台灣甘藷品種之 ISSR DNA 標誌變異研究
簡靖華
(1)賴永昌
(2)陳一心
(3)林順福
(4)*摘 要
本研究以DNA 分子標誌評估台灣甘藷品種之遺傳變異，共篩選 100 條 ISSR 引子，獲得 81 個具多型性之分子標誌，其中 23 個分子標誌具有訊號較強之穩定條帶，可利用於建立台灣 地區甘藷品種之DNA 指紋資料庫。甘藷品種之遺傳相似性分析結果顯示台灣主要甘藷品種間 之遺傳距離介於12.5% 到 94.4% 之間，各品種間之平均遺傳距離為 54.9%，利用多向雜交族群 所選育之新品種分散在各個樹狀圖分群中，顯示台灣新育成甘藷品種已具有較大程度的遺傳歧 異性。分群分析及主成份分析結果均發現台灣甘藷品種群與中國大陸品種群有較大之遺傳距 離，顯示中國大陸甘藷種原未來可利用於雜交親本之潛力。而主成份分析結果亦推薦一套有效 率之品種鑑定流程，此一流程以6 條引子所增幅之 14 個分子標誌為工具。分別以兩個塊根用 （台農66 號及桃園 1 號）及兩個葉菜用甘藷品種（桃園 2 號及台農 71 號）為材料探討無性繁 殖可能產生之遺傳變異，分析相同品種不同植株之ISSR 分子標誌之差異，各個參試品種調查 約2,640 ～ 3,510 個分子標誌，發現品種內約有 0.94% ～ 1.86% 之 ISSR 分子標誌變異。本研究 所建立甘藷品種之DNA 分子指紋資料將可供甘藷品種鑑定、品種繁殖及品種改良之參考。 關鍵詞：甘藷、分子標誌、品種鑑定前 言
甘藷在十七世紀初（明末荷蘭佔領台灣時期）由福建傳入台灣栽培（李，1994），此後台 灣甘藷品種改良工作可分為四個階段，第一階段為自1895 ～ 1945 年期間（日據時期），此時 甘藷主要用途為澱粉、釀造及溶劑原料，育種單位除了由國外各地進行引種及選種之外，並利 (1) 國立台灣大學農藝系碩士班研究生。 (2)農委會農業試驗所嘉義分所農藝系系主任。 (3)農委會農業試驗所嘉義分所農藝系前系主任。 (4)國立台灣大學農藝系助理教授。 *通訊作者。 （民國97年6月11日收件；民國97年7月30日修改；民國97年8月6日接受）用本地種及引進之優良品種進行雜交育種；第二階段則為1946 ～ 1960 年期間（光復初期至栽 培盛期），育種目標分向紅肉及白肉兩方面進行，一則希望育成澱粉含量高的白肉品種，做為 飼料及澱粉原料，二則希望育成營養豐富之紅肉品種，做為輔助食糧之用；第三階段在1961 ～ 1970 年期間，此時育種方法主要採用多向雜交（polycross）以產生逢機交配族群供選種，育種 目標以適應性廣、適於機械作業栽培及優良品質為主；第四階段為1971 迄今，育種目標為食 用及食品加工用為主，澱粉為副，同時注意葉菜用品種之選育（李，1994）。 甘藷具有異結合之六倍體基因型，大部分品種具有自交不親和性，不同品種間也有雜交不 稔群的存在（Hernandez and Miller, 1964），但是經過長期的雜交育種，新育成品種已無法區別 其所屬之雜交不親和群，因此增加雜交親本選擇的困難。為利於將來育種研究者進行甘藷雜交 育種時親本的選擇及遺傳變異性之維持，對於品種間遺傳相似性與雜交不親和群之間在分子層 次上的關係有必要進行探討。又由於甘藷利用無性繁殖也常產生體細胞變異，導致品種優良性 狀逐漸喪失，品質變劣等，而因採苗及種藷繁殖時未掌握原有品種之優良特性，也使得優良品 種之純度無法保持（李，1994）。 甘藷的生長習性、葉形、塊根肉色及表皮顏色等形態及外表性狀可方便且快速區分部分甘 藷品種，但此方法受限於外表多型性仍不足以區別大量品種，且易受生育時期及栽培環境不同 而影響其表現，及有些遺傳變異不易由外表察覺，故無法有效利用外觀性狀評估品種間的遺傳 相似性或差異性（Andersen and Fairbanks, 1990）。許多研究曾經利用同功酵素有效區別栽培種 與野生種甘藷（Kokubu and Hirai, 1978; Kokubu and Maeda, 1978; Kokubu and Nakakawaji, 1982; Xue et al., 1988），Kennedy 及 Tompson（1991）利用 12 種同功酵素區分 9 個甘藷栽培種，但此 種標誌可能受到發育時期與環境變化影響表現，或受限於具多型性的同功酵素數目之不足，因 此仍無法達到大量品種鑑別之目的。
