翩翩

(1)

私立中山醫學院生物化學研究所

碩士論文

人類細胞株中不同的 ι(CGG/CCG)n DNA

結合蛋白之分子組成研究

Study on the d-(CGG/CCG)n DNA binding proteins from different human celllines

指導教授:陳凌黨轉轉體體聽講些-Yun Chen , Ph. D.)

劉德中博士 (Te-Chung Liu世 Ph.D.) 研究生:翁秀如 (Shiow回Ru Ueng)

中華民國八十五年六月

IIIUrullUIff 1翩翩11111111

(2)

授權書

(博碩士論文)

本授權書所授權之論文為本人在中山醫學院生物化學研究所

…一一一一一一組 8牛學年度第 l 學期所棋碩士學位論文。

論文名稱:豆類細胞株中不同的小 (CGG/CCG)n DNA 結合蛋白之分子組成研究

同意口不同意

本人具有著作財產權之論文提要，授予摺家圖書館、本人畢業學校及行政院國家科學委員會科學技術資料中心，得重製成電子資料檔後收錄於該單位之網路，並與台灣學術網路及科技網路連線，得不 ~tt 沌域時間與次數，以光碟或紙本重製發行。

同意口不同意

本人具有著作財產權之論文全文資料，授予行政院國家科學委員科學技術資料中心，得不服地域時間與次數以微縮、光碟重製後發行，並得享該中心微縮小組製作之研究報告、獎勵代表作、博碩士論文三擋資料等佳新台幣伍佰元之服務 o 本論文囡涉及專利等智慧財產權之申請，請將本論文全文延後至

民國一一年…一月後再公闊 o

出同意口不同意

本人具有著作財產權之論文全文資料，授予教育部指定送繳之圖書館及本人畢業學校圖書館，為學術研究之目的以各種方法重製，或為上述目的再授權化人以各種方法重製，不 ~tt 時間與地域，惟每人以一份為限 G

上述授權內容均無須訂立讓與及授權契約害 o 依本授權之發行權為非專屬性發行權利 o 依本授權所為之故錄、重製、發行及學衛研發利用均為無價 o

指導教授姓名:

研究生簽名: 學號 R8302109 (親筆正楷)

8 期:民國

年一士一月一--，一日

備註 L 上述問意與不同意之欄立若未鉤選，本人用意視同授權 o 2. 授權第二項者，請再交論文一本予承辦人員。

3. 本授權書已於民國 85 年 4 月 10 日送請著委會修正定稿。

(3)

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1.依著作權法的規定，任何單位以網路、光碟與微縮等方式整合國內學街資料，

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是.全國博碩士論文全文資料微縮片整合計畫的宏觀效益:

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，您的論文將因而被充分利用。在國家總體利革方面，紙本容易目影印而造成裝訂上的傷害，圖書館中孤本的公開陳列與外借也有破損之虞，唯有賴政府全面性的整合，借助科技設備才能一舉完成保存與利用的全方位效益，回憶您過去尋找資料之不使經驗，學弟與學妹確實須要您的論文與授權書。

5. 本案聯絡電話 (02)7377746 江守田、王淑貞地址:台北市和平泉路二段 106 號 17樓 1702 窒

在

(4)

本論文為中山聲學院授予理學碩士學位之必備條件之一?經中山醫學

院生物化學研究所論文考試委員審查合格及口試通過 o

口試委員

中與大學獸醫系副教授

中山醫學院營養系副教授 (論文指導教授)

中山醫學院生物化學研究所副教授

(論文指導教授)

中華民國八十五年六月

張伯俊博士

;也翔先

4

陳凌雲 ^博士

1fι 昔

(5)

學生翁秀如論文題目為人類細胞株中不同的 d-(CGG/CCG)n DNA結

合蛋白之分子組成研究，其論文已經中山醫學院生物化學研究所碩

士論文考試委員會審查合格及口試通過，並由其指導教授核閱後無誤。

指導教授:陳凌雲博士擎的意中博士

中華民商 85 年7 月

簽名:

(6)

誌謝

本篇論文得以順利完成，首先要威謝指導教授陳凌雲博士及劉德中博士之

悉心指導，聲於二位恩師在科學研究及治學諱言享教導，抱以成激之情。論文完成的初稿，戚謝中興獸醫研究所張伯俊博士審閱及斧正，並對論文內容提出建設性建議。學習期間，成謝謝易修副教授熱心所提供的蔡品，使得實驗得以順利進行。成謝劉哲育副教授與王怡鈞老師在課業與實驗的賜

教，及李月君老師在實驗技術的協助。同時，成謝秀芬、昀慕、耀鵬、繆珍、玉美、至凱、孟訓、麗娟、千瑩、麗霜互相照顧及幫助。最後最最成謝的是父母親的支持，以及崇宇姨丈與淑真阿姨在這一段在外求學日

子里，對生活上悉心的照顧，得以心無旁驚而致力向學，衷心威謝大家在

這一段成長過程的鼓勵。

翁秀如僅誌於中山醫學院生物化學研究所中華民國八十五年八月

(7)

中文摘要...

...1

英文摘要 ...2

壹、緒論 ...3

貳、材料和方法材料 ...8

方法 ...9

參、結果 ...14

肆、討論...... ...21

伍、參考文獻 ...25

圈。1...30

附圈 ...44

附錄一~.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . .. .. .. .. .. .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . . . .. . . .. . . . .. .. . . . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..刊的錄二 ...49

(8)

摘要:

易脆X 祟色體徵候群(fragile X syndrome)是一種性聯遺傳疾病，會造成病人智能障礙。目前已知叫做 1 基因和易脆X 染色體徵候群有關，在 FMRl 之 5'_

untranslated region 有一段(CGG)n 重複序列。在正常人之 CGG 約重複 6-54 次， premutation 的 carner其 CGG 重複50-200 次， full mutation之病人CGG 重複200 次以上。易脆X 染色體徵候群致病的因素，主要是來自於CGG 重複序列遠增，因而造成(CGG)n 重複序列及其上游250 bp處的 CpG island 甲基化

(methylation) ，因此減少了 FMRl 的mRNA表現，進而降低恥缺P 的表現。

(CGG) 不正常增生的機制，目前並不瞭解， Richards 等人(1 993) 自 HeLa細胞核抽取液中發現有一個 DNA結合蛋白，會專一性與 ds國(CGG/CCG)n結合，

因此命名為 CGG結合蛋白 1(CGG-binding protein 1, CGG品Pl) ，但對它的生理功能及特性並不清楚。在本論文中，我們對 CGG-BP 的特性做了進←步探討，結果發現，在分裂中與非分裂中細胞有不同的 CGG圖BP被表現出。

另外又發現，存在於HeLa細胞株的 CGG-BP 其 native state 下分子量為 200 kDa' 且可能由 70與 50 kDa蛋白共同組成。 lymphocyte 、 glioma 、 Hep3B 細胞株的 CGG-BP 與HeLa細胞株的 CGG-BP均具有相同的蛋白分子組成。而 gingival 誼broblast 、証460及HUVEC 細胞株的 CGG-BP則由 50及38 kDa蛋白組成，在UASMC 細胞株的 CGG-BP則由 50及31 kDa蛋白組成。綜合上述的結果，推測不同的人類細胞株存在不同的 CGG﹒結合蛋白，且 50 kDa蛋白為不同 CGG- 結合蛋白之共同組成，而 70 、 38 、 31 kDa蛋白則是由於組織特異性

而產生不同之調節蛋白。

(9)

^kD

a, while UASMC cellline was composed of two proteins with molecular mass of 50 and 31

kD

a.

