與正常的血紅 素作比較，發現修飾後的血紅素在血漿裡有比較長的存 活期及在大鼠的動物模式裡有較快的療效10。 雖然聚乙二醇-血紅素可作為血液替代品之一，但是 它在身體裡的代謝速度也很快，加上血紅素對氧的親合 力太高以致於無法釋放氧氣給組織。日本的 Ajinomoto 公司6,12將人的血紅素先與 Pyridoxal phasphate 進行共軛 鍵 結 以 降 低 其 對 氧 氣 的 親 合 力 後 ， 再 以 聚 氧 乙 烯 (Polyoxyethylene ； POE) 進 行 反 應 ； 其 商 品 名 為 PHP (Pyridoxalated hemoglobin polyoxyethylene)12 (圖二)。臨 床測試前的報告指出 PHP 對人體的安全性是適合的，而 Apex Bioscience 公司在 1992 年也取得了美國食品與藥
物管理局的 IND (Investigational New Drug)許可而進行 第一期臨床試驗，目前已經到第三期了。由於此產品的 特性可與一氧化氮(Nitric oxide；NO)結合，所以 PHP 產 品可做為病人若有敗血症休克現象時提升血壓的試劑。 Enzon 公司也生產類似的 PHP 產品，只是此公司採用了 牛的血紅素，效果也不錯，目前也在第一階段的臨床試 驗中12。 表面修飾過後的血紅素分子增加了分子量與分子表 面的特性，讓血紅素分子被循環系統移走的速率變慢 了 ， 也 降 低 了 抗 原 性 (antigenicity) 與 網 狀 內 皮 系 統 (reticuloendothelial system)的視度(visibility)。此外，表 面 修 飾 過 後 的 血 紅 素 分 子 還 具 有 很 高 的 膠 質 壓 力 (oncotic pressure)及黏度(viscosity)，這些特性讓產品成為 很有潛力的血液容積擴張的試劑。 圖一 葡萄聚糖結構圖8 圖二 顯示 PHP 與聚氧乙烯聚合後在溶液中的結構 圖。PHP 是由四聚物所組成，在溶液中，一部份 的四聚物會藉聚氧乙烯上的雙官能基與其他的四 聚物上的胺基產生交聯。交聯後的四聚物依賴溶 液的特性可分解或結合成不同型態的分子12。
(2)分子內交聯的血紅素產品(Intramolecular cross-linked hemoglobin)10-18 分子內交聯的血紅素是把次單位間會產生解離的多 肽鍵用具有特殊的化學交聯劑聯結著以防止多 鏈裂 解成雙分子(dimers)或單分子(monomers)，所以分子量無 明 顯 的 改 變 。 開 發 出 來 的 交 聯 劑 命 名 為 bis (3,5- dibromosalicyl) fumarate(DBBF)( 見 圖 三 ) 。 Baxter Healthcare 公司利用血紅素上α鏈離氨酸(lysine)99 的位 置與 DBBF 互相產生交聯以形成 4-碳共價鍵 (Lys α1 99-Lys α2 99)13 (見圖三)的血紅素，公司商品名為 DCLHb 與 HemAssistTM。雖然交聯劑穩定了血紅素的結構，可 以利用熱處理程序來防止病毒或細菌的污染。但在休克 或復甦的動物模式裡注入經 DBBF 修飾過的血紅素則顯 示其具有嚴重的血管活性(Vasoactivity)、使動物血壓升 高而增加了全身與肺血管的阻力4,13。這些陸續出現的臨 床症狀使在美國與歐洲進行第三期臨床試驗時因無法通 過測試而中斷了。 B r B r O C C O C C C H O O H B r B r C O H O O H O C O C C C H O H (A ) D B B F 交 聯 劑 的 結 構 (B )血 紅 素 分 子 與 D B B F 交 聯 劑 形 成 交 聯 血 紅 素 的 簡 圖 圖三 (A)DBBF 交聯劑的構造與(B)DBBF 在次單位間 的交聯示意圖13。 