DNA 分 子 標 誌 是 作 物 品 種 鑑 別 及 分 析 個 體 間 遺 傳 差 異 的 優 良 工 具（Andersen and Fairbanks, 1990; Smith and Smith, 1992; Gepts, 1993; Jarret and Austin, 1994），其以 DNA 多型性為 基礎，直接偵測核苷酸序列之差異，以供遺傳變異之分析（Brown, 1992; Monckton and Jeffreys, 1993; Connolly et al., 1994; Zhang et al., 2000）、連鎖圖譜之建立（Ukoskit and Thompson, 1997） 及分析抗病等重要性狀之遺傳機制（Miano et al., 2008）。Zietkiewicz 等人（1994）提出 inter-simple-sequence-repeat（ISSR）分子標誌的概念，ISSR 是在重複性短序列的 3' 或 5' 端加上 1 至 4 個核苷酸後做為引子，再進行聚合酵素連鎖反應（PCR），放大相鄰重複性短序列（SSRs）之 間的DNA 片段，此種分子標誌之重複性與穩定性皆高，於作物種間及種內均有良好的鑑別效 果（Huang and Sun, 2000），又具有方便操作及分析之優點，為作物種原遺傳歧異性分析及品種 檢定之優良工具（潘，2002）。
本研究利用ISSR DNA 分子標誌探討甘藷品種間之遺傳相似性及品種內遺傳變異程度，以 供甘藷品種鑑別及雜交育種之參考。
材料與方法
一、甘藷品種間 ISSR DNA 標誌變異分析 試驗材料：本研究所使用材料為由農委會農業試驗所嘉義分所提供之台灣早期引進及近年 栽培之39 個甘藷品種（系），另加收集自民間之台農 10 號及台農 64 號品種樣品進行分析，共 41 個參試樣品（表 1）。 試驗方法： （一）葉片 DNA 抽取方法：首先將由田間剪取之甘藷葉片經真空乾燥後，同一品種（系）取 5 片來自不同單株之新鮮葉片（約 0.05 g）為 DNA 抽取材料，葉片 DNA 抽取步驟參考 Doyle 及 Doyle（1990）的 CTAB 法。（二）ISSR（Inter-simple sequence repeat）分子標誌分析：本試驗所使用引子是由加拿大的哥 倫比亞大學（University of British Columbia, UBC）所合成的第 9 組引子，共有 100 種 不同的核酸引子序列，引子序列長度為17 ～ 22 mer，由簡單的重複鹽基序列組成。 先由41 個甘藷參試 DNA 樣品中逢機選 5 個樣品進行 100 個核酸引子之初步篩選。選 出可在樣品間擴增多型性 DNA 片段之逢機引子進行進一步分析。聚合酵素連鎖反應 （Polymerase Chain Reaction, PCR）及電泳分析步驟參照潘（2002）之方法。
（三）甘藷品種 ISSR DNA 指紋鑑定資料之建立：將各品種所得之ISSR 分子標誌依使用之引 子、多型性條帶之分子量及條帶之有無（1 或 0）等分別登錄及建檔，以供特定品種指 紋鑑定之依據。
（四）甘藷品種 ISSR DNA 遺傳相似性分析：根據電泳結果紀錄由產生之多型性條帶中篩選出 具有品種間差異性的分子標誌，將所得資料根據條帶之有無，分別以1 和 0 表示。利 用Jaccard's coefficient of community 進行樣品間遺傳距離的估算，利用 NT-SYS（版本為 2.0）軟體計算遺傳距離矩陣（genetic distance matrix），再利用 TFPGA（Tools for popu-lation genetic analyses）程式（Miller, 1997）以 UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic mean）法進行分群分析（cluster analysis），以探討台灣甘藷品種間之遺傳變 異。
（五）甘藷品種 ISSR 分子標誌之主成份向量分析：利用NT-SYS 程式對篩選出的 ISSR 分子標 誌所得之資料進行主成份向量分析（Principal Component Coordinate Analysis, PCA），計 算各個主成份之特徵根（Eigenvalue）及特徵向量（Eigenvector）以探討不同引子對甘 藷品種之鑑別效果，並以NT-SYS 軟體利用前兩個主成份繪製各個品種的遺傳距離分佈 圖。 （六）甘藷品種 ISSR 分子標誌鑑定流程之建立：利用NT-SYS 軟體所計算出之各個主成份之特 徵向量中，依據各分子標誌之不同鑑別效果，篩選品種間差異性較大且條帶訊號較強之 分子標誌，利用貢獻度較大之分子標誌，建立不同引子之分析流程。 二、甘藷品種內 ISSR DNA 標誌變異分析 試驗材料：所使用材料為台灣目前栽培面積較廣之品種，包括兩個塊根用甘藷品種（台農
表1 本研究所評估之 41 個甘藷品種 ( 系 ) 之來源及主要用途
Table 1. Sources and main utilizations of the 41 sweet potato lines evaluated in this study.