These results indicated that the 50

kD

a protein might be a common component

of CGG-BP shared by different member of CGG-BPs.

(10)

壹、緒論:

易脆X 染色體徵候群(音agile

X

syndrome) 亦稱Martin-Bell

syndrome

'此疾病對患者最大影響是智能障礙，其臨床主要特徵包括:中度到重度智障、

長臉、大耳、巨學症等 (Martin

and

Be話，

1943; Turner et

al.， 1980) 。性聯遺傳是此疾病另一特性，因此男性罹忠率為1/ 1250 高於女性1/2500

(Gustavson et a

l.,

1986; Webb et a

l.,

1986; Brown and Jenkins

,

1992)

，但根據最新文獻報告

男性罹患率為1/4000(Tumer

et a

l.,

in

press) 。利用細胞遺傳學方法，把患者的白血球細胞垮養在缺乏禁酸或含有葉酸抑制劑的垮養液中，如 methotrexa妞，會誘發企agile

X site

(Suther1an益， 1977)' 在顯微鏡下可觀察到 X 索色體的 Xq27 .3位置有易脆位置 (fragile site)( 附圈一)。

在 1991 年Verkerk 等人利用分子生物學技術'已自 X 染色體的易脆位置選殖出叫做 1(音agile

X mental retardation

1) 基因，此基閣會發生 altemative splici時，產生一些 isofomi 的 FMR蛋白，但以分子量 69 kDa的 FMR蛋白為主

要。 Verkerk 等人(1 993) 利用 RT-PCR分析不同組織，也發現FMRl 基固有

altemative

splicing作用，形成 12種不一樣mRNA產物，且不具組織專一性。

站在R1 基因具有 17個 exon(附園二) ，在站在R1 基因的 5'.untranslated regi凹，位於exon

1

'有一段多型態 (CGG)n重複序列(Kremer

et a

l.,

1991; Verkerk et

此，

1991)

(附闊二) ，在病人的 X 染色體上觀察到的易脆位置，便是此位置發生

突變所致。一般而言，在正哲人的 (CGG) 重複次數約 6-54次(Fu

et

al叮 1991) , 平均重複次數為 29 次。當 (CGG) 重複50-200次時稱為前突變(premu組討on) , 發生在男性上仍會有正常表現型，其 FMRl 基因 (CGG)n 重複序列不會被甲基化，比男性稱為正常傳遞男性(normal

transmitting males

,

NTMs)

，他們會將已突變基因遺傳給他們的女兒，但她們不會發病會變成帶思者(c缸rier) ,

不過正常傳遞男性的孫子則就會有很高的發病危險率，即所謂 Sherman paradox' 換句話說，就是在家族史中愈後代的成員發生智障比率愈高。然

(11)

而對女性而言就較為複雜，有 30% 女性帶困者會表現中度智障， 55% 女性帶困者在 X 染色體上會出現易脆位置。當 (CGG) 重複200 次以上，甚至於高達 1000 次以上，則稱為完全突變(如11

mutation)

，這時會明顯表現易脆X 染色體徵候群病徵(Fu

et

al叮 1991; Kr

emer et a

l.,

1991; Verkerk et a

l.,

1991; Oberle et

泣，

1991; McConkie-Rosell et

al叮 1993) ，且叫做1 上的 (CGG)n 重複序列及距離 (CGG)n 重複序列上游 250 bp 的 CpG island 會產生甲基化

(methylation)(Vincent et

al 叮 1991;

Homstra et

al 叮 1993;

Hansen et a

l.,

1992;

Sutcliffe et a

l., 1992)' 使得FMRl 基目的mRNA表現減少 (Oberle

et

泣，

1991;

Pieretti et a

l., 1991) 。

由此目前認為導致易脆X 染色體徵候群的發生，是因為 Fl\偎1 基茵的

5'-un甘anslated region之(CGG)n 重複次數遞增，造成CpG island及郎在Rl 基因上 (CGG)n 重複序列產生超甲基化(hypermethylation) ，阻礙Fl\依1 基因進行轉錄作用 9 進而顯著降低站在Rl

protein

(F孔做到的表現 (Devys

et

泣，

1993;

V位heij

et a

l., 1993) 。不過在臨床上也發現有一些表現易脆X染色體徵候群病徵的病例，在X 染色體上沒有表現易脆位置，但他們的 FMRl 基因產生定點。)e

Boulle et

and Dreyfuss

, 1992)及兩個在站住P 的 K

homology

(KH)

domain (Siomi et a

l.,

1993; 1994; Ashley et

al叮 1993) 0

RGG box

(Arg-Gly輔Gly) 是一個 RNA-binding 的 motif '在

heterogeneous huclear RNP K (h

nRN

P

K)與核內的 RNA-binding protein-f!p 具有這樣的 motif 。由於近來發現一些 RNA-binding protein均含有 Arginine- 及

(12)

glycine-rich domain

'且在 domain 內含有一群tripeptide 一組的重複序列，因而稱之為 RGGbox ^o 另外在一些核及核仁中的RNA-binding

protein

'已證明其 RGG box具有與RNA結合的活性(Kiledjian

and Dreyfuss

,

1992; Dreyfuss et

al 叮 1993) 。由於F:t\恨P 之amino acids序列的 286-321 和 347輛382彼此間有 39% 類似，但它們與hnRNP protein 的 KH domain 史相似，因此稱F:t\恨P 之

amino

acids 序列的 286-32 日口 347-382 為 KH

domain

。由於有一些含有 KH domain 的蛋白會結合到 RNA' 因而認為 KH domain含括在ribonucleoprotein (駝的 family 0 茵此基於以上因素， F~恨P 被認為是一個 RNA-枷ding

protein

。在 in vÍtro實驗中已證實 F:t\起P 的確會和lU她結合(Siomi

et a

l.,

1993;

