中山醫學院營養科學研究所碩士論文

中山醫學院營養科學研究所碩士論文

指導教授:徐成金 ^博士

生羊乳與鮮羊乳蛋白質之成份分析

The analysis of the composition of protein the raw and fresh goat milk

研究生:許哲誌

中華民閻八十六年六月

授權書

(博碩士論文)

本授權書所授權之論文為本人在中山醫學院 營養科學研究所

…一一一一一一組的學年度第 2 學期所撰碩士學位論文 o 論文名稱:生羊乳與鮮羊乳蛋白質之成份分析

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本人具有著作財產權之論文提耍，授予閻家屬書館、本人畢業學校及行政院 國家科學委員會科學技街資料中心，得重製成電子資料擋後怯錄於該單位之 網路，並與台灣學術網路及科技網路連線，得不 Ftt 地域自等問與次數，以光碟 或紙本重製發行 o

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上述授權內容均無須訂立讓與及授權獎約書 D 依本授權之發行權為非專屬性發行 權利 o 依本授權所為之收錄、重製、發行及學術研發利用均為無償 O

指導教授姓名:徐成金

研究生簽名:益盟主任學號:的4303

(親筆正楷)

日期:民國一皇五年_+_

^fJ

_{[日

備諱1.上述向意與不同意之攤位若未勾退，本人同意視同授權。

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5. 本案聯絡電話 (02)7377746 江守田、王淑貞 地址:台北市和平泉路二段 106 號 17 樓 1702 室

研究生姓名 :1Al怯生聯絡電話 :iMIMK

地址:且對任室主說且也一位-~~1~吽豆豆一一一一一一一一一

本論文為中山醫學院授與理學院碩士學位之必備條件之一

，經中山醫學院營養科學研究所碩士論文考試委員會審查

合格及口試通過。

口試委員

私立中山醫學院生化科教授

私立靜宜大學食品營養系教授

私立中山醫學院營養科學所教授

(論文指導教授)

蕭松瑞博士

/事 h 吟

王銘富博士

玄多毒品

徐成金博士

f家戒全

中華民國八十六年七月三日

學生許哲誌論文題目為生羊乳與鮮羊乳蛋白質成份分析，其論文

已經中山醫學院營養科學研究所碩士論文考試委員會審查合格及 口試通過，並由其指導教授核閱後無誤。

指導教授:徐成金博士

中華民國八十六年七月

立 全士

口增1 日J (J、

感謝益處鑫教授的悉心指導，無論在課業、實驗研究或 日常待人處事上，皆受益良多。本論文復蒙徐老師多次詳加 閱改，始得以順利完成付梓，感謝之意，難以言表。文稿初 成，並蒙主鎧軍博士和靈訟還博士於百忙之中，撥冗耐心審 閱，指正疏漏之處，並提供諸多寶貴意見，使本論文更臻完 整，謹於此致衷心之謝忱。

實驗期間，感謝遲農遨學長不吝賜教，給予技術指導，

並在結果討論中，提供寶貴意見，使本實驗得以順利完成。

另外，兩年來向學問彼此幫助與相互學習，也使我成長不

少。鐘之豆、裂藍、盤主、盤君主、童畫豆、瓷笠、半逾及學弟1昆 主、坦室主的協助與支持，在枯燥的實驗中帶來歡樂;還有起 鐘溫馨的陪伴，都將成為我求學過程中，最珍貴的回憶。

最後感謝我的祖父母、父母親、妹妹、及其他朋友們的 精神支持，在挫折待所給予的鼓勵及包容，謹將此論文獻給

你們。

摘要.......

緒論

材料與方法

百 多余

質次

5

一、羊乳的來源...... ... ... ... ... ... 14

二、生鮮半乳中總、蛋白質和總含氮最差異比較... 14

三、生鮮羊乳中蛋白質成份差異比較...... ... ... ... ... ... ... ... 的 四、免疫球蛋白 G 和自蛋白的純化...... 16

五、抗體的製作..，... 六、生鮮羊乳中免疫球蛋白與自蛋白的測定... 19

七、熱處理對生羊乳中免疫球蛋白及白蛋白的影響....., 22

結果

一、生鮮羊乳中總、蛋白質量和總含氮蠱的差異...... 24

二、生鮮羊乳中蛋白質成分的差異... ... ... 24

三、免疫球蛋白 G 的純化與抗體的製作.，. ... .., 25

四、生鮮羊乳中免疫球蛋白含量及總蛋白的變化..，... 27

五、羊乳漿白蛋白的純化及抗體的製作...... ... 29

六、生鮮羊乳中蛋自含蜜的變化.....

七、熱處理對羊乳中免疫球蛋白和白蛋白的影響......

討論 圖表.. . . .

30 31

33 38

摘要

本實驗目的在探討生羊乳與鮮羊乳中的免疫球蛋白和 自蛋白含量的差異，並探討熱處理對羊乳中免疫球蛋白和 自蛋白的影響。在研究中，首先將生羊乳中免疫球蛋白和 自蛋白純化出，經出對動物的免疫製得抗血淆，經過更進 一步的純化抗體後，薄利用三明治型的酵素連結免疫吸附

分析法來偵測生、鮮羊乳中免疫球蛋白和自蛋白含量之變 化情形。結果顯示，生羊乳中的免疫球蛋白和自蛋白含量 皆高於鮮半乳。另外，比較各廠牌的鮮羊乳，發現以 UHT 加熱模式製得的鮮羊乳，其所含的免疫球蛋白最高於以傳 統緩慢持續加熱所製得的鮮羊乳，而自蛋白方函，結果與 免疫球蛋白相似，僅有…家鮮羊乳的白蛋白較高立接近羊 奶粉的含量。

由於台灣氣候溫熱潮濕，乳品工廠多經由超高溫滅菌

法 (Ultra-high temperature pasteurization ; UHT) 處理，而 此加熱處理方式，是否會造成鮮羊乳中的免疫球蛋白和自 蛋白含量降低?降低的幅度有多大?有深入研究的必要，故

將生羊乳以 120⁰C 加熱 5 、 10 、 20 、 30 、的秒及 1 分鐘，

另模擬緩慢持續加熱模式，以探討兩種加熱方法對羊乳中 的免疫球蛋白和自蛋白含蠢的影響。結果顯示:免疫球蛋 白方菌，以緩慢持續加熱模式在 60⁰C 己破壞 75% '在 80⁰C

則減少至 20ug/ml ' 但以 UHT 加熱模式免疫球蛋白在 120

Oc

10 秒，僅有 11% 被破壞，一直要到一分鐘後才會降至 20ug/ml 以下;而在自蛋白方面，以緩慢持續加熱模式在

80⁰C 己減少至 80ug/ml ' 而以 UHT 加熱方式 120⁰C 一分 鐘，含量依舊有 260ug/ml ⁰

另外本研究發現，有些廠牌其鮮羊乳的總、蛋白靈和總 含氮蠹有較高的現象，究竟是這些廠商在製造過程中攪雜 其他物質或是在加工上有特殊不同之處，有待更進一步探 討。

Abstract

The objectives of this study are to investigate the dif- ferences of the level of immunoglobulin and albumin in the raw and fresh goat milk , and the effect of heat treatments on them. In the study , the goat immunoglobulin G and al- bumin of raw milk were first purified . By immunizing the animals with goat immunoglobulin G and albumin , the anti都

serum was prepared. After further purification, the technol- ogy sandwich ELISA was conducted to analyze and observe the changes of the immunoglobulin G and albumin in the raw and fresh goat milk. The result showed the concentra- tions of immunoglobulin and albumin in the raw goat milk were higher than the fresh goat milk. The immunoglobulin G and albumin in the fresh goat milk of served commercial brands were compared. The result indicated that the heat treatment with ult間-high temperature (UHT) pasteurization would preserve higher concentrations immunoglobulin G and albumin than the traditional dilatory heat treatrnent .