編號 品系名稱 來源 主要用途 親本 母本 父本 1 C82-S59 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 2 CYY86-09 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 3 C82-S12 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 4 CY86-S29 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 5 台農10 號 台灣 飼料用 美國黃皮 紅皮 6 台農10 號 * 台灣 飼料用 美國黃皮 紅皮 7 台農新31 號 台灣 澱粉及飼料用 白和蘭 元地 8 台農57 號 台灣 食用及澱粉用 台農27 號 Nancy Hall 9 台農62 號 台灣 食用及飼料用 台農17 號 Nancy Hall 10 台農 64 號 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 11 台農 64 號 * 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 12 台農 66 號 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 13 台農 67 號 台灣 食用及澱粉用 農林17 號 Centennial 14 台農 68 號 台灣 加工用 多向雜交族群 15 台農 69 號 台灣 食用 多向雜交族群 16 台農 70 號 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 17 台農 71 號 台灣 葉菜用 多向雜交族群 18 CYY86-01 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 19 桃園 1 號 台灣 食用及加工用 多向雜交族群 20 桃園 2 號 台灣 葉菜用 多向雜交族群 21 台南 17 號 台灣 澱粉及飼料用 彰化種 台農17 號 22 台南 18 號 台灣 澱粉及飼料用 台南15 號 台農新31 號 23 桃園紅皮紫心 台灣 地方品種 24 白皮紫心 台灣 地方品種 25 紅皮紫心 台灣 地方品種 26 黃皮紫心 台灣 地方品種 27 彰化種 台灣 地方品種 28 廈門種 中國大陸 29 慶仔種 中國大陸 30 栗子香 中國大陸 沖繩100 號 Nancy Hall 31 小燈種 中國大陸 32 紅仁種 中國大陸 33 徐藷 18 號 中國大陸 澱粉用 Nancy Hall 沖繩100 號 34 高系 14 號 日本 食用及加工用 35 紅肉 日本 36 九州 100 號 日本 37 日本金時 日本 38 沖繩 100 號 日本 澱粉、食用及飼料用 七福 潮州 39 Sasahikari 日本 40 農林 40 號 日本 41 Beniazuma 日本 食用及加工用 註:“*＂表示為民間保存之品種。
66 號及桃園 1 號）及兩個葉菜用甘藷品種（桃園 2 號及台農 71 號）。 試驗方法：每一品種取來自30 株不同單株之新鮮葉片，葉片 DNA 抽取方法及 PCR 分析 如前所述。利用100 個 ISSR 核酸引子調查是否有品種內變異產生，若發現具有變異之分子標 誌，則再重新測定以確認新變異之產生，根據分析結果探討品種內變異程度。
試驗結果
一、甘藷品種間 ISSR DNA 標誌變異分析 （一）甘藷品種 ISSR DNA 指紋資料庫之建立：本試驗先利用逢機選取的5 個甘藷品種（系） 包括台農10 號、台農 64 號、小燈種、台農 57 號及紅肉等，以 100 個 ISSR 引子進行有 效引子之初步篩選，得到可擴增DNA 片段之核酸引子共 49 個，再分析 41 個甘藷品種 （系），獲得具有多型性且訊號較強之14 個核酸引子（表 2），所佔比例為 28.6%，共得 表2 本試驗篩選得到可供甘藷品種鑑定之 14 條 ISSR 引子及其產生之分子標誌Table 2. The 14 selected primers and the amplified molecular markers. 引子 類別 引子 代號 引子序列 GC 含量 (%) 產生 條帶數 多型性條帶 分子量 (bp) 數目 (%) di-nt 807 (AG)8T 47.1 19 11 57.9 500-2000 811 (GA)8C 52.9 11 4 36.4 600-2100 812 (GA)8A 47.1 10 5 50.0 600-2000 814 (CT)8A 47.1 13 9 69.2 400-1500 818 (CA)8G 52.9 11 6 54.5 400-1500 822 (TC)8A 47.1 7 3 42.8 500-2000 827 (AC)8C 52.9 11 7 63.6 400-1700 834 (AG)8YT 50.0/44.4 8 3 37.5 400-1700 841 (GA)8YC 50.0/55.6 18 9 50.0 300-1500 857 (AC)8YG 50.0/55.6 11 8 72.7 450-2000 tri-nt 864 (ATG)6 33.3 13 7 53.8 500-2000 868 (GAA)5 33.3 21 7 33.3 400-1600 other 873 (GACA)3 50.0 10 4 40.0 750-1500 880 (GGAGA)3 60.0 11 3 27.3 650-1500 合計 174 81 平均 49.2