Ashley et

al叮 1993) ，且KHdomain和 RGGbox扮演重要角色。另外在臨床病例中亦發現，若 KH

domain (De Boulle et

址， 1993) 或 RGG

box

(L侃，

unpublish) 發生突變會造成易脆X 染色體徵候群病徵。

利用 in

situ

h)伽idization 或 immunohistochemistry 方法已證明站在R1 的 mRNA 分佈廣泛，尤其在腦部及華丸會大量表現，在腦部，主要位於海為迪的神經細胞與大腦皮質的灰質 (Abitbol

et a

l.,

1993)

同時， spermatagonia亦會大量表現，自此，推測FMR1 在精子生成中掛演重要角色。然而其真正生理功能仍未被了解。

dynamic

mutation是因為它的突變跟trinucleotide序列重複次數有關，發生突變後，子代和親代的 copy number不舟，亦即完全是每代皆產生不同

copy number (Richard and Sutherland

,

1992a)

⁰

myotonic

dystrophy與易脆X 染

(13)

色體徵候群一樣，均是 dynamic mutation疾病，也就是triplet

repeat mutation

(Ri

chard and Sutherland

, 1992b) 。從分子層面觀來，它們具有相似的遺傳特性，而 myotonic dystrophy 現已發現有創立者染色體效應 (founder

chromosome effect)

, Har1ey 等人(1992)預測易脆X 染色體徵候群可能也具有相同特性。Rich訂ds 等人(1 992) 以 Haplotype analysis 方法對易脆X 染色體徵候群病人的 X 染色體做分析，從受檢的病例中，發現大部份的病人有創立者染色體 (founder chromosome) 突變，證明易脆X 染色體徵候群自有創立者紮色體存在而引發疾病。從遺傳學上觀點，

fragile

X 突變基因應恆定消失在基因庫，然而卻一直發現新的病例，意味著有新的突變不斷產生，而創立者柴色體效應則可以解釋比現象(Mandel， 1994) 。

Richards 等人(1 992)提出兩個突變棋示，來說明導致創立者染色體突變的機制，其中之一假說認為 (CGG) 重複序列遞增，可能是(CGG) 受複序列欲維持一個最佳 triple

repeat region '

l!p 完全只有 (CGG) 重複序列，因此會產生突變以增加 (CGG) 重複序列。或是(CGG) 重複序列中間穿插的 (AGG)(Kunst

and Warren

, 1994)' 將 (AGG) 的 A 突變為 C' 如此即可維持一個最佳 triple

repeat region

0 通常在一般人的 (CGG) 重複序列中，會穿插約 2-3 個 AGG序列在其中 (Verkerk

et

鈍，

1991)

，沒有 AGG 或只有一個AGG 穿插(CGG) 重複序列中，具有使(CGG) 重複序列增長傾向(Eichler

et

al 叮 1995) 。現認為 (AGG) 在 DNA複製時可避免DNA發生滑動作用，防止 (CGG) 重複序列遞增作用

。hong

et a

l.,

1995)

⁰ Eichler 等人(1 994)認為 (CGG) 重複序列增加，可能是(1) 來自於DNA 滑動時，使DNA產生配對錯誤所造成的，或是使(CGG) 重複序列中的 AGG發生缺失突變或A 突變為 C 。而Richards(1992a) 等人另一假說認

為有一段與trinucleotide無闊的 DNA 突變而變成一個 DNA結合位置，導致蛋白結合至此，使得 (CGG) 重複序列遞增。在人類許多其它基茵的 5'

untranslated

region是p(CCG)n 重複序列， BCR基因便是其中一例，並且其

(14)

5'-untranslated

region 的 (CCG)n 重複序列會與DNA結合蛋白結合(Zhu

et

al可 1990) 。在 1993 年Richards從HeLa細胞核抽取液發現一個核蛋白，會專一，性和 p(CGG/CCG) 10 鍵結，將此蛋白稱之為 CGG 結合蛋白 1

(CGG-binding protein 1

,

CGG-BP 1)

，然而其在易脆X 染色體徵候群致病過程中，是否扮演何種角色，以及真正生理功能至今尚未被證實。

在本論文中欲進一步探討CGG-BP 的特性，結果發現，以 gel

retardation

初步分析病人與正常人白血球細胞核中的 CGG-BP 未具任何差異。而 CGG

BP 可能具有 2種以上，因為在分裂中與非分裂中細胞表現不同的 CGG團BP 。

另外本研究中發現，存在於HeLa cell 的 CGG-BP其native form分子量為 200 kDa' 且可能由 70與 50 kDa蛋白共同組成。 lymphocyte 、 glioma 、 Hep3B 細胞株的 CGG-BP 與 HeLa 細胞株的 CGG-BP 具有相同的蛋白分子組成。而

gingival

fibroblast 、 H460及HUVEC細胞株的 CGG-BP貝tl 由 50與 38 kDa蛋白組合，在 UASMC 細胞株則由 50與 31 kDa蛋白組合的 CGG-BP 。對於這樣的結果，推測 50 kDa蛋白為不同 CGG- 結合蛋白之共同組成，而 70 、 38 、 31 kD

a

蛋白則是由於組織特異性所產生不同之調節蛋白。

(15)

貳、材料和方法:

材料:

lymphocyte細胞株由中山醫學院生物科李宣伶博士提供。

gingival

fibr由last細胞株由中山醫學院李天翎博士提供。

UASMC 、 glioma 、 HUVEC 、狂460 、 LZET 、 Hep3B 等細胞中朱由臺中縈民總

醫院醫研部徐士蘭博士提供。

HeLa

cellline 由中央研究院生醫所林文昌博士提供。

(16)

方法:

一、細胞玲養:

細胞株培養於令堵養波(10% FBS-D扎在EM)

25

cm²^{垮養瓶，將玲養瓶蓋}

於

3rc ，及 5%二氧化碳垮養箱。待細胞長滿後，把垮養液抽乾，

tÁHBSS

清洗細胞一次，加入0.5

ml 0.05% Trypsin-0.02% EDTA

'把細胞自堵養瓶洗下，再加進 10 ml垮養液，使細胞均勻沖散，

5

ml細胞種至11 新的垮養瓶繼續

培養。

二、核抽取液製備 (Schreiber

et a

l.,

1989) :

符細胞在玲養瓶中長滿後，倒掉垮養液， 5

ml TBS (Tris buffered saline)

洗細胞去除的rpsin inhibitor 。加入0.5

ml 0.05% Trypsin-0.02% EDTA

'使細胞自垮養瓶脫落後。利用 10

ml

TBS 洗細胞，於2500 rpm離心 5 分鐘，去掉上清液，洗兩次，再將細胞轉移至1. 5 ml離心管。讓細胞懸浮於 1

ml TBS

中，

spin down

15 秒。加入800μ1冰涼 buffer

A (10

mM

Tris pH 7

.4;

10

mM

KC1;