OptroTM則是以基因重組的方法而來的一血液替代 物。Somatogen 公司利用基因重組技術將人類血紅素表 現 在 大 腸 桿 菌 (E.Coli) 裡 成 了 一 雙α- 血 紅 素 (Dialpha hemoglobin)的構造 16(圖四)。雙α-血紅素已將血紅素中 的兩個α鍵的頭尾(head-to-tail)部份熔合，讓雙α-血紅素 無法解離成次單位分子，也就不會被腎臟代謝快速的問 題發生。而且血紅素與氧氣結合的能力與正常血紅素的 功能是很類似的，Somatogen 公司命其商品名為 rHb 1.1。此產品最大的困難點為大量化生產時產品無法達到 高產率、基因表現不高、不適當的蛋白質折疊與組裝發 生、產品純化的純度與合理的價格。Somatogen 公司雖 一一解決了這些難題而在 1991 年正式進行第一期的臨 床試驗。不過，人體使用此產品時卻會有胃腸方面的負 作用出現，後雖證實負作用的發生是因為血紅素在清除 一氧化氮所引起的徵狀；不會影響 rHb 1.1 攜氧至肌肉 等組織中，但是在完成了第二期的臨床試驗後，卻沒有 繼續第三期的臨床試驗15,16。 圖四 利用基因重組技術所生產的人工血液,雙α-血紅 素16。 (3)聚合型的血紅素產品(Polymerized hemoglobin)7,13,15,17 聚合型的血紅素分子是利用血紅素上的胺基(amino groups)先與交聯劑反應後，再去與其它血紅素分子交聯 或聚合以產生更大分子量的聚合物 15 (圖五)。Northfield 實驗室 6研發以血紅素為基礎的紅血球替代物；商品名 為 PolyHemeTM；從已過期的全血中取得血紅素後，與具 有雙官能基的交聯劑戊二醛(Glutaraldehyde)反應，經由 交 聯 劑 的 聯 結 作 用 ， 使 血 紅 素 分 子 間 產 生 聚 合 。 PolyHemeTM 對 氧 氣 的 親 合 力 和 膠 體 滲 透 壓 (Colloid osmotic pressure)都與人類全血的特性符合。 加拿大的 Hemosol 公司6自行研發的血液替代物， 商品名為 HemoLinkTM。此產品是將人類的血紅素分子 與 植 物 蜜 糖 ； 一 具 有 多 官 能 基 且 是 開 環 狀 的 試 劑 raffinose (o-raffinose)產生交聯與聚合。以植物蜜糖當交 聯試劑時能讓血紅素分子產生不同分子量的血紅素高分 子體，不但不需要去除未進行反應的血紅素分子，也不 用擔心分子量過低的情形。
Biopure 公司6則是純化牛的血紅素分子後，與戊二 醛反應成不同分子大小的血紅素聚合體，商品名 為 HemopureTM。對於未反應血紅素及有潛在毒性的四聚體 (64 kD)與二聚體(32 kD)可以用簡單層析法將其分離出 來。HemopureTM雖然有效的輸送氧氣到組織並執行輸送 的功能，但是在臨床試驗上卻發現即使在很低劑量下也 會讓血管血壓升高，產生較低的心臟指數(lowers cardiac
index)。Biopure 的另一產品 OxypureTM則獲得 FDA 的許
可已商業化應用於動物輸血供需使用上。 在國內，研究學者從中藥梔子果實萃取純化出來的 天然交聯劑 Genipin 和 Reuterin，來交聯血紅素做為血液 替代物。由於 Genipin 與血紅素上胺基的反應速率較戊 二醛要來的溫和許多，添加甘氨酸(glycine)便能有效的 達到終止聚合血紅素反應的目的，因此在聚合過程中較 有利於分子量分佈的控制，Genipin 與 Reuterin 聚合血紅 素做為人工替代血液應是相當可行的。但由於受限於聚 合度的關係，聚合後的血紅素仍然有機會經由微血管的 間隙滲漏出去，因而使得半衰期有一定的瓶頸存在。