到174 個條帶，平均每一引子可得到 12.4 個條帶。由此 14 條引子共可增幅 81 個具多型 性條帶；平均一個引子有5.8 個多型性條帶，所得條帶分子量範圍為 300 bp ～ 2100 bp。 再由81 個多型性條帶中選出訊號較強且穩定之 23 個多型性條帶做為分子標誌，可 建立各參試品種（系）之指紋分析資料，其中兩個葉菜用甘藷品種台農71 號及桃園 2 號 具有相同的23 個 ISSR DNA 指紋標誌，顯示其在 ISSR DNA 分子標誌層次不具有差異， 而CYY86-01 為嘉義農試分所新育成品種「台農 72 號」，其指紋資料也已建立完成。利 用此指紋圖譜對待測未知品種之ISSR 分子標誌分析資料結果進行比對，錯誤機率僅為 1/223，因此可望得到優良的品種鑑別效果。
（二）甘藷品種 ISSR DNA 遺傳相似性分析：ISSR 分子標誌所得到之指紋分析資料經由 NT-SYS 利用 Jaccard's coefficient 運算，得到各個品種之間的遺傳距離矩陣（未列出），各樣 品間的遺傳距離介於0% ～ 94.4% 之間，若不包括台農 71 號及桃園 2 號兩個葉菜用品種 間之遺傳距離，則各樣品間遺傳距離範圍為12.5% ～ 94.4%，而台農 67 號與由中國大陸 引進慶仔種之距離高達94.4%。 依據品系間遺傳距離利用UPGMA 進行群聚分析，繪出樹狀分枝圖（圖 1），在遺 傳距離為88%（即相似性為 12%）左右可將參試品種（系）分為兩大群。其中第Ⅰ群主 要為早期自中國大陸引進種原，包括慶仔種、小燈種及廈門種等；及由中國大陸引進種 圖1 利用 23 個 ISSR 分子標誌分析甘藷品種 ( 系 ) 之遺傳歧異性群聚樹狀圖
Fig. 1 Dendrogram of the genetic distance identified with ISSR DNA markers among sweet potato varieties 註：* 表示為民間保持之品種。 1.00 0.800 0.500 0.400 0.200 0.000 遺傳距離 台農71號 桃園2號 桃園紅皮紫心 C82-S59 紅皮紫心 台農10號 紅仁種 沖繩100號 台農10號* 台南17號 桃園1號 慶仔種 小燈種 廈門種 栗紅 高系14號 九州100號 日本金時 Beniazuma 紅肉 農林40號 台農64號* 台農64號 C82-S12 台南18號 白皮紫心 CYY86-01(台農72號) 台農69號 徐藷18號 CY86-S29 台農68號 彰化種 台農62號 台農66號 台農57號 栗子香 台農新31號 台農67號 CYY86-09 台農70號 黃皮紫心 Sasahikari
原經純化或做為雜交親本所選育之品種，包括台農71 號及桃園 2 號兩個葉菜用甘藷品 種、桃園紅皮紫心、紅皮紫心、紅仁種、台農10 號、台南 17 號及桃園 1 號等，其中慶 仔種、小燈種及廈門種等中國大陸品種群聚為一小群；第Ⅱ群主要包括自日本引進之甘 藷品種，及由日本引進種原經純化或以其為雜交親本所選育之品種，其中高系14 號、 九州100 號、日本金時、紅肉、Beniazuma 以及農林 40 號等日本品種群聚為一小群，其 他品種包括台南18 號、白皮紫心、台農 72 號、台農 69 號、徐薯 18 號及試驗品系 CY-86-S29 等則成另一小群，另外台農 70 號、黃皮紫心及 Sasahikari 等 3 個品種自成另一小 群。由圖1 發現包括台農 64 號、台農 66 號、台農 68 號、台農 69 號、台農 70 號、台 農71 號、台農 72 號、桃園 1 號及桃園 2 號等 9 個經由多向雜交育種而來之甘藷品種分 散在樹狀圖之各分群中，顯示由多向雜交而來之甘藷品種之間遺傳變異範圍已經包含不 同國家種原之遺傳背景。另外比較種原庫及民間種植之甘藷品種之分群結果，發現兩個 不同來源之台農64 號品種歸屬於同一小群，具有極高之 ISSR 指紋相似性，但亦顯示保 存種原與民間保存之台農64 號品種間存在變異性，而不同來源之台農 10 號也有類似結 果。 （三）甘藷品種 ISSR 分子標誌之主成份向量分析：將所篩選之23 個 ISSR 分子標誌所得之指 紋資料利用SAS 程式進行主成份向量分析，探討各個分子標誌對甘藷品種之鑑別效果 （未列出），同時以NT-SYS 軟體利用前兩個主成份分析結果繪出各品種之遺傳距離分佈 Prin1 (17.1 %) -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Prin2 (12.0 % ) -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 Taiwan China Japan A C B 圖2 依 ISSR 分子標誌之第一及第二主成份所繪之 41 個甘藷品種 ( 系 ) 遺傳距離分佈圖 Fig. 2 Plot of two principal components from the covariance matrix of the ISSR DNA marker