0

.1 mM EDTA) 於細胞沉澱物，用微量吸管上下抽吸，置於冰上的分鐘。

加入到抖的%現配NonidetNP隘的，震盪 10秒鐘，

spin down

30秒。加入 100 μi冰冷buffer

C (10

mM

Tris pH 7

.4

;0

.4

M NaCl; 1

mM EDTA)於細胞沉澱物內， 4⁰C 下劇烈震盪 15 分鐘。在4⁰C 下以 11000 rpm離心 10 分鐘後取上清液，

即是核抽取液，保存於-70⁰C ⁰

五、 primerDNA使用前處理:

人工合成primer DNA使用前，把(CGG)10和 (CCG) 10相混後。於95⁰C 加熱 5 分鐘，置於室溫讓其冷卻。利用 HPLC 純化之，以減低雜質對DNA 的影

響，經過HPLC純化之後，加上0.5 MMgCh' 使MgCh最後體積濃度為 0.01 M' 及2-2.5倍體積絕對酒精，使DNA於-20⁰C 沉澱一個晚上。芳悅。C 下以 11000 rpm離心 15 分鐘後，移去上清液，以 70% ethanol洗游沉澱物，接著以 11000

(17)

溶解。取2μ1

DNA+l ml

H20~MOD260 '計算DNA濃度，其吸光值為 0.047

'

代入下列公式pmole/ml=OD26o/0.01

XN '

N為 nucleic aci吐數目，

0.047/0.01 X 60=0.078 pmole/ml ' 0.078 X 500=40

pmole/ml t'!p ，為 (CGG/CCG) lO DNA濃渡。

四、 Gel

retardation :

(1) 探針(probe)製作:

將 10

pmole (CGG/CCG)

^lOoligonucleotide 、 5μ110X

kinase buffe

r-- 10μl gamma)2p回ATP與 lμ1

T4 polynucleotide

kinase相混合，加水至最後總體務為 50 抖。 37⁰C 水浴60分鐘，加上2μ10.5 MEDTA 以終止kinasè反應。等量 phenol/chloroform萃取oligonucleotide

DNA

'震盪 1 分鐘，離心 2 分鐘。上清液移轉到另一新離心管，加2倍體積絕對酒精，置於-70⁰C 下 30 分鐘使DNA 沉澱。利用 11000 中m離心 10 分鐘，移除上清液，讓DNA溶解在200μ1

b :u ^ffer

C 即可，存放在欄20⁰C 。

(2)

bandshift反應:

(CGG/CCG)

lO DNA和核蛋白結合反應 (binding reaction)在總體積為的 μ1 bu能rC 中進行，取適量核抽取物和 1μg/生tl

salmon sperm

DNA於室溫下反應 10 分鐘。再加 50 品的le放射線標織(CGG/CCG) lO '在室溫反應 15 分鐘之後，加入1.7μ110X

loading buffer

0 以 5%

non-denaturing polyacrylamide gels

進行電泳分析， O.5

X TBE (44

.5 mM

Tris base

,

44.5

mM

broic acid

,

0.01 M

EDTApH 8.8)

做為電泳緩衝液，在室溫下，以電壓 90 volt進行電泳分析。

乾膠後，置於X光月下曝光，在-70⁰C 下自動顯影一晚。

(3) 5% non-denaturingpolyacrylamide

gels 配製:

(18)

acrylamide-bisacrylamide (30:0.8) 0.825 ml I

lXTBE 2.5 ml

dH20 1

.4

25 ml

1.5%ammonium persulfate 0.25 ml

TEMED

2.5μi

」幽一一一一

五、 Biotinylated

(CGG/CCG)IO binding assay :

(1) streptavidin-agarose

beads使用前先混合均勻，取到抖，以 1

ml buffer C

洗漲2 次。

(2) 2.5 nmole

biotin-(CGG)lO和 2.5

nmole

biotin翩(CCG)IO相混， 95⁰C 下水浴5 分鐘，置於室溫下使其自行冷卻。

把步轉(1)和 (2)相混，讓其於室溫下反應、 10-15 分錯。 f吏舟 buffer C洗3 次，再加入到 μi細胞抽取液，在室溫下反應的“20 分鐘後。仍以 buffer C 洗3 次，加上20μ1

3X SDS sample buffer

'於95⁰C 乘沸 5 分鐘，利用 10% SDS岫 PAGE 分析，

Coomassie

bule 染色或銀禁。

六、 SDS- 聚丙:掃臨氯板膠電泳法(SDS-PAGE)

:

10%SDS圓PAGE配製:

resolving gel (4ml) stacking gel (2 ml ) acrylamide-bisàcrylamide( 30:0.8 )

^1.

33 ml 0

.2

5 ml

3 1\在 Tris幽HClpH

8.8 0

.2

5 ml

0.5M Tris-HCl pH 6.8 0.5 ml

IO%SDS 0.04 ml 0.02 ml

1.5% ammonium persulfate 0.5 mi 0.1 ml

dH20

1.

63 ml 1.03 ml

TEMED

2μi 2μi

已

(19)

七、黛色:

(1) Coomassie bule 染色:

將 SDS-PAGE 電泳分析之膠體浸泡染色液(Coomassie blue R 250 (0.1 %)

溶於H20 : methanol : acetic acid (5 : 5 : 2) 之混合溶劑中，以 WhatmanNo.

l 濾、紙過濾、)四小時以上，以去色液(30% methanol, 10% acetic acid )去色。

(2)銀染 (silverstain) :

1. 將 SDS-PAGE 電泳分析之膠體浸泡在200 ml Fix solution (ddH20 80 ml, methanol 100 ml, acetic acid 20 ml)溶液中，緩慢晃動，室溫下約的分鐘。

2. 取出膠體以 ddH20浸泡，每 15 分鐘換水一次，共需換水4次。

3. 加入硝酸銀染色液(silver stain solution) 100 ml (吐dH20 70 ml, NaOH (0.1134 glml) 0.66 ml, NH40H 1.4 ml, AgN03 0.8 g) ，室溫下緩慢晃動約

15 分鐘。

4. 倒出硝酸銀染色液silver stain solution 以 ddH20 浸泡，每 15 分鐘換水一次，共需換4 次。

5. 加入顯影溶液(develope solution) (ddH20 100 ml, cifric acid 0.005g, formalin 0.1 ml) ，緩慢晃動，等 band 出現至所需深度(density) 即可。

6. 倒出 develope solution '加入 200 ml stop solution (ddH20 150 叫，

methanol 60 ml

,

acetic acid 10 ml) 。

八、陰離子交換層拼法(AnionExchanger chromatography) : 1. DEAE位陰離子交換層析:

先packing好DEAE-52 1 ml gel 的 minicolumn '接著以 1M NaCl TE

buffer洗管牲，再以 3-5倍管柱體積TE buffer平衡管柱。把細胞核抽取液稀釋 5倍通過管柱，以 3δ 倍管柱體積 TE buffer洗管柱，再分別以 0.1 M 、 0.15

M 、 0.2M 、 0.25 M與0.5 M NaCl TE buffer把吸附在管柱上的蛋白沖出，每

(20)

個濃度約以 5 ml沖管柱，浪速為 1

mJI7.5

min' 每個音action 收集 1 ml 沖出物。

利用 gel retardation分析 CGG品P 活性出琨的 fraction ⁰

2.

