參、結果:

一、 CGG圖BP存在於白血球細胞核抽取液中

為了要比較正常人與易脆X 染色體徵候群病人的 CGG-BP 是否不同，首 先我們欲了解在白血球細胞是否存在CGG品p 。利用 gel retardation分析白血 球細胞核抽取液中 CGG品P與 (CGG/CCG) 泊的結合，從bandshift 的變化，發 現有兩條band 出現，表示有蛋白會與(CGG/CCG)

10

DNA結合(聞(一)

lane 3

,

箭頭 1 與箭頭 2) 。為了分辨何者為專一性結合，分別再以過量之pUC

19

plasmid與cold

(CGG/CCG)

^1O DNA做為競爭物，來進行競爭性反應。結果加 了過量之pUC

19

plasmid後，可競爭掉箭頭2 的 band( 圈(一)

lane 2)

，而加了 DNA' 再做競爭性反應。結呆顯示 CGG-BP與 (CGG/CCG)10 的結令未被競爭 掉(圈(二)

lane 4

, 8) 。由此可知，白血球細胞核抽取液中的 CGG-BP與文獻 發表之 HeLa 細胞核抽取液中之 CGG-BP 相間，它們不會與甲基化的

(CGG/CCG)

¹⁰ DNA結合。

三、易脆X 染色體徵候群病人和正常人白血球細胞中 CGG闖BP之比較

接下來以相同的分析系統比較易脆X 染色體徵候群病人與正常人白血 球細胞中 CGG-BP 是否有差異性。從4個正常人與4個易脆X 染色體徵候群病 人的 bandshi說比較，發現其bandshift在高度上均相同(屬(五)

lane

1-4， 4位正 常人， lane 弘 8， 4位易脆X 染色體徵候群病人)。再由競爭性反應的結果知，

正常人與易脆 X 染色體徵候群病人的 bandshift 均為專一性的與

(CGG/CCG)

1O DNA結合(圖(四))。所以從gel retardation 的分析可知，病人和 正常人CGG-BP 無特別的差異。

接下來比較易脆X 祟色體徵候群病人與正常人的淋巴球細胞株以及白 血球細胞的 CGG品P ，結果發現，病人與正常人的淋巴球細胞株之CGG-BP 在 bandshi立的高度上均相同，但卻高於白血球細胞的 CGG品P( 圈(五)

lane 1

,

3) 。由此，使我們懷疑淋巴球細胞株和白血球細胞所表現之CGG-BP 是否不。

舟，還是由於淋巴球細胞受到 EB

V

(Epstein品arr virus)轉型成為細胞株，使 的 CGG-BP 的表現發生改變。

四、在各種不同人類細胞株CGG品P 比較

為了排除上述之不同性是來自於淋巴球細胞受到 EBV轉型所造成，所

以我們比較一些其他人類之非EBV轉型細胞株，計有肝癌細胞、肺癌細胞、

腸胃道癌細胞、非轉形細胞等細胞株的 CGG-BP 0 結果顯示癌細胞株的細 胞同於淋巴球細胞株所表現的， (圖(六)

lane

1-5 分別為 LZET， Hep站， Hep 3日(Bcl)，

Hep 3B(v-ras 15)

, H460 等癌細胞株，

lane

6 為淋巴球細胞株)。

gingival

fibroblast是初級培養細胞，屬非轉形細胞株，將之CGG-BP與淋巴

球細胞株做比較，則皆有一致bandshift (圈(六)比較lane

9 gingival fibroblåst

,

lane

6 淋巴球細胞株)。似乎可以推瀾 CGG-BP表現的不同性不是來自於EBV

將淋巴球細胞轉形為細胞株所造成，而是細胞株本質上就表現如此的蛋

白。

為了分辨是否因分裂中與非分裂中細胞的菌素，而造成上述不一致的

CGG-BP 。我們分析了白血球細胞和人類乳房組織細胞的 CGG-BP 與 (CGG/CCG)10結合的 band 0 結果顯示它們的 CGG-BP與(CGG/CCG) 10結合的

band是一致的，並且band表現的高度低於各式細胞株表現的 band( 國(六)lane

胞處在cell cycle 的 S期。因此對分裂中細胞的 CGG-BP做研究意義大於對非 分裂中細胞的 CGG-BP 0

五、血癌患者血球細胞中 CGG品P bandshift

基於以上實驗結果使我們聯想到血癌患者之血球細胞，因為它們是癌 細胞且未分化完全的細胞，讓我們好奇其 CGG-BP與(CGG/CCG) lO DNA結

合形成的 band如何。茵此自受北榮總醫院獲得血癌患者血液後，進行 gel

retardation分析，結果令人興奮的發現，兩個血癌病人中，有一人的 bandshi位 與細胞株是一樣的(圈(七 )lanel ， 2) ，另一病人bandshift則相似於白血球細 胞表現的(圈(七)