Because of the lukewarrn and rnoist clirnate in Taiwan,

it is necessary for the processers to adopt the UHT pasteur-

ization treatment in milk is. Dose the concentration of im- munoglobulin G and albumin of the milk decrease in the UHT processing? Therefore,the following experimentwas con- ducted to investigate the effect of heat treatment. The raw milk is simulated to heat of 120.C for 5, 10, 20, 30, 45 sec- onds and 1 minute. In addition, the dilatory heat treatment was simulated. The result showed that^, with dilatory heat treatment^, 75% of the concentration of immunoglobulin was destroyed at the 60

Oc

30 min ^,and the concentration was reduced to 20ug/ml at the 80 .C 30 min. But in the UHT heat mode ,only 11 % of the concentration of immunoglobulin was destroyed , and the concentration was reduced to 20ug/

ml at the 120

Oc

1min .As to albumin, the concentration of albumin was reduced to 80ug/ml at the 80

Oc

30 min wÌth dilatory heat treatme叭， while a concentration of 260ug/ml was found with the UHT heat treatment.

This study also found that some fresh milk contained higher doses of protein and nitrogen .Therefore^, further in- vestigation is needed to decide whether it is caused by adul- teration or any special treatment in the processing.

壹、緒論

乳的營養在人類漫長的飲食歷史上，已被證實為一種 幾近完美的食品，自古即被人們飲用。乳中含有各種營養 素，水是其中的主要成份，佔蠶蠱的 80% '溶有乳糖、水 溶佐維生素，而脂肪、蛋白質、礦物質亦懸浮其中，乳中 蛋白質的生物價寓，為一優良蛋白質，其中五分之四由酪 蛋白組成，其餘為事L 清蛋白質。

近年來，由於食品市場對羊乳的強力推廣，使本省飲 用羊乳的人口逐漸增加，但對羊乳確實的組成及營餐價值 卻不甚清楚，因此，有必要對羊乳作更進一步介紹。以往 有關羊乳的研究不多，加上乳羊的品種、個體差異、飼養 條件及分析上的技衛，使得各研究結果間有相當大的差 異，儘管如此，綜合過去的文獻，將羊乳與牛乳進行比 較，仍可窺探出羊乳幾偶特點。

一、蛋白質

羊乳中的蛋白質含蠶和牛乳相似，主要的蛋白質均為 α 甸乳白蛋白 (a -lactalbumin) 、戶-乳球蛋白( ß 也 lactoglobulin) 及酪蛋白 (casein) 等 (1 ，2) 此外尚有非蛋白 態氮 (non-protein-nitrogen ; NPN) ，羊乳中約含有 0.53-

0.75% 總氮盞，其中酪蛋白氮最佔 0.36-0.53% '乳清蛋白 氮蠹佔 0.11-0.17% '非蛋白態氮氮暈佔 0.042-0.044%

(3,4) ，一般羊乳及牛乳之總、氮量約為人乳的三倍，但人乳中

乳白蛋白及乳球蛋白含量較高，而酪蛋白含量較低。曾有 研究指出，羊乳中所含非蛋白態氮顯著商於牛乳，而商量 的非蛋白態氮可能有助於嬰兒消化道中共生菌 (Symbiotic bacteria) 的發育 (5)

1.酪蛋白 (casein)

羊乳的酪蛋白含量較牛乳低，尤其 αl-casein 在羊乳中 含量相當少 (1 ，6) ，學者認為 αl-casein 是牛乳中的特異性抗 原，可能是引起"乳過敏症" (Milka11ergy) 的問子(7)。另 有報告亦指出對牛乳敏感的嬰兒約有 113 可忍受羊乳，可能

是因為羊乳中僅含有微量的 αfcasein ，使得羊乳遇酸形成 之凝乳塊張力小，軟荷易碎，易被消化，而降低羊乳對過

敏症的發生 (1)

p 馳casem 是羊乳的主要蛋白質，可分離出 ß -casein

1

及 II '主要差異為一含有 5 個磷酸蠶基，另一含有 6 個磷 酸鹽基 (8) 在低溫時戶 -casein '易自酪蛋白微球中分離 出。羊乳中 K-casein 的胺基酸組成也不向於牛乳，真有 171

個胺基酸殘基， Valine 及 Histdine 插入 132 及 133 的位置 上，但問於牛乳是Phenylalanine 位於 105 位置上及Methion­

ine 位於 106 位蠶上，而凝乳酵素 (Renin) 自此二殘基開水

解此分子，產生副 k 個酪蛋白 (para- k -casein) 及糖E 姓

(glycomacropeptide) (1， 9) 。

2. 乳清蛋白質

羊乳經加酸至 pH4.6 或加入凝乳酵素 (Renin) 以去除 酪蛋白，所剩下之半透明、淡黃色的液體，稱之為乳清

(Whey ; milk serum) 。乳清蛋白質約占總蛋白的 20 % '

其中 70倫 80% 由戶乳球蛋白(

ß

-lactoglobulin) 及 α 乳白蛋 白(自 -lactoalbumin) 構成，剩下部分則包括乳漿自蛋白

(Serum albumin) 、免疫球蛋白 (Immunoglobulin) 、 Pr心

teose pepto的、微蠱蛋白質，如 Lactoferrin 和部分羊乳韓

素 (3)

羊乳中戶也乳球蛋白(

ß

-lactoglobulin) 含量約 2 .4mg/

ml (1⁰⁾ ，由 162 倍胺基酸殘基的 peptide 組成，與牛乳比較 有 6 個部位胺基酸殘基本閱(1， 11)αa 乳白蛋白 (α “

lactoalbumin) 含量約為 2.20mg/剖，其胺基酸與牛乳比較 約有 12 個序列不同(口， 13) 。一般而言，牛乳與羊乳蛋白質最 大的差異，並非化學組成，而是其凝乳的物理特性。

凝乳張力

凝乳張力愈小，凝乳製品愈軟且愈易消化。經由 Hill's curdometer 等儀器澱定凝乳的軟硬度，發現牛乳的平均張 力為 70g ，羊乳為 36g ⁰

由於羊乳的凝乳製品，外觀細緻、溶解力佳，尤其較 細緻的凝乳，增加了酵素作用的表面積，這亦是導致羊乳 較易消化的原因之一 (5)

二、脂肪

羊乳的脂質以微緝的乳濁狀態分散於乳汁中，其含有 學富的脂肪酸、磷脂質和指溶佐維生素。

1.脂肪含量

羊乳、牛乳和人乳的脂肪含撞分別為 4.5% 、 3.7% 及

3.0%(5) ，由於羊乳含較高的脂肪'所以相同體積下，羊乳

含有較高的能量。

2. 脂肪酸組成

羊乳的脂肪酸比例與牛乳不同，但其組成與牛乳相 似，羊乳中 C6:0 、 C8:0 及 CI0:0 的短鏈飽合脂肪酸含 量較牛乳寓，基於提供較簡單的構造單位給嬰、幼兒和 腸、胃病弱者消化利用的觀點而言，羊乳脂肪具有較佳之 消化率及利用牲口， 5) 。羊乳中三個揮發性脂肪喜愛，以 C 凹 的葵酸 (capric acid CI0 : 0) 含量最多，約為牛乳的三倍，