Mono-Q 陰離子交換層析:

將Mono-Q 管柱安裝於FPLC' 先以 1 MNaClτE buffer洗 Mono-Q 管柱，再用 TE buffer平衡，流速為1.0 ml/min 。把細胞核抽取液稀釋5倍，以微量針筒注射至'jFPLC之injector 中，先以 TE buffer洗管柱，接著用 20

ml 0 M

至 1.0

M

NaCl 線性梯度的 TE buffer把吸附在管柱上蛋白沖出，每個 fraction 收集 1 ml 沖出物。利舟 gel retardation分析 CGG-BP 活性出現的企actìon' 或是進行biotinylated

(CGG/CCG)

lO

binding assay

⁰

九、分子篩濾、層折法(Gel品ltration

chromatography)

將 Superdex

HR-200 (size 25

m卜 10-600 kDa)分子篩濾層析管柱安裝 FPLC上，以兩倍管柱體積buffer C平衡，流速為 0.5

ml/min

0 取200μl 細胞核抽取液以徽量針筒注射至.'jHPLC' 收集retention

time 13-32 min

'總共20 管，每管為 0 .5

ml

0 利用 gel retardation分析CGG-BP1i舌性出現的時間，或是進行biotinylated

(CGG/CCG)

lO

binding assay

⁰

(21)

參、結果:

一、 CGG圖BP存在於白血球細胞核抽取液中

為了要比較正常人與易脆X 染色體徵候群病人的 CGG-BP 是否不同，首先我們欲了解在白血球細胞是否存在CGG品p 。利用 gel retardation分析白血球細胞核抽取液中 CGG品P與 (CGG/CCG) 泊的結合，從bandshift 的變化，發現有兩條band 出現，表示有蛋白會與(CGG/CCG)

10

DNA結合(聞(一)

lane 3

,

箭頭 1 與箭頭 2) 。為了分辨何者為專一性結合，分別再以過量之pUC

19

plasmid與cold

(CGG/CCG)

^1ODNA做為競爭物，來進行競爭性反應。結果加了過量之pUC

19

plasmid後，可競爭掉箭頭2 的 band( 圈(一)

lane 2)

，而加了過量之cold

(CGG/CCG)

^1ODNA則可競爭掉猜頭 1 的 band (圖(一)

lane

5) 。證實了箭頭 l 所指才是專一性蛋白 CGG-BP與(CGG/CCG) 1O DNA 結合所形成的 band( 屆(一)

lane

2，5) 。由上述實驗可知CGG-BP存在於白血球細胞核抽取

液中。

二、白血球細胞的 CGG品P 不會和巴甲基化的 (CGG/CCG) 1O DNA結合

因為Rich缸ds 等人從HeLa細胞核抽取液中發現的 CGG-BP' 不會與己甲基化的 (CGG/CCG) 1O DNA結合。所以緊接著我們欲了解在白血球細胞核抽取液中的 CGG-BP 是否亦具相同特性。將已被甲基化的 (CGG/CCG) 10

DNA

做為競爭物，對HeLa細胞及白血球細胞核抽取液中的 CGG品P 進行競爭性

反應。由結果得知，已甲基化的 (CGG/CCG) 1O DNA 會競爭掉 CGG-BP 與 (CGG/CCG)10 的結令(圖(二)比較lane

3

, 7) 。為了證實此結果反應確實是來自於已甲基化(CGG/CCG)1O DNA 的競爭，所以用 Fnu4

HI

(BsoFI) 來將懷疑含有未甲基化的 (CGG/CCG) !O DNA 水解，僅留下甲基化的 (CGG/CCG) 10 DNA' 再做競爭性反應。結呆顯示 CGG-BP與 (CGG/CCG)10 的結令未被競爭掉(圈(二)

lane 4

, 8) 。由此可知，白血球細胞核抽取液中的 CGG-BP與文獻發表之 HeLa 細胞核抽取液中之 CGG-BP 相間，它們不會與甲基化的

(22)

(CGG/CCG)

¹⁰DNA結合。

三、易脆X 染色體徵候群病人和正常人白血球細胞中 CGG闖BP之比較

接下來以相同的分析系統比較易脆X 染色體徵候群病人與正常人白血球細胞中 CGG-BP 是否有差異性。從4個正常人與4個易脆X 染色體徵候群病人的 bandshi說比較，發現其bandshift在高度上均相同(屬(五)

lane

1-4， 4位正常人， lane 弘 8， 4位易脆X 染色體徵候群病人)。再由競爭性反應的結果知，

正常人與易脆 X 染色體徵候群病人的 bandshift 均為專一性的與

(CGG/CCG)

1O DNA結合(圖(四))。所以從gel retardation 的分析可知，病人和正常人CGG-BP 無特別的差異。

接下來比較易脆X 祟色體徵候群病人與正常人的淋巴球細胞株以及白血球細胞的 CGG品P ，結果發現，病人與正常人的淋巴球細胞株之CGG-BP 在 bandshi立的高度上均相同，但卻高於白血球細胞的 CGG品P( 圈(五)

lane 1

,

3) 。由此，使我們懷疑淋巴球細胞株和白血球細胞所表現之CGG-BP 是否不。

舟，還是由於淋巴球細胞受到 EB

V

(Epstein品arr virus)轉型成為細胞株，使的 CGG-BP 的表現發生改變。

四、在各種不同人類細胞株CGG品P 比較

為了排除上述之不同性是來自於淋巴球細胞受到 EBV轉型所造成，所

以我們比較一些其他人類之非EBV轉型細胞株，計有肝癌細胞、肺癌細胞、

腸胃道癌細胞、非轉形細胞等細胞株的 CGG-BP 0 結果顯示癌細胞株的細胞同於淋巴球細胞株所表現的， (圖(六)

lane

1-5 分別為 LZET， Hep站， Hep 3日(Bcl)，

Hep 3B(v-ras 15)

, H460 等癌細胞株，

lane

6 為淋巴球細胞株)。

gingival

fibroblast是初級培養細胞，屬非轉形細胞株，將之CGG-BP與淋巴

球細胞株做比較，則皆有一致bandshift (圈(六)比較lane

9 gingival fibroblåst

,

lane

6 淋巴球細胞株)。似乎可以推瀾 CGG-BP表現的不同性不是來自於EBV

(23)