圖，由圖2 可發現品種分佈大致分為 3 群，其中大部分台灣地區品種分佈於 A 群，由中 國大陸引進之品種集中於B 群，C 群則為日本引進之品種。由主成份特徵向量可知主成 份1 主要依據引子 827 所產生 710 bp 條帶，引子 868 所產生 490 bp 條帶及引子 880 所 產生670 bp 條帶等 3 個分子標誌，主要區分中國大陸品種與非中國大陸品種；而主成 份2 則主要依據引子 841 所產生 1100 bp、引子 834 所產生 1050 bp 條帶及引子 814 所產 生400 bp 條帶等 3 個分子標誌，主要區分台灣品種與引進品種（日本品種及中國大陸品 種）。由主成份1 及主成份 2（共可解釋 29.1% 之變異值）可將參試品種（系）分為兩 群，第1 群位於第一象限及第四象限，即樹狀分枝圖之第Ⅰ群，第 2 群則分佈於第二及 第三象限，為樹狀分枝圖之第Ⅱ群，比較樹狀分枝圖發現兩者之分群結果大致相符。 （四）甘藷品種 ISSR 分子標誌鑑定流程之建立：因此根據主成份分析前兩個主成份中每一 成份之分子標誌鑑別的效果，挑選出效果佳且訊號強之分子標誌來建立品種鑑定流程 圖（圖3），依序將所有參試樣品進行區分。此品種鑑定流程圖共使用 14 個分子標誌 （由880、827、868、841、822 及 864 等 6 條引子所產生），可將台灣現有主要甘藷品種 （系）有效率地區分。 二、甘藷品種內遺傳變異分析 由先前所篩選出可產生多型性條帶之ISSR 引子進行 4 個參試品種內遺傳變異的偵測，結 果如表3 所示，塊根用甘藷品種台農 66 號所篩選的 3180 個分子標誌中，有 30 個分子標誌具 有變異（圖4），佔 0.94%；而桃園 1 號則篩選了 3150 個分子標誌，其中有 41 個具變異的分子 標誌，所佔比例為1.30%；在葉菜用甘藷台農 71 號共篩選 2640 個分子標誌，得到具有變異之 分子標誌49 個，分子標誌變異佔 1.86%；桃園 2 號篩選 3510 個分子標誌，得到 53 個具變異之 分子標誌，佔1.51%，顯示甘藷在進行無性繁殖時容易發生遺傳變異，其 ISSR DNA 分子標誌 之變異率介於0.94% ～ 1.86% 之間。 表3 四個甘藷品種內利用 ISSR 分子標誌所測得之遺傳變異
Table 3. ISSR DNA marker variation within four sweet potato varieties.
葉菜用品種 塊根用品種
台農71 號 桃園2 號 台農66 號 桃園1 號
篩選分子標誌個數 2640 3510 3180 3150
具有變異個數 49 53 30 41
圖 3 依據主成份所建立之甘藷品種 ISSR 分子標誌鑑定流程。 Fig. 3 The dif
討 論
一、甘藷品種間 ISSR DNA 標誌變異分析 （一）甘藷品種ISSR DNA 指紋資料庫之建立 本試驗由100 個 ISSR 核酸引子中篩選得到 14 個訊號較強且具多型性條帶之核酸引子，結 果共得到174 個條帶，其中有 81 個條帶具多型性，平均一個引子可得 5.8 個多型性條帶，多型 性條帶佔全部條帶比例為46.6%。Hu 等人（2003）利用與本試驗相同引子進行種原間 DNA 多 型性分析，得到8 個訊號較強且可產多型性條帶之引子，平均每個引子可得 10 個多型性條帶 （多型性比例為62.2%），較本試驗所得之多型性高。造成多型性比例上的差異原因可能是由於 Hu 等人所使用的材料除了包括日本及菲律賓之甘藷品種外，還包括 I. lacunosa、I. tiliacea、I. trifida 及 I. triloba 等 4 個野生種。Huang 及 Sun 等人（2000）亦利用相同引子對甘藷及其 9 個 野生種進行分析。雖然本研究之單一引子所產生之多型性分子標誌數目相對較少，此結果應與 本研究進行初步篩選之引子數目較多有關。（二）甘藷品種之遺傳相似性分析
Huang 及 Sun（2000）利用 ISSR 分子標誌區分出甘藷及其 9 個野生種，依據栽培種甘藷 與另9 個野生種之間的遺傳相似性支持栽培種甘藷係由 Ipomoea trifida 演化而來之假設。He 等人（1995）利用 DAF（DNA amplification fingerprinting）區別 73 個來自各個國家蒐集之種 圖4 利用 ISSR DNA 分子標誌 UBC841 偵測甘藷品種台農 66 號之體細胞變異
Fig. 4 Somatic variation of sweet potato variety TNG66 detected with ISSR DNA primer UBC 841.