導致羊乳具有特殊羊臭味 (goaty odor) (5) 。另外，羊乳含 有較牛乳多蠱的必需脂肪酸及中、經鏈脂肪酸。

3. 脂肪球

牛乳脂肪球直徑約為 2.5"'-' 3.5 u (1 u=O.∞ lmm) 羊乳約為 2 u '郎牛乳之脂肪球髏積大小約為羊乳的 2-4 倍，所以羊乳較易被消化吸收 (5) 。但曾有報告指出將牛乳 均質化使脂肪球變小，仍未使其容易消化，可能是因為脂 肪球膜受腸內膽汁溶解程度不同所致 (1) ，另有學者發現羊 乳的冷卻脂肪球不會像牛乳造成凝眾 (Cluster) 現象，因為

缺乏牛乳所含有的凝集素 (Agglutinin) ，以致於羊乳的乳 泊形成比牛乳慢且不完全等差異(1，凹，均顯示羊乳對嬰幼 兒有較佳的消化率。

一、碳水化合物

乳品中主要的碳水化合物為乳糖，乳糖不耐症者，囡 缺乏乳糖分解酵素，使得無法吸收的乳糖，黨支集在小腸中

引起發酵'造成腹漲、絞痛和腹瀉等症狀。羊乳中的乳糖 含量較牛乳低，可減輕乳糖不耐症者，囡高乳糖所導致的 消化干擾現象。另外，羊乳中含有與蛋白質結合之復合體 或粘多糖 (mucopolysaccharide) ，其含暈依動物的種類而 有差異，如 N 甜的 etyl glucosamine ' N-acetyl galactosamine ' sialic acid 及 inositol 等 (5) 。

四、礦物質

羊乳中礦物質主要為鈣、磷、金美、氯、銷、重申及鐵 等，此外尚有微麗的話、鐘、鋁、鈴及碘等，其含蠶及各 成份比例會隨泌乳期、飼料及健康情形而異 (5)

羊乳的鈣含蠶較牛乳寓，鈣質為幼兒骨路和牙齒發育 所必須，事L 齒根約在胎兒發育三個月變關始發生，而永久 齒亦在出生前已就續;當產後婦女開始泌乳，鈣質會隨之 流失，而羊乳的飲用能同時補充鈣質和蛋白質量，更能預

防骨質疏鬆症。而對於老年人來說， OJ3.嚼能力較差，液態 的羊乳比其它的食物如魚乾等，不僅容易攝取，也能降低 攝取食蟬的攝取量(1 6) 。且羊乳中 P

2

⁰

5

/CaO 的比值較高，

此特性使羊乳具有較佳的緩衛能力 (Buffer ability) (17) 。另 外羊乳中含有高蠱的奸和氯，高蠱的氯可以加速凝乳的形 成，改良凝乳的品質 (5) ，而羊乳中鐵質含蠶較少，故哺育 新生兒必需注意鐵質的補充，以避免貧血。微覺元素含量 方面亦會受到日纜、泌乳期等茵素的影響，且會受到加熱 殺菌處理的破壞(1， 18)

五、維生素

羊乳中有足夠人類嬰兒所需的 Vit A (Retinol) 、 Vit

B 1 (Thiamin) 、 V it B 2 (Riboflavin) 、菸鹼酸 (Niacin)

Vit D 、 Vit B 12 (Cyanocobalamin) 、批移醇 (Pyridorine) 及葉酸鹽(Floate) 等。

一般在羊乳中胡蘿蔔素含蠹甚少，因為乳羊的甲狀腺 較大，活性佳，乳羊將胡蘿蔔素轉變成維生素 A 的比率較 高，所以羊乳可提供較豐富的維生素 A 0 另外羊乳中葉酸

鹽 (Floate) 含量約為牛乳、人乳的1/ 10 因此完全哺育 山芋乳的嬰兒會因葉酸不足而患有 H 山羊乳貧血症" (Goat milk anemia) (1 8) 。

六、免疫球蛋白 (Immunoglobulin)

羊乳裡免疫球蛋白約佔乳清蛋白質的 10% '在初乳中 則含有的 -26% '對反多革新生動物荷言，其消化道可吸收乳 汁中的免疫球蛋白，使其較不易受感染。

免疫球蛋白是血一群基本構造相似和具有不同抗原結

合位置 (antigenic determinants) 及生理活性之蛋白質所構 成。其基本構造都是由兩條蠶鍵(分子最約 50-70KD) 與 兩條輕鏈(分子最約 20KD) ，以雙硫鍵互相鍵結而成。根 據其重鏈結構可分成五大類: IgG 、 IgA 、 IgM 、 IgD 、

IgE '存在於血清與體液中，在人與牛羊的血清中主要以 IgG 存在，但在乳汁中組成則有差異;人乳中以 IgA 為主

( 19) 牛羊乳中則以 IgG 佔大部分;牛羊乳中已知有三種兔

疫球蛋白 IgG (IgG 1 、 IgG II ) (20) 、 IgA 及 IgM 。羊血清 中 IgG 1 與 IgG II 含量棺似，但在羊乳中， IgG 1 白血清 選擇性移轉而來，估了初乳乳清蛋白的 50% '而 IgG II 則 問持存在於初乳與常乳中，以帶有 2-4% 的醋類單元體 (monomer) 存在。

七、血清白蛋白

乳漿白蛋白約佔羊乳乳清蛋白質之 5% '此蛋白質之

化學組成、分子暈、電泳移動度、免疫學性質以及其他許 多性質均與血清白蛋白一致，因此，其被認為自血液中的 血清白蛋白移至乳汁中 (21) 。

血清白蛋白由單一條peptide 所組成，牛的自蛋白分子 量約為 66.7KD '帶有分子內雙硫鍵，等電點 pH4.7 '帶負 電，使其更容易與陰離子基質如 Dietheylaminoethyl cellu-

lose 緊密結合，另外，自蛋白亦可被不同的非極性 Ligand

如 Palmitate 、 Dextran-dye complex 等所吸引，利用降低 pH值或增加鹽離子濃度，可將白蛋白白陰離子基質沖出。

白蛋白是少數具有 SH 義的細胞外蛋白質 (22) , SH 基 經由 Thiol-disulfate exchange 的機制，可去除 Hg詐和運送 難溶的二硫化物。對新生兒來說，乳中的自蛋白最叢耍的

特性是能與 Bilirubin 結合，以防止血液中有太多游離態的 Bilirubin 時，造成對腦的傷害 (23) 。

本研究為探討生羊乳與鮮羊乳中蛋白質的差異，並期 望能尋得一值可作為鮮羊乳純度指標的蛋白質，擬以不同

飽合度的硫酸餃 (Ammonium sulfate) 加以沉澱，再進行

SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 電 泳分析，比較生、鮮羊乳中蛋白質的差異。另外，羊乳的 產量及成分會受到氣候、季節和飼料等因素影響，因此本

實驗將取四季的羊乳進行分析，並針對生羊乳製成鮮羊乳 的一連串加工過程是否會對其免疫球蛋白及白蛋白有所影 響進行探討。

貳、材料與方法

一、羊乳的來源

生乳分別取自於臺灣省嘉南羊乳連鎖合作社、草屯明 慈羊乳廠和冠欣食品股份有限公司。鮮乳分別取自嘉南鮮

羊乳、明慈、鮮羊乳、冠欣鮮羊乳、高屏鮮羊乳、第一鮮羊

乳、康泉鮮羊乳、吉祥鮮羊乳、嘉南保久羊乳、三多羊奶 粉。

二、生鮮羊乳中總蛋白質和總含氮量差異比較

1.總、蛋白質蠱的認定

將生、鮮羊乳以 0.01 M PBS (pH7 .4)稀釋 30 倍，另 以 Bovine serum albumin (BSA) 當標準液配製成 0.2mg/ml ，

0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 1. 5 mg/ml '以 Kenolor Total protein

Assay syatem 分析出樣品的總蛋白質量。

2. 總氮 (Total nitrogen) 定蠶法 (24)

取樣品 1ml 豎於分解瓶 (Kjeldahl digestion flesk)