將淋巴球細胞轉形為細胞株所造成，而是細胞株本質上就表現如此的蛋

白。

為了分辨是否因分裂中與非分裂中細胞的菌素，而造成上述不一致的

CGG-BP 。我們分析了白血球細胞和人類乳房組織細胞的 CGG-BP 與 (CGG/CCG)10結合的 band 0 結果顯示它們的 CGG-BP與(CGG/CCG) 10結合的

band是一致的，並且band表現的高度低於各式細胞株表現的 band( 國(六)lane 10 為 leukocyte， lane 11 為 breast tissue) 。由於白血球細胞和人類乳房組織細胞均處於停止細胞分裂時期且是已分化完全的細胞，因此務測具有分裂中細胞與非分裂中細胞會表現不同的 CGG間BP' 而且可能是兩種不同的 CGG

BP ⁰

由於FMRl 之基因表現具組織專一性，在腦細胞及華丸細胞中被發現大量表現，且主要在神經細胞。而Richards 等人當初之所以決定HeLa細胞作為研究對象，進而從中發現CGG-BP' 是因為以 RT-PCR分析HeLa細胞的叫做 1 基困，發現有站在Rl 的mRNA表現。因此我們將神經瘤細胞和 HeLa細胞的 CGG-BP與(CGG/CCG)IO DNA結合形成的 band和其它細胞株做比較。

結果發現，神經瘤細胞和HeLa細胞的 CGG-BP在反應後表現的 band相似於細胞株的，但不似白血球細胞和人類乳房組織細胞的 band( 圖(六 )lane 7， 8 比較lane 1-5，的， 1 1)。

對於分裂中細胞與非分裂中細胞產生不同 CGG-BP 的結果，讓我們聯想到站在Rl 基因上(CGG/CCG泄的倍增可能發生在DNA進行複製峙，正是細

胞處在cell cycle 的 S期。因此對分裂中細胞的 CGG-BP做研究意義大於對非分裂中細胞的 CGG-BP 0

五、血癌患者血球細胞中 CGG品P bandshift

基於以上實驗結果使我們聯想到血癌患者之血球細胞，因為它們是癌細胞且未分化完全的細胞，讓我們好奇其 CGG-BP與(CGG/CCG) lO DNA結

(24)

合形成的 band如何。茵此自受北榮總醫院獲得血癌患者血液後，進行 gel

retardation分析，結果令人興奮的發現，兩個血癌病人中，有一人的 bandshi位與細胞株是一樣的(圈(七 )lanel ， 2) ，另一病人bandshift則相似於白血球細胞表現的(圈(七)

lane 3

, 4) 。因此懷疑癌症細胞會表現與細胞株一致的 CGG品P ，然而因血癌患者血液得之不易，以及臺北榮總提供意願不高，

由此阻礙這方面進一步求證及探討。

六、科用 gel filtration初步瞭解CGG-BP

native

forrn 的分子量

由於神經瘤細胞和 HeLa 細胞的 CGG-BP 在反應後表現的 bandshift相似，而神經瘤細胞株培養不易，所以我們選擇HeLa細胞株之CGG-BP做為分子組成研究之來源。把HeLa細胞裂成的粗核抽取液通過gel filtration後，

將所收集的 fraction 以 gel retardation 分析 CGG-BP 的活性，結果發現在全action 21 出現CGG品P 活性(園(八)

B)

，將之與標準分子量 Marker 曲線關作

比對(圖(八)A) ，結呆發現， CGG-BP 的 native

forrn

分子量約為 200 kD

a

⁰

七、利用 biotinylated

(CGG/CCG)IO binding

assay進一步

為了瞭解 CGG-BP 之分子組成，我們設計了一段 biotiIiylated

(CGG/CCG)IO DNA

'當 CGG-BP結合至'jbiotinylated

(CGG/CCG)

lO DNA後，

利用 streptavidine-agarose beads 會和 biotin 專一性結合的關餘，便可直接將

CGG-BP 純化出，按著再以 SDS-PAGE 來分析此蛋白之分子組成。當只讓

streptavidine-agarose

為了證明 70及50 kDa蛋白的出現，是因為和 biotinylated

(CGG/CCG)

lO

DNA 專一性結合的結果，所以選用不同的 DNA 取代 biotinylated

(CGG/CCG)

lO DNA作比較。結果發現，使用 biotinylated

ss-(CGG)

lO DNA與

biotinylated ss-(CCG)

lO DNA 皆沒有觀察到任何的 band( 閱(九)

B

,

lane 2

,

3)

,

意味著沒有任何蛋白與這兩條單鏈DNA結令。當 f~

poly-Guanylic agarose

beads作取代峙，結果觀察到一些的 band' 表示poly-Guanylic

agarose beads

與一些未知蛋白進行非專一性結合(圈(九)

B

,

lane

4) 。為了加強 70與50 kD

a

蛋白出現的真實性，我們將上述通過gel

filtration

'證明有 CGG品Pì~舌性反應的 fraction 泣，進行Biotinylated

(CGG/CCG)

lO

binding assay

，結果仍出現了 70和 50 kDa蛋白(國(九)

B

,

lane

5) 。國此將此結果，配合gel filtration 的 200

;也a結果，似乎可以初步認為 CGG-BP 可能由 70和 50 kDa蛋白共向組成。

八、利用 MonoQ 分析 CGG-BP 的分子組成

為了更進一步確定 CGG-BP 可能由 70 、 50 kDa蛋白共同組成，我們將其eLa細胞核粗抽取液通過MonoQ後， J汰。-1.0 MNaCl線性梯度的 Tris

buffer

20

ml將吸附在管柱上的蛋白沖出，把收集的 fraction亦利用 gel retardation分析 CGG-BP 可能出現的企action 0 結果在 fraction 11 和 12 出現CGG-BP 反應(圖 (十)

lane 2

,

3)

，再將它們進行biotinylated

(CGG/CCG)10 binding assay

，結果二個 fraction 皆同時出現70 、 50 kDa的蛋白(簡(十)

lane 5

, 6) 。由此似乎更可確定CGG-BP是由 70與 50 kDa的蛋白共向組成，這是因為 CGG-BP在兩種性質不同的層析管柱分析後，仍能共同出現70與 50 kDa 的蛋白，表示極有可能 70 與 50 kDa 的蛋白彼此在形成複合體情況下，才會共同出現在 gel filtration及MonoQ 的結果。至於lane'5 出現一些 70與 50 kDa以外的蛋白，可能是操做過程沒有洗乾淨。

(26)

九、在 biotinylated

(CGG/CCG)

lO

binding

assay 分析象統比較不同細胞株 CGG國BP 分子組成

根據上述結果，

biotinylated (CGG/CCG)