原，由分群結果發現來自台灣及韓國之甘藷種原遺傳相似性較高，而日本與菲律賓甘藷種原之 遺傳相似性較高；而 Dhillonr 及 Ishiki（1999）利用 RAPD 進行 25 個甘藷栽培種及 4 個野生 種之區分，同樣發現來自日本及菲律賓之甘藷栽培種具有較小的遺傳距離；Hu 等人（2003） 利用ISSR 分子標誌在遺傳距離約 35% 處將來自日本的甘藷品種與來自東南亞地區包括菲律 賓、印尼及馬來西亞的甘藷品種分為兩大群，並且能將群內的品種進行區分。本研究利用23 個ISSR 分子標誌對 41 個甘藷品種（系）進行遺傳相似性分析發現各品種（系）平均遺傳距離 為54.9%，此與 Hwang 等人（2002）利用 SSR 分子標誌分析 22 個包括日本、中國大陸及台灣 地區之甘藷品種，所得到各個品種間之平均遺傳距離為35.3% 有明顯差異，造成差異的原因可 能是由於其分析所使用之品種以台灣地區地方種及栽培種為主，來自中國大陸及日本之品種較 少，而本試驗所蒐集之種原較多，遺傳背景較廣，且本試驗所使用之引子及分子標誌係經過初 步篩選而來。由ISSR 分子標誌之第一及第二主成份所繪製之參試甘藷品種（系）之遺傳距離 分佈圖及UPGMA 所得分群圖可看出各品種除了由日本引進之品種間及部分台灣地區品種間之 遺傳距離較小外，其餘台灣地區品種間與中國大陸地區品種間分佈範圍較大。多數台灣地區品 種與由日本引進品種有較小之遺傳距離，而與中國大陸品種有較大之距離，可知若欲擴大台灣 甘藷新品種之遺傳歧異性，可選擇中國大陸之優良種原做為雜交育種之親本。 本試驗之ISSR 分子標誌分析結果可在遺傳距離約 88% 處將參試品種（系）分為兩大群， 由分群圖中可發現中國大陸地區引進之大部分品種及自日本引進之大部分品種分別自成一小 群，顯示由相同國家引進品種之間遺傳距離較小。台灣地區之甘藷品種則因為利用許多由國外 引進之品種進行雜交育種且有不同之育種目標，品種間遺傳變異較大，例如，本試驗顯示自中 國大陸引進之慶仔種與台灣育種之台農67 號有最大之遺傳距離（94.4%），而其中台農 67 號 之 母本（農林17 號）及父本（Centennial）分別來自日本及美國，推測台農 67 號因來自日本及 美國之遺傳組成，而使其與中國大陸品種慶仔種有較大之遺傳距離。本試驗參試品種中，栗子 香及徐藷18 號為由美國引進之優良品種 Nancy Hall（南瑞笤）與沖繩 100 號正反雜交而來， 故分群上歸於第II 群，與中國大陸地區之品種距離較遠，但其共同親本沖繩 100 號歸類於第 I 群，原因可能是因為沖繩100 號為日本早期育成之優良品種，在台灣及中國大陸長期做為育種 材料。Tseng 等人（2002）利用微衛星多型性基因座選擇性擴增分子標誌（Signal Analysis and Machine Perception Laboratory, SAMPL）分析台灣地區之甘藷優良品種的研究中所得到之各個 品種遺傳距離分佈圖中，沖繩100 號之分群結果亦與本試驗一致。本試驗參試之 41 個甘藷品 種（系）中，栗子香、台農57 號及台農 62 號具有一共同父本 Nancy Hall，3 個品種在樹狀分 枝圖上之遺傳距離接近，而徐藷18 號與栗子香之間的遺傳距離則較其他 2 個甘藷品種遠，推 測是由於父母本遺傳物質貢獻程度的不同所致；另外台農17 號分別為台農 62 號及台南 17 號 之父、母本，台南17 號被歸於 I 群，而台農 62 號則歸於 II 群，除了育種目標不同之外，另一 親本之遺傳物質貢獻程度差異也可能為原因之一。參試品種（系）中，台農新31 號為台農 18 號之父本，彰化種為台南17 號之母本，由樹狀分枝圖中觀察發現親本與其雜交後代所選出之 品種之分群關係並不一定接近，推測同樣是由於選拔及育種目標不同造成。另外台農68 號及 彰化種歸於遺傳距離接近的同一小群，此結果與黃等（1999）之結果相同，顯示在多向雜交品
種台農68 號中，彰化種之遺傳物質貢獻程度大。而兩個台灣最近育成之葉菜用甘藷品種台農 71 號及桃園 2 號具有相同的 23 個 ISSR 分子標誌，經查命名資料，台農 71 號為 1992 年自甘藷 多向雜交種子中選出之品系CYY82-L17，而桃園 2 號係 1983 年由多向雜交族群第五世代後裔 中選出（雜糧作物試驗研究年報，1998），由此分子標誌分析結果可知此兩品種很有可能來自 相同營養系。 台灣自1966 年起開始利用多向雜交進行甘藷品種育成，採用親緣關係較遠且開花期一 致之優良品種在隔離地區進行重複多向雜交（王等，1966），至今已育出許多優良品種。黃等 （1999）曾利用 RAPD 分子標誌分析台農 65 號、台農 66 號、台農 68 號、台農 70 號、台農 71 號及桃園2 號等 6 個利用多向雜交育成之甘藷品種，發現經由多向雜交育成之品種大部份分布 於同一群，多向雜交之甘藷品種與台灣地區在來種之遺傳相似性較大，而與日本及中國大陸品 種距離較遠。Tseng 等人（2002）利用 SAMPL 分子標誌分析相同之 6 個多向雜交甘藷品種， 由其樹狀分枝圖以及各品種之遺傳距離分佈圖可發現此6 個甘藷品種相較於日本品種、中國大 陸品種、台灣在來種以及由雜交育成之品種，具有較大的遺傳歧異性。本試驗材料中台農64 號、台農66 號、台農 68 號、台農 69 號、台農 70 號、台農 71 號、桃園 1 號、桃園 2 號與新 育成之台農72 號係選自多向雜交族群，發現除新育成品種台農 72 號與台農 69 號 2 個紅肉品 種分群關係稍接近之外，其餘品種分別散佈在各小群中，由多向雜交品種間之平均遺傳距離為 51.3%，顯示利用多向雜交進行甘藷育種已有良好成效。 