↓加入 25ml 濃硫酸和 5ml H

2

⁰

2

充分振盪分解瓶，使示樣

分解均勻。

↓連結分解瓶及預先加熱燒瓶，使水蒸氣緩慢發生。

↓將 30% NaOH 30ml 緩慢注入分解瓶。

↓三角瓶受器加入 0.1 NH₂S0₄ 25ml '並加入 2-3 滴指示劑 (A 液 methyl red 0.1 g+methylene blue O. 的 z 溶解於 95% 酒精 40 ml) ，冷凝管的前端必需浸於受器內，以 完全吸坎所產生的氮。

↓當蒸餾至規定酸液達三倍量即可認定完全蒸餾。

↓以 0.1 N NaOH 漓定更受器中溶液顏色是灰色為止，那

知道中和的規定酸液容桶。

三、生鮮羊乳中蛋白質成份差異比較

分別取 20 毫升的生、鮮羊乳，以 0.01 M phosphate buffer saline (PBS; pH7.4) ，五倍稀釋。

↓經 4

⁰

C 下以 4000rpm 離心的分鐘 (Himac

CR15D '

Hitachi) ，去除脂肪後，將羊乳罩於冰浴中，持續而緩

慢地加入結晶型的硫酸餃 (Ammonium Sulfate ; Merck)

，使溶液中硫酸鎖濃度緩慢增加至終濃度為 50% 飽和程 度。

↓持續攪拌 10 分鐘後，靜堂的分鐘。

↓ 4

⁰

C 下以 4000rpm 離心 15 分鐘，取蛋白沉澱物。

↓上清波經定量後，還復上述步驟，分別得到 0-50% 及 50-

的%飽和度的硫酸餃沉澱物。

↓將得到的蛋白質沉澱，以少寰的去離子水溶解後，蠶於 透析膜，於 4 ⁰C 下以 O.lMTris-HCl pH7.4 (Sigma) 透析 數次。

↓將透析後的溶液以冷凍乾燥機濃縮。

↓以 Kenlor Total Protein Assay System 定出各劃分之總蛋 自量。

↓以 O.OlM PBS (pH7 .4)稀釋各懿分之蛋白液成均一濃 度，再利用 Laemmli 所發展的方法 (25) 進行 SDS­

PAGE (Mini-protein 立， Bio-Rad) 電泳分析，以 0.1%

Coomassie bl ue (Merck) 染色，經脫色後觀察各劃分中 生、鮮羊乳蛋白質成分的差異。

的、免疫Iì1蛋白 G 和自蛋白的純化

1.免疫球蛋白 G 的純化

將生羊乳一倍析釋，加入 25% 醋酸，於 70^CC 水浴放置 20 分鐘。

↓ 4 ⁰C 下， 3000rpm 離心 10 分鐘，除去羊乳中佔大部份的 酪蛋白 (Casein) ，取上清液進行。-50% 硫酸餃沉澱，

經離心取沉澱物，以去離子水溶解後，蠶於透析膜內以

O.lM Tris-HCl 透析數次。

↓取透析後的蛋白溶液，通過 Sephadex G-200 管柱

(90cml2.2cm ; Bio-Rad) ，首先以 50mM Tris-HCl pH7.5

沖洗管柱，再以含 0.1M 食盤濃度的緩衝液沖洗，同時

以自動收集器 (SF-1602 ， Toyo) 收集，以分光光度計

(Model 7800 UV/VIS Spectrophotometer ' Jasco) 在 280 nm 下測吸光，進行 SDS-PAGE 電泳分析，找出有免疫 球蛋白 G 的劃分液。

↓將帶有免疫球蛋白 G 的分液經凍乾後，利用離子交換樹 脂層析法 (Ion-exchangechromatography) ，通過 DEA巳

Sephaceal (phamacia) 管柱，同時利用自動收集器收集

第一值吸收峰(不滯留於管校的劃分) ，以分光光度計 在 280 nm 下測蠶吸光，並進行 SDS-PAGE 電泳分析。

↓經由上述步驟確認後，將帶有免疫球蛋白 G 的劃分液混 合，經凍乾後，以 FPLC (gel filtration ; phamacia) 再 次精製。

2. 自蛋白的純化

將(1)通過 Sephadex G-200 管柱的蛋白液，經 SDS 嘲 PAGE 分析後，取帶有 Albumin 的蛋白觀分液混合，濃縮 後通過 DEAE-Sephaceal 管桂，以 0.05 M Tris-HCl 平衡管 柱，再以含 0.3 M 及 1M 食躍的援衝液沖洗，瀏吸光值並 進行 SDS-PAGE 電泳分析。

↓蛋白分液經透析後，通過 Blue Sephadex (Phamacia) 管 柱，收集所沖出的蛋白質，瀏吸光並進行 SDS-PAGE電 泳分析。

↓將帶有自蛋白的劃分液混合，經凍乾後，以 FPLC (gel

filtration) 再次精製。

五、抗體的製作

將純化後的免疫球蛋白 G 溶液和岱蛋白溶液分別與

Freund,s complete adjuvant (Difco) 等量混合形成乳濁液，

對兔子及小白鼠進行皮下注射，反覆隔週注射，並採血以 雙向免疫擴散法 (double diffusion) ⁽²⁶⁾ 及免疫電泳

(immunoelectrophoresis) (27) 來確定抗體的產生及抗血清是 否具有單一特異性 (Mono-specific) ，經再次追加注射免 疫，於一周後將兔子及小白鼠犧牲、採血，所得到的血液 與 Sodium citrate (5 mg/ml )混合，於 4 Oc 下以 3000 rpm

離心取血漿，加入 CaC1

2 ^及

^{Thrombin (Sigma) ，攪拌去除}

血中的 fibrin '得到抗血清，之後再以 direct ELISA 法測 定出小白鼠 antiserum 的效價。

另外，將所得到的兔子抗羊免疫球蛋白和自蛋白抗血 清以 33% 的硫酸按將抗血清中 IgG 沉澱，以 FPLC (gel

filtration) 精製。

六、生鮮羊乳中免疫球蛋白與白蛋白的測定

1.標準檢量線的湖定

將純化出的免疫球蛋白 G 製成濃度為 10峙， 5 峙，

1 呵， 500 時， 100 時，幼時， 10 時， 5 ng/ml 的標 準溶液，以 Sandwich ELISA 法分析，繪製溶液與吸光值 的標準檢最線圈。

2. 免疫球蛋白的湖定

96 孔的微量分析盤 (Nunc) 每孔注入以 Coating

buffer 稀釋濃度為 16μ g/ml 的兔子抗羊乳免疫球蛋白抗 體 100泣，置於 37⁰C 的培養箱內隔夜培養，使抗體耐著於 分析盤上。

↓以 10

mM PBS (0.1 %

Tween-20) 清洗三次。

↓加入 2%

gelatin 200 ullwell

'以蓋滿未接滿抗體之空

位，遮光培養兩小時。

↓以 10

mM PBS (0.1 %

Tween-20) 清洗三次。

↓加入 1000 倍稀釋的生羊乳、 10 f音稀釋的鮮羊乳、保久

羊乳、王多羊奶及標準液 100ul '在室溫下振盪混和 30

分鐘。

↓以 10 mM PBS (0.1 % Tween嘲 20) 清洗三次。

↓加入 5000 倍稀釋的 Rabbit anti-goat IgG (whole molecular) Horseradish peroxidase conjugated (Sigma)

↓以 10

mM PBS (0.1 %

Tween-20) 清洗三次。

↓加入發色劑

A 液 11ul 35% H₂0₂ /9.9 ml H₂0

B 液 11

mg 0 - phenyldiamine (Sigma) / l.1ml

metha盼

nol (Merck)