^lO

binding

assay是可用以分析其它的細胞株中 CGG-BP蛋白分子組成。比較了 lymphocyte 、 glioma

'Hep 3B

十一、 HeLa細胞的 CGG圖BP在 DEA巳52 陰離子交換層析可用 0.25 N NaCl TE

buffer沖出

由於配合實驗進展變化，後來的純化目標放在HeLa細胞內 CGG-BP 。而經由白血球細胞內 CGG-BP 在 DEAE-52 層析結果，猜測 HeLa 細胞的 CGG-BP在DEA巳 52層析有可能亦會在 0.25 N NaCI TE buffer沖出，結果顯示， 0.25 N NaCl TE buffer 以 step by step 方式可以將 CGG-BP 沖出(屬(十四)，

lane 6-8) 。所以在DEAE-52 分析下，認為白血球細胞內 CGG-BP和 HeLa細胞內 CGG-BP 有相似的物理特性。

(28)

肆、討論:

從本實驗中，首先利用 gel retardation 方法比對易脆X 染色體徵候群病人及正常人的白血球細胞核抽取液中的 CGG-BP' 問時比較病人及正常人

的淋巴球細胞株細胞核抽取液的 CGG國BP 0 由 bandshift實驗結果看來，易脆 X 染色體徵候群病人及正常人的 CGG-BP 並無異差，可能的原因是 gel retardation分析的解析度不夠，不足以分辨二者差異，或者是易脆X 染色體徵候群病人及正常人的 CGG-BP 是正常的。

1月 gel retardation對人類細胞株和白血球及乳房組織細胞的 CGG-BP 進行分析，發現在細胞株和白血球及乳房組織細胞於bandshift 的高度上有明顯的差異，細胞株的 bandshift 高於白血球及乳房組織細胞。比二者細胞之所以不向的原函，可能在於細胞株是正分裂中細胞，而白血球及乳房組織

細胞是非分裂且已是分化完全的細胞，由此似乎意味著分裂中與非分裂中

細胞可能有不同的 CGG圖BP 。如果這個推測是正確的，這二種CGG-BP之間的關餘，可能是(1) 來自相同基自產物，但彼此進行了不同的轉譯後修飾。

(2)相向基因產物，茵不同細胞階段需要，彼此和不同蛋白做交互作用， (3)

成者是基因進行不同的剪裁(splcing) ，產生不同蛋白。 (4) 來自不相同基因產物，完全兩種不相同的蛋白。因細胞株處於分裂中，此時出現在細胞株

的 bindingprotein '可能是因應細胞分裂時所需的蛋白。不同於存在白血球及乳房組織細胞的 binding protein 。

在圈(二)白血球細胞的 CGG品P 不會和己甲基化的 (CGG/CCG)IO DNA

結合的實驗中，由結果看來，白血球細胞的 CGG-BP 的確不會與己甲基化的 (CGG/CCG) lO DNA結合。然而仍有一爭議之處，是當初設計實驗時無用詳考量到， ~r;是未事先確定 (CGG/CCG) lO DNA 是否已完全甲基化，因此產

生圈(二 )lane 3 、 4 、 7 、 8 的結果，或許是來自於 CGG-BP 和未甲基化

(29)

(CGG/CCG)^lODNA 的結合。故為了慎重起見，此實驗需要再次重做，並事先確定 (CGG/CCG) lO DNA是否已完全甲基化。

從 HeLa細胞株核抽取液在 gel filtration 分析的結果，發現 CGG-BP 的

native

form可能是200 kDa 。配合biotinylated (CGG/CCG)lO

affinity binding

assay方法，在 SDS-PAGE分析後，出現50和 70 kDa蛋白，猜測 CGG-BP可能是一個複合體結合蛋白，且由 50和 70 kDa所共同組成。Aharoni 等人(1 993) 最近發現一個會專一性與ss-d(GA)n及 d(GT)n結合的 DNA 結合蛋白，經由

glycerol gradient centrifugation

1ì 析其分子量，發現此蛋白分子量為 190

kD

a ' UV

cross-linking實驗證明只有 33.6 kDa蛋白會與d(GA)n及 d(GT)n結合。 Y

ano-

Yanagisawa 等人(1 995) 自老鼠腦細胞純化出一個路-DNA 結令蛋白，其會辨認ss-(AGC)n 、 (AGT)n 、 (GGC)n 、 (GGT)n' 但是不會和 (GAC)n 、 (AAC)n 、 (AAT)n及ds-(AGC/GCT)n 等 DNA結合。這個蛋白是由兩倍蛋白組成，分別為 TRIP丹 (44kDa) 與T即P-2(40kDa) 。歸納上述的研究，讓我們聯想到會與 dinuc1eotide和trinuc1eotide 的 DNA結合蛋白，至少是由兩個蛋白分子組成，其中一個組成蛋白可能會直接和 DNA結令，另一個組成蛋白則會和 DNA蛋白複合體結合，或者與DNA結合，加強專一性DNA蛋白複合體的穩定性。

在本實驗所研究的細胞株中，除了發現HeLa細胞株的 CGG-BP有 50與

70

kDa 組合模式外，

lyrnphocyte

、 gliorna 、 Hep 3B 具有與 HeLa 細胞株的 CGG-BP相同的蛋白分子組成。而 gingival

fibroblast

、 H460 及HUVEC 細胞株則由 50與38 kDa蛋白組合。而在UASMC 細胞株是由 50 與31 kDa蛋白組合的 CGG-BP 。這樣的結果使我們懷疑，這些不同的結合蛋白是因為具組織特異性，造成不同細胞株產生不同的 CGG蝠BP 。而 50 kD a蛋白在所有被實驗細胞株皆共同出現，所以認為此蛋白與ds-(CGG/CCG)n DNA 的結合扮演重

(30)

要角色功能。而組織專一性蛋白 (70，

31

,

38

kDa) 會調節 CGG團BP 對缸"

(CGG/CCG)n結合的專一性。

對於以上的實驗結果，或許仍有符把CGG-BP純化出後，對其做進一步研究，才能完全肯定比蛋白是一個複合體的組成，以及真正的組成成份。

進而從基區的選殖到製成抗體後，利用兔疫方法，方可分辨 CGG品P 是否

具組織特異性。但是， Deissler 等人(1 996) 已先從HeLa細胞核抽取液純化出一館會與 ds-(CGG)17專一性結合的核蛋白，他們發現此蛋白的分子量為 20

kDa' 這與我們發現的 CGG-BP大大相異。然而 Deissler 等人的實驗反應條件及使用的 (CGG)n DNA 重複次數與我們皆不盡相同，而且根據我們對此實驗的經驗，發現鹽濃度的差異，也會影響細胞核抽取液中的核蛋白與