甘藷為自交不親和作物，品種間亦有雜交不親和群存在，為甘藷育種上一大阻礙，甘 藷的雜交不親和性除了不利雜交育種工作進行外，同時限制多向雜交之親本族群的選擇。王 （1964）分析 76 個台灣品種（種原）相互雜交結果，區分出 5 個雜交不親和群以及 1 個雜交親 和群，其中A 群主要包括中國大陸引進之品種、台灣當地品種以及菲律賓引進品種，而大部分 美國引進之品種屬於B 群，台農系列品種大部份分布於 D 群，少數屬於 E 群，而 C 群則包括 沖繩100 號、農林 40 號、台農 23 號以及台農 29 號等品種；而 F 群為雜交可稔群，包括有 2 品種及1 品系，Violet Beauty、Albuog 及 C-461，雜交可稔群中的品種（系）與其他 5 群之品種 進行雜交皆可稔。經過多年的雜交育種，現在已難區分各品種所屬之不親和群。在王（1964） 所使用之76 個品種（系）中，本研究僅包含沖繩 100 號（C 群）、農林 40 號（C 群）、台農 10 號（D 群）等 3 個品種，而台農新 31 號（D 群）為台農 31 號發生體細胞變異產生，因此亦可 參照台農31 號之不親和群分類；對照此 4 個品種在雜交不親和性上之分群及本試驗之 ISSR 分 群結果，並無明顯相關性。由於王（1964）所使用之品種（系）至今日仍持續栽培之品種並不 多，但部分為本試驗所使用之材料之親本來源，分析親本所屬之雜交不親和群與其雜交後代之 分群關係，由B 群之 Nancy Hall 雜交後代徐藷 18 號、栗子香、台農 57 號及台農 62 號 4 個品 種，雖遺傳距離接近，但無法確定其雜交不親和群是否與Nancy Hall 有相關性；由王（1964） 所得之分群結果與品種引進地區具有相關性，屬於同一雜交不親和群之甘藷品種大部分來自同 一地區，品種之間遺傳相似性較高，由此趨勢看來，則本研究所得之甘藷品種ISSR 分子標誌 之遺傳相似性分析結果可供甘藷進行雜交育種及多向雜交時親本選擇之參考，但各品種確切所 屬之雜交不親和群仍有待進一步探討。
（三）甘藷品種ISSR 分子標誌之分析流程建立
Hu 等人（2003）使用 ISSR 引子進行甘藷栽培種及其野生種之分子標誌分析，所得可產 生多型性條帶之引子與本研究不完全相同，可知部分引子為品種專一性引子，因此當參試樣品 包含特定品種時，專一性引子才具有多型性表現。黃等人（1999）利用 RAPD 對 22 個甘藷栽 培品種及1 個野生種 Ipomoea triloba 進行分析，發現由 8 條 RAPD 引子產生 11 個對 Ipomoea triloba 具有專一性之分子標誌，由此可將其與甘藷栽培品種進行區分，而其他參試品種也有部 份具有專一性條帶產生，但此專一性條帶僅供鑑別特定物種（species）使用，並無法針對特定 性狀或品種來源進行區分。本試驗僅發現由日本引進之甘藷品種Sasahikari 在 834 引子 1050 bp 的位置出現一專一性條帶，而其餘分子標誌對於各參試品種（系）之區分尚未發現與性狀或種 原等特定條件之相關性。由於甘藷為六倍體之異結合個體（allopolyploidy），為異交作物，基因 組較大且由於其自交不親和的特性，故遺傳歧異性較大，分子標誌分析流程的建立可提供一快 速且有效率之甘藷品種鑑定工具。 二、甘藷品種內 ISSR DNA 標誌變異分析 Sihachakr 等人（1997）發現甘藷利用組織培養進行無性繁殖時，常會引起生長及塊根產量 上的差異；本研究利用ISSR DNA 分子標誌偵測 2 個塊根用甘藷品種台農 66 號、桃園 1 號及 2 個葉菜用甘藷品種台農 71 號及桃園 2 號之品種內的遺傳變異，發現甘藷品種內的 ISSR DNA 分子標誌變異程度介於0.94% ～ 1.86% 之間。而邱（1999）利用 RAPD 分子標誌偵測甘藷品種 台農57 號及台農 66 號在各個不同生育時期品種內之變異程度，發現變異各為 5.7% 及 1.3%， 其中台農66 號品種內之 RAPD 分子標誌變異與本試驗之 ISSR 分子標誌分析結果相近；而台農 57 號品種內變異偏高，但本研究未採用相同品種故無法進一步比較。邱（1999）亦指出隨著甘 藷扦插苗繁殖世代的增加，其塊根及地上部產量會發生減少的情形。由以上研究結果可知甘藷 在進行無性繁殖過程，常會發生DNA 層次之遺傳變異，此遺傳變異可能會影響甘藷在田間生 長及產量上的差異，因此在連續採用同系之甘藷扦插苗繁殖數代後必須以種藷重新育苗以維持 品質（邱，1999）。雖然由體細胞變異亦可供育種家選種時使用，從中挑選表現良好之植株進 行評估，或可為新品種之來源，例如台農新31 號即農民自田間栽培之台農 31 號之芽條突變株 所選出之新品種，然而維持品種之遺傳及外表之均一性為優良品種所需具備之重要條件，而本 研究所採用之ISSR 分子標誌將可提供評估或監控品種內遺傳變異之有效工具。
結 論
本研究以ISSR DNA 分子標誌分析甘藷之遺傳變異，發現台灣所收集甘藷種原已具有較 大之遺傳變異（種原間之遺傳距離介於12.5% ～ 94.4%），其中新育成品種及地方品種間之遺 傳距離為51.9%，尤其利用多向雜交族群所選育之新品種分散在各個樹狀圖分群中。各別分析 兩個塊根用甘藷品種及兩個葉菜用甘藷品種內之分子標誌變異，分別介於0.94% ～ 1.30% 及 1.51% ～ 1.86%，顯示品種在無性繁殖過程容易產生遺傳變異。本研究亦建立新品種台農 72 號 及其他台灣重要栽培品種之DNA 指紋，並且推薦一套品種鑑別流程，供未來應用。誌 謝