因 此要更有效的提昇半衰期，必須要增加血紅素的體積17。 (4) 脂 質 體 包 覆 型 的 血 紅 素 (Liposome-encapsulated hemoglobin)6,18 血紅素原是包覆在紅血球細胞膜內，所以用脂質體 來包覆血紅素時的研究報告指出與原始的血紅素功能最 相近，目前雖無任何商業化產品出現，但是對未來發展 血液替代品是一種相當有潛力的產品。 最廣泛應用的脂質體材料為膽固醇與其他脂質組合 成的磷脂質所構成，除了能賦予脂質體柔韌性和耐久性 外，藉由神經節糖 (Ganglioside GM1)和膽固醇等分子 的包覆後的血紅素注射於動物體內時，這種脂體會快速 的與免疫球蛋白 G、白蛋白及其他調理素(Opsonins)附 著。但是，脂質體包覆型的血紅素並不穩定，無法成為 產品時需要的大量化製造與滅菌等問題。較新的設計包 括應用表面成份聚乙二醇或葡萄糖，能使脂體穩定於循 環中。 (二)以過氟碳化合物為基礎的產品(perfluorocarbon- based products)6,18,19,20 過氟碳化合物(PFCs)是以化學法合成惰性的鹵素分 子的化合物；除可以溶解大量的氣體於分子內，無生物 來源的困擾與低價格等特性讓此產品成為最有希望的血 液替代物。但過氟碳化合物無法被直接使用，需先先與 血漿等水相溶液混勻成為乳狀物後，才能導入血流中。 受測試的接受者接受過氟碳化合物有時會出現發燒或類 似感冒狀態的癥狀，雖然讓人不舒服但卻沒危險。 Alliance 製藥公司所生產的商品名為 OxygenTM 18
(圖六)，此產品與蛋黃卵燐脂(Egg yolk lecithin)結合後在 乳化過程中能形成一穩定的結構存於血漿中。過氟碳化 合物的優點除了對氧氣、二氧化碳等氣體有很高的溶解 度外，高密度及化學鈍性佳，產品價格低廉、銷售期長 (long shelf life)及原料的供應無虞都是此產品的優點。
F2C F2C C F2 C F C F F2 C C F2 C F2 C F2 F2 C F2C F2C C C F2 C F2 C F C F2 N F F2C F2C C F2 C F2 C F2 P F D P M C 圖六 過氟碳化合物的結構18 圖五 血紅素交聯聚合示意圖15
HemaGen 公司所生產的過氟碳化合物的商品名為 OxyfluorTM，為一 40 %體積比例的 Perfluorodichlorooctane (PFDCO)乳化後的產品，仍需藉由蛋黃卵磷脂質(Egg yolk phospholipid)與紅花油(safflower oil)才能夠穩定其結構。 產品在 100 %氧氣平衡下，可攜帶 17.2 %體積的氧氣，在 室溫下其存活期可長達 1 年。但是在動物實驗中發現肺會 有過度充氣(Lung hyperinflation)的現象，在第一期臨床試 驗時，因為有幾種副作用產生，目前已經中斷了臨床試驗。 (三)以紅血球細胞為基礎的產品
(Immunocamouflaged red blood cells)20-23 血紅素或化學品過氟碳化合物雖然都證明這些產品 攜氧能力與正常的血紅素類似，成為商業化的血液替代 物也指日可待，但是伴隨而來的負作用與結構穩定等問 題讓臨床試驗的腳步變慢了。如果直接用紅血球分子來 作為血液替代品，是不是能解決血紅素所面臨的問題。 而不同血型的捐血者可以不需要考慮血型，在急性失血 裡可以直接供應這些血液替代品，達成緊急醫學的目的。 紅血球細胞作為人工血液是非常方便與快速的程 序，但是細胞膜表面的抗原與血漿中的抗體，如果因為 免疫反應而產生辨識時，會發生血液凝集。所以以細胞 為基礎的產品，多以修飾膜上抗原與抗體辨識的位置， 如此抗體無法產生辨識時，免疫反應便不會產生。 1977 年，Aubuchowski21等人利用聚乙二醇與牛的 白蛋白及肝的過氧化氫 共價聚合後，除無免疫反應發 生外；在兔子的動物模式下存活的時間變長了。目前有 許多以聚乙二醇修飾的醫療產品已得到 FDA 的許可可 使用於人體上。 聚 乙 二 醇 2 0 是 一 個 由 重 復 的 環 氧 乙 烷 次 單 位