(CGG/CCG)

lO DNA結合。或許是諸多因素的結果，使的我們的實驗結果與

Deissler 等人的結果不同，也或許意味著同時有二種以上CGG-BP存在，而此些猜測則就有符進一步求證。

目前對F恥依1 基因上 (CGG/CCG)n 重複序列遞增的假說有二餌'(1)在細胞分裂時，眉不平等互換 (unequal

cross

over) 造成 (CGG) 的遞增 (Obe巾，

1991)( 附閻三 (A)) ，假設雖然合理，但未經相闊的實驗證明，且對於帶困

者由 200 次(CGG/CCG)n 重複序列致使其子代(CGG/CCG)n 重複序列突變成 1000次以上，似乎不易解釋(Ross

et a

l.,

1993)

，同時隨著在易脆X染色體徵候群病人中發現了創立者染色體，因此對此假說已漸不支持。所以目前較傾向第二個理論，就是滑動(slipping)理論。三間宜。1， 1993)( 附國三個)) ，即在 DNA複製時其pnmer 或template strand形成二級結構，若發生於pnmer 尚未被修復，則會延長合成的 DNA ，若發生於template strand 尚未被修復，則會縮短合成的 DNA 。現已有實驗證明在 in vitro 中， tJ..E. coli 的 polymerase與

short

primers作用，引起di-和 trinucleotide 重複序列的遠增。同時在 m VIVO 實驗，當 (CTG)n 的 leading strand產生二級結構，會讓CTG 重複序列增加，若

(31)

二級結構發生在lagging

strand

'會讓CTG 重複序列減短(Kang

et a

l., 1995) 。近來已發現trinucleotide repeat 會形成二級結構(Gacy

et

泣，

1995)

，而 DNA

strand

slippage與二級結構有關，似乎說明 trinucleotide 重複序列的增加可能與滑動理論有闕，但以上二個實驗均在原核生物系統下進行，不能完全應用在真核細胞，因此仍有待進一步發現。不過，若滑動理論假說成立，不禁令人聯想，當 trinucleotide repeat形成二級結構峙，則 CGG品P 是否會結合到二級結構，而加速trinucleotide 重複序列遞增或是抑制作用，也處許在此過程不具任合作用。雖然至今仍少有文獻報告(CGG/CCG)n 重稜序列遞增國崇可能來自 trans-acting作用，即主要來自蛋白影響。雖如此，仍不能否認 CGG-BP存在的意義，或許具有未被發現的功能，而這就有符更進一步的探索。

(32)

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(37)

NE( μ1) - 4 4 15 15 competitorpUC - - cold 1 2 3 4 5

1一艙帳棚

2一扭轉

閱(一)、 CGG 儡 BP 存在於白血球細胞核抽取液中。利用 gel

retardation 方法， 32p(CGG/CCG)10 做為 probe '進行競爭性反

應。 1ane 1. 沒有加細胞核抽取液， lane 2 、 3 加 4μl 細胞核抽取液，但 lane 2 另含過量 pUC 19 plasmid 做為競爭物， 1 ane 4 、 5 加的 μ1 細胞核抽取液，但 Iane 5 加入過量 cold (CGG/CCG)10

做為競爭物。

(38)

3

ieukocyte

co姆拉GG/CCG) 10 個

+ -

M (CGG/CCG) 10 闖闖關卡開蘊酹就叫師 (CGG/CCG) 10 個闖闖

+

HeLA

間重?

輔+斗!酬

1 2 3 4 5 6 7 8

'-'鶴嗯，一珊嘲頤嘲罵.，--…w 珊珊F 嗯，闢F 嘲輛輛F 嘲--一

國(二)、以 gel retardation 分析白血球細胞的 CGG-BP 和已甲基化的 (CGG/CCG) lO DNA 結合反應。 DNA 結合反應罔聞 (一)， lane 1-4 為白血球細胞核抽取液， lane 5-8 為 HeLa 細胞核抽取液。競爭物為 co 1 吐 (CGG/CCG)IO 、 methyl “ (CGG/CCG)IO 、 Fun4HI digest methyl 刊 CGG/CCG)10 ⁰ "+"表示有 11 ft 表示無。

(39)

E

fs侃了 -8

…ma

叫… A也峙， 6

些

2 m-3

闢(五)、以 gel retardàtion 分析病人和正常人白血球細胞中

CGG-Bpo DNA 結合反應用圖(一)， lane 卜 4 為 4 個正常人 lane 5-8 為 4 偶有 fragile X sÌte 的易脆X 染色體徵候群病人，各取 10 I-Ll

白血細球胞核抽取液進行 gel retardation 反應。

(40)

NormaPatient

pUC 一+…+一+二...::t.

12γ守了67志一

國(四)、以 gel retardation 進行競爭性反應，比較正常人與易脆X 黛色體徵候群病人的 CGG-BP ⁰ DNA 結合反應周圍(一) ，取

1 5 111 白血細胞核抽取液，加入過量 pUC 19 plasmid 當做競爭物，進行競爭反應。 lane 1-4 分別是正常人的白血球細胞核

抽取液， lane 5 心分別是易脆X 染色體徵候群病人的白血球細胞核

抽取液。 lane 2 、 4 、 6 、 8 加入過量 pUC 19 plasmid 做為競爭物。

(41)

1 2 3

1 、紛州 p

Q;

JP

~

聞(1i. )、以 gel retardation 分析正常人與 fragile X syndrome

病人的淋巴球細胞株細胞核抽取液 CGG-BP ⁰ DNA 結合反應罔聞(一 )'lanel 為易脆X 染色體徵候群病人淋巴球細胞株， lane 2

為正常人淋巴球細胞株， lane 3 為正常人白血球細胞。取淋巴球細胞株細胞核抽取液 10 叭，白血球細胞核抽取液 10 叭，

加入 0.1μg salmon sperm DNA 進行競爭性反應。

(42)

海

Aι哥叫，2aN-r自一J『1￠分。于心puFI

呻吟、可 i

、心的時

~shw9 J哼8一

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hFSVF呵4hhvw恥之一一，令5-ht ，dhwbE可

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句fM 1J

臨包醇

轉撞撞

聞(六)、比較不同人類細胞株 CGG “ BP ⁰ gel retardation 方法分析下列細胞株的細胞核抽取液， DNA 結合反應向圈(一)。

lane 1 為 LZET (gastrointestinal carcinoma)' lane 2 為 Hep 3B ' lane 3 為 Hep 3B(Bcl)

,

lane 4 為 Hep 3B(v-ras 15)

,

lane 5 為日 460 ， lane 6 為 lymphocy 峙， 1 ane 7 為 glioma ， lane 8 為 HeLa'

lane 9 為 gingival fibrobla 仗， lane 10 為 leukocy 悅 'lane 11 為

breast ti 凹的。 lane 卜 9 取 10 I.d 細胞核抽取物， lane 10 幽 1 1 取的 μi 細胞核抽取物。加入 0.1μg salmon sperm ^{DNA 以 gel}

retardation 方法進行競爭性反應。