lane 3

, 4) 。因此懷疑癌症細胞會表現與細胞株一致的 CGG品P ，然而因血癌患者血液得之不易，以及臺北榮總提供意願不高，

由此阻礙這方面進一步求證及探討。

六、科用 gel filtration初步瞭解CGG-BP

native

forrn 的分子量

由於神經瘤細胞和 HeLa 細胞的 CGG-BP 在反應後表現的 bandshift相 似，而神經瘤細胞株培養不易，所以我們選擇HeLa細胞株之CGG-BP做為 分子組成研究之來源。把HeLa細胞裂成的粗核抽取液通過gel filtration後，

將所收集的 fraction 以 gel retardation 分析 CGG-BP 的活性，結果發現在 全action 21 出現CGG品P 活性(園(八)

B)

，將之與標準分子量 Marker 曲線關作

比對(圖(八)A) ，結呆發現， CGG-BP 的 native

forrn

分子量約為 200 kD

a

⁰

七、利用 biotinylated

(CGG/CCG)IO binding

assay進一步

為了瞭解 CGG-BP 之分子組成，我們設計了一段 biotiIiylated

(CGG/CCG)IO DNA

'當 CGG-BP結合至'jbiotinylated

(CGG/CCG)

lO DNA後，

利用 streptavidine-agarose beads 會和 biotin 專一性結合的關餘，便可直接將

CGG-BP 純化出，按著再以 SDS-PAGE 來分析此蛋白之分子組成。當只讓

streptavidine-agarose

beads與細胞核抽取液進行反應時，只觀察到一些微弱

的 band( 閱(九)

A

,

lane

2) 。在沒有加上細胞核抽取液，只有 biotinylated

(CGG/CCG)

lO DNA和 streptavidine-agarose beads 進行反應，則沒有觀察到任 何band( 島(九)

A

,

lane 4)

，表示 biotin和 streptavidine 不會干擾此系統的分 析。在細胞核抽取液和 biotinylated

(CGG/CCG)IO

DNA 及 streptavidir時間

agarose

beads 同時出現時，結果出現3條顯而易見的 band; 估計其分子量分

別為 70 、 58 、 50 kD

a

'然而 58 kDa表現強度不及70與 50 kDa( 屆(九)

A

,

lane

3) 。

為了證明 70及50 kDa蛋白的出現，是因為和 biotinylated

(CGG/CCG)

lO

DNA 專一性結合的結果，所以選用不同的 DNA 取代 biotinylated

(CGG/CCG)

lO DNA作比較。結果發現，使用 biotinylated

ss-(CGG)

lO DNA與

biotinylated ss-(CCG)

lO DNA 皆沒有觀察到任何的 band( 閱(九)

B

,

lane 2

,

3)

,

意味著沒有任何蛋白與這兩條單鏈DNA結令。當 f~

poly-Guanylic agarose

beads作取代峙，結果觀察到一些的 band' 表示poly-Guanylic

agarose beads

與一些未知蛋白進行非專一性結合(圈(九)

B

,

lane

4) 。為了加強 70與50 kD

a

蛋白出現的真實性，我們將上述通過gel

filtration

'證明有 CGG品Pì~舌性反 應的 fraction 泣，進行Biotinylated

(CGG/CCG)

lO

binding assay

，結果仍出現 了 70和 50 kDa蛋白(國(九)

B

,

lane

5) 。國此將此結果，配合gel filtration 的 200

;也a結果，似乎可以初步認為 CGG-BP 可能由 70和 50 kDa蛋白共向組成。

八、利用 MonoQ 分析 CGG-BP 的分子組成

為了更進一步確定 CGG-BP 可能由 70 、 50 kDa蛋白共同組成，我們將 其eLa細胞核粗抽取液通過MonoQ後， J汰。-1.0 MNaCl線性梯度的 Tris

buffer

20

ml將吸附在管柱上的蛋白沖出，把收集的 fraction亦利用 gel retardation分 析 CGG-BP 可能出現的企action 0 結果在 fraction 11 和 12 出現CGG-BP 反應(圖 (十)

lane 2

,

3)

，再將它們進行biotinylated

(CGG/CCG)10 binding assay

，結果 二個 fraction 皆同時出現70 、 50 kDa的蛋白(簡(十)

lane 5

, 6) 。由此似乎更可 確定CGG-BP是由 70與 50 kDa的蛋白共向組成，這是因為 CGG-BP在兩種性 質不同的層析管柱分析後，仍能共同出現70與 50 kDa 的蛋白，表示極有可 能 70 與 50 kDa 的蛋白彼此在形成複合體情況下，才會共同出現在 gel filtration及MonoQ 的結果。至於lane'5 出現一些 70與 50 kDa以外的蛋白，可 能是操做過程沒有洗乾淨。