用前將 A 、 B 液混合，每孔注入 100泣，遮光靜置培養

30 分鐘。

↓每孔注入 100ull N H 2 ^S0 4 ^{終止發色反應，以 96 孔用酵}

素免疫分析閱讀儀(L:

960 '

Metertech) 於 490 nm 下

判讀吸光值。

3. 白蛋白的湖定

取 96 孔的微量分析盤，每孔注入 100 ul 的兔子抗羊

乳白蛋白抗血清 (1 6 ug/ml ' 蠶於 37 ⁰C 培養箱內，遮光

楠夜培養問定)

• 10 mM PBS (0.1 % Tween-20) 清洗三次。

↓加入 0.1% gelatin 200 ul ' 培養 2 小時，以蓋滿所有的 空位。

• 10 mM PB S (0.1 %

Tween-20) 清洗三次。

↓加入 1000 倍稀釋的生羊乳、 10 倍稀釋的鮮羊乳、保久 羊乳、三多羊奶及標準液 100ul ' 在室溫下振盪混和 30

分鐘。

• 10 mM PBS (0.1%

Tween-20) 清洗三次。

↓加入400倍稀釋的小白鼠抗羊乳白蛋白抗血清 100ul/well 在室溫下混合 30 分鐘。

• 10 mM PB S (0.1 %

Tween-20) 清洗三次。

↓加入 1500 倍稀釋的 Goat anti-mice IgG Horseradish p哎喲

oxidase conjugated (BioRad)

• 10 mM PB S (0.1 %

Tween-20) 清洗三次。

↓加入發色劑

A 液 llul 35% H₂0₂ /9.9ml H₂0

B 液 11 mg 0 - phenyldiamine / 1.lml methanol 用前 將 A 、 B 液混合，每孔注入 100ul ' 遮光靜置培 養 30 分鐘。

↓加入 100ul 、 1N H 2 ^S0 4 終止發色反應，於 490 nm 下湖

吸光。

七、熱處理對生羊乳中免疫球蛋白及白蛋白的影響

1.模擬 B 廠牌加熱方式

將生羊乳罩於40⁰C 下加熱 30分鐘後，將向…樣品繼續 提高溫度，於不同的溫度及持續加熱時問下 (60⁰C 加熱 30

分鐘、 80⁰C 加熱 30 分鐘、 100⁰C 加熱 30 秒、 120⁰C 加熱 30 秒) ，再以 ELISA 法測讓其中免疫球蛋白及白蛋白變化的

情形。

2. 模擬 UHT 加熱方式

將生羊乳以 62⁰C 泊浴 5 分鐘，在靜蠶於 120⁰C 中 5 秒， 10 秒， 20 秒、 30 秒、“秒及 1 分鐘，取出後快速冷 卻，分別取出樣品進行分析。

3. Western blot analysis

敢上述樣品，經統一蛋白量後，進行 12% 電泳膠片濃 度的 SDS-PAGE 分析電泳膠片上的蛋白質，以 Kyhse­

Anderson 等人在 1984 年所發展的方法，進行 Semi-dry

blotting ^{(28) 0} Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell (Bio喲Rad) 以 14V ' current limit 30 mA '轉 邱 27 分鐘，至預先以 Transfer buffer (48 mM Tris 十 39

m M glycine 十 3.75 ml 10% SDS 十 800ml H₂0+200ml methanol ; pH 9-9 .4)泡闋的的trocellulose membrane (Bio-

Rad) 上。

↓以 2%gelatin 遮蔽未接滿抗體之空位於室溫靜置一小時。

↓以 PBS (0.1 % Tween-20) 清洗三次。

↓以溶於 1% 雞蛋白溶液的兔子抗羊乳免疫球蛋白抗體共同 培養於裳混下振盪 30 分鐘，然後置於 4⁰C 隔夜培養。

↓以 PBS (0.1 % Tween-20) 清洗 3-4 次。

↓加入以 PBS 500 倍稀釋的 Goat anti-Rabbit IgG Horse- radish Peroxidase conjugated (Blotting grade ' Bio-

Rad) ，室溫下振盪混合 30 分鐘。

↓以 PBS (0.1 % Tween-20) 清洗。

↓加入發色劑 DAB

kit

(Sigma) 皇色，以蒸餾水洗去多餘

的藥劑後觀察。

參、結果

一、生鮮羊乳中總蛋白質量和總含氮囂的差異

1.總蛋白質量

以 Kenolor Total Protein Assay System 方法定出樣品 的總蛋白質量，結果如表一，發現 A 、 C 廠牌的生、鮮羊

乳差異頗大 'A 廠牌鮮羊乳 (52.08mg/m l)較生羊乳 (26.93mg/ml) 多約1. 8 倍 'C 廠轉鮮羊乳 (48 .48mg/ml) 較 生羊乳 (34 .4 5mg/ml) 多約1. 6 倍。而 B 廠牌鮮羊乳 (41.92mg/m l)含量略高於生羊乳(3 8.64mg/m l) ，另外，

其他廠牌的鮮羊乳總蛋白質暈多在 50 mg/ml 左右。

2. 總含氮蠶 (Total nitrogen)

以 Kjeldahl 發展的方法謝各樣品的總、合氮壘，發現 A 、 C 廠牌之總含氮最鮮羊乳較生羊乳多，而 B 廠牌則是

生羊乳較鮮羊乳多，至於其他廠牌的總、含氮最介於 0 .4 5-

。 .86% '只有 F 廠牌的含量高達 1.86% 。

二、生鮮羊乳中蛋白質成分的差異

將所收集到的生鮮羊乳及羊奶粉所沖泡而成的竿奶，

經統一蛋白質量，進行 SDS-PAGE 電泳分析，結果如圈一

所示，生羊乳中的蛋白質色帶較鮮羊乳和羊奶濃。另將不 同飽和濃度的硫酸餃 (Ammonium sulfate) 劃分所得到的 笠、鮮羊乳蛋白質成份以 SDS-PAGE 電泳分析，從硫酸按 沉澱結果發現有兩條蛋白質色帶在笠、鮮羊乎L 中顏色有顯 著的濃淡差異，鷗二其在 0-50^Cjo硫酸餃沉澱結果可發現 其中一條蛋白質於未還涼時，在生羊乳中可明顯看到，而

在鮮乳則無，而此蛋白質在 ß -mercaptoethanol 切斷雙硫鍵 後，會自原來的位置消失，從後續實驗確定它為羊乳免疫 球蛋白 G (Immunoglobulin G ; IgG) 另一蛋白質也在後續 實驗中證實為羊乳白蛋白 (Albumin) 。

三、免疫球蛋白 G 的純化與抗體的製作

1. IgG 的純化

生羊乳在。-50^Cjo硫酸餃濃度數分所得到的蛋白質，以

Sephadex G-200 及DEAE-Sephacel 管校中將蛋白質逐步分 離出。而在分離的過程中發現此蛋白質為一高分子量、帶 正電性而不會與陰離子交換管柱結合的蛋白質，由此蛋白 質在電泳片上移動的位置，大約落在 110 KD 左右，立以

戶 -mercaptoethanol 還原後可分成兩個片段，分子量約為 30 及 60KD 左右，與 IgG 的特徵相同。聞三，另外在電泳 膠片的分析上觀察到只有單一一條色帶，表示所單離出羊

的 IgG 純度相當高，可適用於免疫動物來產生具有單一特 異性 (momo-specfic) 的抗體。

2. 抗體的製作

將單離出竿的 IgG 對兔子進行免疫注射，每遇一次連

續三次後，白兔耳採血，所得到的血清以雙棺免疫擴散法

(double immunodiffusion) 來確認抗體的生成。出置四可看 出中央槽中的兔子抗羊免疫球蛋白的抗體會與周間槽中經 純化竿的 IgG 產生免疫沉降反應，由此可確定抗體的產 生。