本研究承蒙行政院農委會農糧署補助計畫經費（計畫編號92 農科 -1.1.1 糧 Z2（4）及 93 農科-1.1.1 糧 Z2（4）），特此致謝。參考文獻
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Variation in ISSR DNA markers among varieties of sweet
potato (Ipomoea batatas L.) cultivated in Taiwan
Ching-Hua Chien
(1)Yung-Chang Lai
(2)Yi-Sin Chen
(3)Shun-Fu Lin
(4)*Abstract
To evaluate the genetic diversity of sweet potato varieties collected in Taiwan, ISSR DNA mark-ers were applied in this study. Eighty-one informative markmark-ers detecting differences among varieties were proposed after the screen of 100 primers. And 23 out of these markers with strong and stable bands were used to establish DNA fingerprints of each variety and to evaluate the genetic diversity among germplasm. Results of genetic similarity analysis revealed the genetic distance among variet-ies ranged from 12.5 % to 94.4 %, and the average distance was 54.9 %. The new varietvariet-ies selected from polycross populations were distiribtued in different groups of cluster analysis indicating the wide diversity among the varieties. However, large genetic distance between varieties developed in Taiwan and germplasm introduced from China was observed both in cluster analysis and principal component coordinate analysis suggesting the potential uses of China germplasm as breeding parents in the future. In addition, an effective scheme, employing 6 primers to amplify 14 polymorphic mark-ers, for variety identification was proposed. To detect somatic variation that resulted from vegetative propagation, individual plants from 2 varieties (TNG 66 and TAY 1) for tube production and 2 (TNG 71 and TAY 2) for leaf production were tested with ISSR markers. About 0.94 % ～1.86 % of ISSR DNA variation for each variety was detected from 2640～3510 surveyed markers. The DNA finger-prints developed in this study would provide information for variety identification, clonal propaga-tion, and genetic improvement of sweet potato.
Keyword: Sweet potato, Molecular marker, Variety identification
(1) Master Student, Department of Agronomy, National Taiwan University.
(2)Head, Department of Agronomy, Chia-Yi Branch Station of Taiwan Agriculture Research Institute. (3) Former Head, Department of Agronomy, Chia-Yi Branch Station of Taiwan Agriculture Research
Institute.
(4)Assistant Professor, Department of Agronomy, National Taiwan University. *Corresponding author