(Ethylene oxide subunits)組合而成的一雙性聚合物，聚合 物的兩端各是一個羥基(Hydroxyl group)，可以作為化學 修飾與活化的位置。聚乙二醇也是一個中性分子，每個 環氧乙烷上的氫鍵可與 3 個水分子產生吸引，所以聚乙 二醇對於水具有絕佳的親合力。 細胞的修飾成每一種血型都能進行輸血的話，通常 是在細胞膜表面上對能產生辨識作用的官能基作免疫偽 裝 (Immunocamouflage) 以 避 開 抗 體 細 胞 對 其 的 攻 擊 (圖七)。先經由聚乙二醇以共價鍵結的方式將細胞的表 面作修飾後有偽裝的功 能。細胞膜上曝露了許多蛋白質的胜 平面上的ε 胺基酸為糖化反應的最主要目標部份。聚乙二醇上的羥 基官能基與ε胺基酸的胺基產生共價鍵結，便能形成一 層保護層，使的抗體無法辨識。經由修飾後的聚乙二醇-紅血球雖不會讓細胞失活或阻礙小分子的輸送與酵素的 分解代謝(Catabolism)功能，但是另一邊的羥基官能基可 能會與溶液中的殘基發生化學反應性而攻擊聚乙二醇聚 合物22。 為解決不必要的化學反應出現，一端的羥基常會與 化學交聯劑反應取代羥基這一官能基。常用的化學交聯 劑 是 cyanuric chloride 、 succinimidyl propionate 、 benzotriazolylcarbonate 與 tresylchloride，再去與細胞表 面發生反應。而另一端的羥基主要被甲基所取代，產生 甲氧基聚乙二醇(Methoxypolyethylene glycol；mPGE)。 甲氧基聚乙二醇因為反應性低，多用來做蛋白質改質修 飾用。甲氧基聚乙二醇-紅血球展現出具有良好的溶解 度、保存期限長、無毒性及體內的免疫力降低或不存在 22,23 (如圖八)。 雖然以細胞做為血液的替代物尚未有真正的臨床試 驗產品。但是，這些研究對預防異體免疫的感染時需進 行長期紅血球的輸血療法的疾病，如鐮刀型貧血(sickle cell anaemia)與地中海貧血(thalassaemia)疾病或研發出 一不需考慮血型的血液替代物都是一項正面的消息。 圖七 紅血球細胞表面的免疫偽裝示意圖。(A)為聚乙二醇分子在細胞表面與抗原形成共價鍵結以避開抗體的辨 識功能。(B)聚乙二醇另一羥基官能基也產生聚合反應時在細胞表面會形成一層殼狀物。(C)重復的聚合反 應型成更多層的殼狀物20。
(A) (B) (C) (D) 圖八 經電子顯微鏡掃描經修飾前後的紅血球型態。(A) 為正常的紅血球細胞與(B)甲氧基聚乙二醇在膜 表面修飾後的紅血球細胞在 5500 倍下的型態。 (C)2300 倍率下的正常紅血球細胞與(D)甲氧基聚 乙二醇在膜表面修飾後的紅血球細胞22,23。
結 論
人的生命離不開氧，氧和紅血球細胞中的血紅素結 合後，利用血管輸送養分到體內各組織器官，是以血液 是氧氣交換及供給的重要的循環系統。雖然現在的血液 替代品都尚在測試階段，但是研究所開發出來的生物材 料在氧氣輸送的功能上，已經可以與正常的血紅素分子 類似，在毒性、生物相容性、功效與產品保存期方面的 發展有明顯進步與改善。無論那一種血液替代品研發成 功可以應用於生物體上，都是在拯救生物的生命。本文 綜觀目前在血液替代品上的應用原理與發展作個簡述， 讓此研究課題可以多方面開發，以應付層出不窮的疾病 感染問題。望以此文拋磚引玉，能獲得更多前輩的迴響， 使得此一課題可以有更進一步的發展與長足的進步。參考文獻
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