另外將純化的 IgG (a) 與生羊乳 (b) 進行免疫電泳分

析; [富五，之後在中央溝注入兔子抗羊免疫球蛋白的抗血 清，經過一天培養後觀察此抗血清的特異性。由中央溝兩 旁產生單一且對稱的沉降線的結果，顯示此抗血清中的確 有抗體的產生且只對羊的 IgG 有單一特異性，確定可以利 用此抗血清來分析羊乳中的免疫球蛋白含量的變化。

3. 抗體的精製

本實驗是利用 Sandwich ELISA 法來分析生、鮮羊乳中 免疫球蛋白含量的變化，須利用到精製的抗體，故以 33^C/o 飽和硫酸按將抗血清中的 IgG 沉澱後，以 FPLC (gel

filtration) 的方式精製用於覆蓋在微量分析盤上的 capture

antibodies ⁰

4. 酵素抗體結合體效償的分析及檢量線的湖定

本實驗是利用 Sandwich ELISA 法來分析生、鮮羊乳中 免疫球蛋白含量的變化，在進入主要實驗之前必須先確定 自 Sigma 購得的酵素抗體結合體的效價，以及此方法的敏

感度。首先將所純化的抗體覆蓋微量分析盤，接滿羊的 IgG

後，注入不同稀釋倍數韓素抗體結合體，經由 ELISA reader

在 490nm 所偵測的吸光值來判定，可得到酵素抗體結合體 有效的稀釋倍數為 5000 倍。以這個稀釋倍數的抗體進行標 準檢遺線 (standard curve )的分析，測定此方法的敏感 度，圈六;閩中將標準液濃度取對數後與吸光值作成觀係 圈，結果顯示標準液濃度在 50 ng/ml 到 5 ug/ml 之間，可 得到一線性良好的劑量-反應檢量線 (dose-response stan-

dard curve) ，可知當檢測樣品的濃度超過或低於這段範圈

持則無法正確檢湖出。顯示在適當的稀釋比例下，以此

Sandwich ELISA 法可精確的分析及定量樣品中免疫球蛋白

含量的變化。而經過預先的測試後，將生羊乳以 1000 倍稀 釋，鮮乳、保久乳和羊奶以 10 倍稀釋。

四、生鮮羊乳中免疫球蛋白含量及總蛋白的變化 1.免疫球蛋白含蠱的變化

如屆七可觀察到單從一季中生、鮮羊乳的含量比較 峙，可看出在生羊乳與鮮羊乳中含量相差甚大，免疫球蛋 白在生羊乳的含量在 1025.12 士 249.31 ug/ml 到 2709.39 士

165.13 ug/ml 之間，而鮮羊乳中的濃度在 0.23 士 0.0058 ug/

ml 至U 72 .4 6 士 6 .4 1 ug/ml 的範圍內，兩者之情差異很大，

與三多羊奶粉沖泡的羊乳比較，鮮羊乳與羊奶粉的含量相 近，若進一步追蹤四季內生、鮮羊乳的含量變化，由麗八 可發現生羊乳中的免疫球蛋白最高於鮮羊乳含量，差異顯 著。也可觀察到秋、冬兩季生羊乳中的免疫球蛋白最高於 春、夏雨季生羊乳含量 2 - 5 倍。

2 .羊乳中總蛋白的比較

如國九、圈十，可觀察到 B 廠牌生、鮮羊乳中的總、蛋

白靈沒有太大差異，四季的改變也不大。但 A 、 C 廠牌鮮 羊乳中的總蛋白量較生羊乳高出 1.5-2 倍。

3. 免疫球蛋白對總蛋白的比較

由圈可發現四季中生羊乳與鮮羊乳的總、蛋白很相近，

但仍然有些差異，若只以每單位體積中所含的免疫球蛋白 的竄來比較，並不能真正客觀地代表在羊乳所有蛋白質內 所佔的比例，故將各!蔽牌的笠、鮮羊乳中免疫球蛋白對總、

蛋白的作一比值來校正(屬十一、圖十二)。經由每毫克 總蛋白中所帶有免疫球蛋白的含量的差別，發現鮮羊乳的 比值與羊奶粉相近，市建低於生羊乳。

五、羊乳漿白蛋白的純化及抗體的製作 1. 白蛋白的純化

將生羊乳 0-50 c/

o

硫酸餃沉澱的蛋白，經過 Sephadex G-200 將蛋白質加以分離，再通過 DEAE 管柱，發現所欲 單離的蛋白質會吸附在陰離子管柱上，顯示此蛋白質本身 帶負電，其在電泳膠片上移動位置大約在 66 KD 左右，與 Albumin 的特徵相似，故利用 Albumin 與非極性 Ligand '

如 Dextran -dye complex 等具有很強的親和力的性質，將 之通過 Blue -Sepharose 管柱，將沖出的蛋白溶液經透稀、

冷凍乾燥後進行 SDS-PAGE 電泳分析，證實此蛋白質確實

會與 Blue -Sepharose 結合，且以 ß -mercaptoethanol 還原 作用後，其移動的速度變慢，可知此蛋白質具有分子內雙 硫鍵。而出屆三，在電泳膠片的分析上觀察到只有單一一

條色帶，表示所舉離出羊的 Albumin 純度相當寓，可適用 於免疫動物來產生具有單一特異性 (momo-specfic) 的抗

體。

2. 抗體的製作

將單離出羊的 Albumin '依照三 (2) 分別對兔子及 小白鼠進行免疫注射，以雙棺免疫擴散法 (double immunodiffusion) 來確認抗體的生成後(屬十三) ，另外將

純化的 Albumin (a) 與生羊乳 (b) 進行免疫電泳分析，之 後在中央溝注入兔子抗羊白蛋白的抗血清，經過一天培養 後觀察此抗血清的特異性。出圖十四中央溝兩旁產生單…

且對稱的沉降線的結果，顯示此抗血清中的確有抗體的產

生且只對羊的 albumin有單一特異性，再次免疫注射於一遍 後將動物犧牲，將兔子血漿加入 CaC1

2 ^與

Thrombin '製得 抗血清，以 33 句。飽和硫酸該將抗血清中的抗羊白蛋白的抗 體抽胎，以 FPLC (gel filtration) 的方式精製'用於覆蓋在 微量分析盤上的 capture antibodies 。

六、生鮮羊乳中蛋白含量的變化

1.白蛋白含量的變化

如圈十六可觀察到單從一季中生、鮮羊乳的含量比較

時，可看出在生羊乳與鮮羊乳中含量相差甚大，蛋白在生 羊乳的合豎在 303.50 士 125.50ug/ml 到 662.23 土 44.79 ug/

ml 之間，而鮮羊乳中的濃度在 0.04 士 0.0097 ug/ml 到 69.32 士 0.97 ug/ml 的範園內，兩者之間差異很大。而三多 羊奶粉沖泡的羊乳中自蛋白含量約為 88.71 士 16.24ug/

ml '出圖十七可發現大部分廠牌之鮮羊乳中自蛋白含最都 甚低，低於羊奶粉的含量，不過 A 廠牌之鮮羊乳白蛋白含

與三多羊奶粉的含量接近。

2. 羊乳中白蛋白對總蛋白比值變化

由關十八、圖十九將各個廠牌生、鮮羊乳中的自蛋白 對總蛋白遺作一比低，結果發現各個廠牌生羊乳的比值皆 顯著高於鮮羊乳，另外，將鮮羊乳與羊奶粉作比較，員自發 現羊奶粉的比值均高於各餾廠粹的鮮羊乳。

七、熱處理對羊乳中免疫球蛋白和自蛋白的影響

在市售鮮羊乳的製備過程中，加熱是不可缺少的一

環，為了瞭解此加工過程對於生羊乳中免疫球蛋白和白蛋 白的影響，本研究模擬了 B 廠牌持續加熱的方式和其他廠 牌以 UHT 的加熱模式。

l. B 廠牌持續加熱的方式

將生羊乳緩慢加熱一小時至 80⁰C 後持續 30分鐘，發現 生羊乳中免疫球蛋白的含囂，隨著加熱時闊的增加而減

少，至 80⁰C30 分鐘其含暈以減少至 20 ug/ml ( 圖二十) ,

另外，此加熱模式對自蛋白的破壞又較免疫球蛋白嚴重，

80⁰C 加熱 30 分鐘後其自蛋白的含量已下降至 1 ug/ml (閱二 十一)

2. UHT 的加熱方式

將生羊乳置於 120⁰C 中泊浴加熱 5 、 10 、 20 、 30 、

45 秒及 1 分鐘後，分別取出樣品進行分析，結果發現生羊 乳中免疫球蛋白的合蠱，隨著加熱時間的增長而降低，尤 其 120⁰C 加熱 10 秒至 20 秒的過程，使免疫球蛋白的含量驟 降 80% '至 1 分鐘巴降至 20 ug/ml (國二十二)。而自蛋 白方面，結果發現隨著時間的增加其下降的幅度並不大，

以 120⁰C 加熱 1 分鐘後其白蛋白含量依舊有 260 ug/ml (儘 二十三)

3. Western blot analysis

為了探討生羊乳中免疫球蛋白和自蛋白含量受加熱處

理而減少的國子，本實驗藉出 Western blot 分析，來觀察 羊乳中免疫球蛋白和自蛋白的狀態。自園，發現隨加熱時 間的延長，羊乳中完整的免疫球蛋白和自蛋白有減少的現 象，且在較低分子量的位置有一些片段，顯示在加熱過程 中免疫球蛋白和自蛋白的確受到了破壞(關二十四、二十 五、二十六)

肆、討論

本研究主要在探討生、鮮羊乳中免疫球蛋白和自蛋白

含量的差異，在四季的變化以及生羊乳製成鮮羊乳的加 過程中(均質化和加熱處理)對於乳中免疫球蛋白和自蛋白 的影響。近年來，隨著圈人生活水準的提昇，飲用羊乳的 人口日益增加，為了因應市場的需求，因此出現還原乳的 問題，部分廠商或酪農可能在生羊乳中欖入不純的物質。

先前已有學者利用牛乳或乳粉在加工製造或儲存過程所產 生的物質，例如蛋白質還原物質 (Protein reducing

substance) 的存在 (29) (初) (31) 或由乳清中變性氮及總鈣量的 特性來偵瀏(的

在國外，也有不尚的廠商以較廉價的牛乳慘雜到羊乳 製成乳酪和一些食品賣給消費者，所以從 1960 年代，學者 就利用 Gel electrophoresis (仔例州圳344釗) (閃3衍均5幻)(倒昀366份) 、 Gas-liquid chroma街"

tωography (仔37) 、 High performance liquid chromatography

(州3羽38)幻8)(3

要賞驗室的設備與專業的技術才能完成。近幾年，發展出 免疫學方法，例如 Agar-gel immunodiffusion (40) 、 Ra- dial immunodiffusion (41) 、 Rocket immunoelectrophoresis

(42) 和 Immunoblotting (43) 等，雖然這些方法很靈敏、精 確 ， i丘費時和需要較高濃度的抗血清才能完成。而酵素免

疫分析法 (Enzyme-linked immunosorbent assay) (45) (46) (47)

，此分析法應用在食品檢驗上具有高度特異性、鑫敏度高 和操作便利快遠等優點，更可以一次處理多數樣品。所以

末實驗將生羊乳與鮮羊乳中的蛋白質經硫酸餃懿分沉澱 後，以 SDS-PAGE 電泳分析比較，結果發現膠片上免疫球 蛋白和自蛋白的色帶顏色有顯著的濃淡差異，故進一步以 ELISA 分析法印證其含量是否如膠片一樣有所不同。

在實驗中，利用來免疫兔子的是純的免疫球蛋白，但

在羊乳中免疫球蛋白的劃分為 IgG 、 IgA 及 IgM' 其中 IgG 佔大部分， IgG 、 IgA 及 IgM 的構造是相同的單元體加上 額外的蛋白質片段，或是數個單元體連結在一起形成的，

因此他們具有許多問樣被抗體辨識的位置，在研究中所利 用的多株抗體 (Polyclonal antibody )會把所有完整的免疫 球蛋白或片段抓出，故在最後湖得到的結果為所有免疫球 蛋白的總和。

由研究結果顯示，生羊乳中的免疫球蛋白含量顯著高

於鮮羊乳，沛其他廠牌單從一季鮮羊乳之間的比較，以每 單位體積中免疫球蛋白的濃度，或是以每毫克總蛋白中所 含有的免疫球蛋白量相比，發現以 B 廠碑(緩慢持續加熱

法)所製成的鮮羊乳免疫球蛋白，含量明顯低於 A 、 E 、 F 、 G 廠牌(高溫瞬間加熱方式; UHT) 製得的鮮羊乳，這

與先前的研究報告均具有其一致性，不同的熱處理方法對

會引起不同程度的變性，譬如 Pasteurized milk 為 10-

20% '而 UHT 滅菌法間接加熱方式的乳清蛋白質的變性為

70-80% '直接加熱方式為的申 60% '傳統式殺菌乳其乳清

蛋白會破壞 90-95% '但不會完全變性 (48) 。而所蒐集的三

家廠牌生羊乳進行比較，發現不同飼養環境，其母羊所生

產的乳汁成份亦有所差異。由於生羊乳取得不易，只蒐集 到一廠牌四季的生羊乳，結果發現，秋、冬兩季的免疫球

蛋白含量較春、夏繭季高。曾有報告指出，羊的受孕期在

秋宋冬初，而在春季生仔羊，理應當春夏兩季分泌的乳汁 中所含的免疫球蛋白較高，此與本研究結果不同，可能因 為廠商多利用配種的選擇，而造成母羊受孕時間不受季節

所趨便，又因本研究只取一廠牌生羊乳觀察四季的變化，

在往後觀察研究應必需多收集其它地方公司所生產的羊奶 來作更進一步的探討。

而在自蛋白方面，結果與免疫球蛋白類似，生羊乳中 的含量明顯的高於鮮羊乳的含量，且 B 廠牌鮮羊乳中自蛋 白含最也明險低於 A 、 E 、 F 廠牌的鮮羊乳，而市售羊奶 粉與鮮羊乳比較，則發現大多數廠牌鮮羊乳中自蛋白含量

較羊奶粉低，但 A 廠牌鮮羊乳白蛋白的濃度明顯高於其他 廠牌的鮮羊乳，而與羊奶粉的含量相近，此不同變化是否 是因為加工過程，或其他原因所造成的結果，有待進一步

探討。

一般的鮮乳製造過程有收乳、淨化、冷卻、標準化、

均質化、殺菌和冷卻等步驟，由於這些步驟中只有均質化

和加熱滅菌方式較易改變乳汁成份，所以本研究也模擬均

質化和加熱模式，進行探討。結果發現均質化對生羊乳中 的免疫球蛋白和自蛋白含量沒有引響。由於台灣地區氣候 濕熱，容易滋生微生物，為了確保乳品飲用的衛生及安 全，廠商多標榜利用超高溫瞬間滅蘭法 (UHT) ，其溫度及

殺菌時間多控制在 120⁰C -130^QC ' 2-5 秒之間，但本研究 所收集的樣品中 'B 廠牌是以傳統緩慢加熱方式滅菌，因 此我們分別模擬這兩種加熱方式進行探討。結果發現在免

疫球蛋白方茁'模擬 B 廠牌緩慢加熱方式在 80^QC30 分鐘 後，含量已減少 99% 至 20 ug/ml ' 而模擬 UHT 加熱模式 則在 120⁰C 45 秒後，含量才下降至 50 ug/ml 。而自蛋白 方面，模擬 B 廠牌加熱方式在 80^QC 加熱 30 分鐘後，含量由

676 ug/ml 下降至 76 ugl剖，而模擬 UHT 加熱模式則在 120

QC

1 分鐘後，其含量是 260 ugl訓。

一般市言，乳清蛋白質成份對熱變性的敏感程度不 同，其中以免疫球蛋白最敏感，其次是乳漿白蛋白，再者 是乳球蛋白。此與本研究結果相似，另外，也發現，以模 擬 B 廠牌加熱模式，其對於免疫球蛋白及自蛋白的影響皆 大於模擬 UHT 加熱方式。然而，從本研究模擬 UHT 加熱 時間應該較乳品工廠為長，但所分析到的免疫球蛋白和自

蛋白含量皆比各廠牌鮮羊乳高，且也表一可發現以生羊乳

模擬兩種加熱方式後，浪1 其總、蛋白質麗和總、含氮量有減少 的趨勢，其下降的幅度以模擬 B 廠牌傳統持續加熱方式較

模擬 UHT 加熱方式來的多。反觀以 UHT 加熱滅菌的 A 、 C 兩廠牌其鮮羊乳在總蛋白質量和總、合氮蠱的濃度都比生 羊乳高出甚多。同時由本實驗得知，在於一般的 UHT 滅萬 方式峙，其鮮羊乳中所含免疫球蛋白和自蛋白均呈現與生 羊乳有極大差異存在。而以模擬的方式來作驗設時，則發 現以 UHT 短時問滅菌，其免疫球蛋白和自蛋白均有相當的 耐熱性。此實驗是否意味著在生羊乳經滅菌過程時已有稀 釋過多的問題存在，抑或是擬有自外界添加蛋白質，來增 加其蛋白質濃度(因其比重值均非常一致) ，或是還有其 它在加工上有特別不同之處，值得繼續深入研究。

97.4 66.2

45.0

31.0

21.5

B

鮮

B

生

A

生

生牛乳

dw

訂叫

_{A C 一}

鮮鮮多

國一、 SDS-PAGE 電泳分析國

97.4 66.2

45.0

31.0

21.5

14.4

S t' d B 生 B 生 B 鮮 B 鮮

LMW 0-50 50咀90 0-50 50-90

未還未還未還未還

圖二、 SDS-PAGE 電泳分析圈

97.4 66.2 45.0

31.0

21.5

14.4

St'd IgG Al bumin

末還未還

國三、 SDS-PAGE 電泳分析國

國四、雙向免疫擴散分析

中央槽:純化的羊乳 IgG

周圍槽:兔子抗羊乳 IgG 抗血清

A

B

儷五、免疫電泳分析麗

A: 純化的羊乳 IgG B: 生羊乳

中央槽:兔子抗羊乳 IgG 抗血清

y=Û.568x咀0.6948

1,5

0.5

aHHOAW吋QO

4.000 3.000

2.000

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Log (Immunoglobuin; ng/m1)

圈六、標準檢量線

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A 鮮

B 生

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國七、三位羊乳與鮮羊乳中免疫球蛋白含量之變化

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關八、季節對生鮮羊乳中疫球蛋白含量之影響

50

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圖九、各廠牌生鮮羊乳中總、蛋白質含蠶之變化

50

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春 春 夏 夏 秋 秋 冬 冬

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鮮

崗十、 B 廠牌四季生鮮羊乳中總蛋白質含量之變化

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A 鮮

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B 鮮

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C 鮮羊奶粉

圖十一、生竿乳與鮮半乳中免疫球蛋白對總蛋白之比例變化

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春 春 夏 夏 秋 秋 冬 冬

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鮮

生

鮮

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鮮

留十二、季節對生鮮羊乳中疫球蛋白對總蛋白比例之影響

圈十三、雙向兔疫擴散分析

中央槽:純化的羊乳 Albumin

周圍槽:兔子抗羊乳 Albumin 抗血清

屬十四、雙向兔疫擴散分析

中央槽:純化的羊乳 Albumin

周圍槽:小白鼠抗羊乳 Albumin 抗血清

屆十五、免疫電泳分析屬

A

B

A: 純化的竿乎L albumin B :生羊乳

中央槽:兔子抗羊乳 albumin 抗血清

1000

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A 生 A 鮮 B 生 B 鮮 C 生 C 鮮羊奶粉

國十六、生羊乳與鮮羊乳中白蛋白之含量變化

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A B C D E F

G 羊奶粉

關十七、不同廠脾鮮羊乳中白蛋白含靈之差異

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A 生

A 鮮

B 生

B 鮮

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C 鮮羊奶粉

圈十八、生竿乳與鮮羊乳中白蛋白對總蛋白之比例變化

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未處理 40⁰C 60⁰C 80"C 100"C 120⁰C 30min 30min 30min 30sec 30sec

國二十、 B 廠牌熱處理對生羊乳中兔疫球蛋白含量之影響

700

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米處理 40-C 60⁰C 80⁰C 100⁰C 120-C 30min 30min 30min 30sec 30sec

關二十一、 B 廠牌熱處理對生羊乳中白蛋白含量之影響

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2500 2000

500 1500 1000

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lWt 5sec 10sec 20sec 30sec 45sec 60sec O

圖二十二、模擬 UHT 熱處理對生羊乳中免疫球蛋白含量之影響

700

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未處理 120⁰C 120⁰C 120⁰C 120⁰C 120⁰C 120⁰C 5sec 10sec 20sec 30sec 45sec 60sec

圖二十三、模擬 UHT 熱處理對生羊乳中白蛋白含章之影響

未 40⁰C 60⁰C 80⁰C 100oC120o C

處 30' 30' 鉤 30" 30"

理

IgG

•

輯二十泊、 Western blot analysis for goat milk IgG

米 120

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C

120⁰C 120⁰C 120⁰C 120⁰C 120⁰C

處 5" 10" 20" 30" 45" 60"

理

IgG

•

圖二十五、 Western blot analysis for goat milk IgG

未 40⁰C 60⁰C 80⁰C 100oC120o C

處 30' 30' 30' 30" 30"

理

Albumin

圖二十六、 Western blot analysis for goat milk Albumin

表一、各廠牌生鮮羊乳之比較

樣品

主仁蠶 (gltrïl). TotaLpröt~Ítt.

^C1ljg/ml)

Tötal 拉拉Qgen%

A 生 0.89 26.93 0.502

A 鮮

1.01 52.08 0.884

A 保

1.02 51.96 0.701

B 生

1.02 38.64 1.461

B 鮮

1.01 41.92 1.061

C 生 1.02 34.45 0.525

C 鮮

1.02 48.48 0.701

D 鮮

1.00 40.56 0.715

E 鮮

1.00 52.32 0.447

F 鮮

1.02 53.16 1.839

G 鮮

1.03 51.72 0.867

二多

1.04 42.44 1.031

模擬緩慢加熱方式1. 01 35.47 0.801

模擬 UHT 加熱方式1. 01 37.35 0.972

五、參考文獻

1) Jenness^, R. 1980. Composition and characteristics of goat milk : review 1968-1979.

2) Whitney, R. 1志， Brunner, J. R. 、 Ebner，K. E. and Swaisgood, H. M. E. Nomenc1ature of the proteins of cow's mi1k : Forth revision. J. Dairy Sci.59 : 795-815.

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