九、在 biotinylated

(CGG/CCG)

lO

binding

assay 分析象統比較不同細胞株 CGG國BP 分子組成

根據上述結果，

biotinylated (CGG/CCG)

^lO

binding

assay是可用以分析 其它的細胞株中 CGG-BP蛋白分子組成。比較了 lymphocyte 、 glioma

'Hep 3B

等細胞株的 CGG-BP 組成，它們均和 HeLa細胞的 CGG-BP 一致，同時出現 70 、 50 kDa的蛋白(園(十一)

A

,

lane

1-3 ，圈(十一)

C

,

lane

2) 。而令人戚到有 趣的發現走，

gingival

fibroblast與H460及HUVEC 出現50 、 38 kDa的蛋白組 成(園(十一)

B

,

lane

1 丑，圖(十一)

C

,

lane 3)

⁰ UASMC 則呈現鉤，

31

kDa蛋 白(圖(十一)

C

,

lane

4) 。綜合以上結果，

50

kDa 的蛋白可能是所有細胞株所 共有的，包括癌細胞株跟轉形細胞株與非轉形細胞株，且癌細胞株跟轉形 細胞株CGG-BP似乎較偏向 70 、 50 kDa 的蛋白組合，雖然 H460肺癌細胞株 例外，而非轉形細胞株CGG品P除了 50 與 38 kDa組合外還有 50跟31 kD

a

0 以 此蛋白不同組合的層面觀來，似乎可以肯定 CGG品P 的組成有兩種以上，

或是還有其它兩種以上不同的 CGG品p 。

十、白血球細胞內 CGG-BP在DEA巳 52陰離子交換層析可用。.25

NNaCl TE

buffer沖出

實驗初期預定的目標是希望從白血球細胞核抽取物中將 CGG-BP 純化 出，進而對之做研究。所以取自新鮮血液的 buffy coat層製備成核抽取液，

通過DEAE-52

chromatography

，用含有 0.25

N NaCl TE

buffer沖掉吸的在管 拉上蛋白，利用 gel retardation分析 CGG-BP 活性。結果發現在 0.25

N NaCl

沖出的 fraction 中有蛋白具有與(CGG/CCG)10結合的活性(國(十二)

lane 7

,

8

務頭 1) ，但比原液多出一條band( 國(十二)

lane 8

, 9 箭頭 3) ，在 flow 也rough 亦出現一條band( 圖(十二)

lane5

, 6 箭頭 2) 。籍由競爭性反應試驗證明(國(十 五))在(圈十二)中箭頭2與箭頭 3 所持的 band為非專一性結合。

十一、 HeLa細胞的 CGG圖BP在 DEA巳52 陰離子交換層析可用 0.25 N NaCl TE

buffer沖出

由於配合實驗進展變化，後來的純化目標放在HeLa細胞內 CGG-BP 。 而經由白血球細胞內 CGG-BP 在 DEAE-52 層析結果，猜測 HeLa 細胞的 CGG-BP在DEA巳 52層析有可能亦會在 0.25 N NaCI TE buffer沖出，結果顯 示， 0.25 N NaCl TE buffer 以 step by step 方式可以將 CGG-BP 沖出(屬(十四)，

lane 6-8) 。所以在DEAE-52 分析下，認為白血球細胞內 CGG-BP和 HeLa細胞 內 CGG-BP 有相似的物理特性。

肆、討論:

從本實驗中，首先利用 gel retardation 方法比對易脆X 染色體徵候群病 人及正常人的白血球細胞核抽取液中的 CGG-BP' 問時比較病人及正常人

的淋巴球細胞株細胞核抽取液的 CGG國BP 0 由 bandshift實驗結果看來，易脆 X 染色體徵候群病人及正常人的 CGG-BP 並無異差，可能的原因是 gel retardation分析的解析度不夠，不足以分辨二者差異，或者是易脆X 染色體 徵候群病人及正常人的 CGG-BP 是正常的。

1月 gel retardation對人類細胞株和白血球及乳房組織細胞的 CGG-BP 進 行分析，發現在細胞株和白血球及乳房組織細胞於bandshift 的高度上有明 顯的差異，細胞株的 bandshift 高於白血球及乳房組織細胞。比二者細胞之 所以不向的原函，可能在於細胞株是正分裂中細胞，而白血球及乳房組織

細胞是非分裂且已是分化完全的細胞，由此似乎意味著分裂中與非分裂中

細胞可能有不同的 CGG圖BP 。如果這個推測是正確的，這二種CGG-BP之間 的關餘，可能是(1) 來自相同基自產物，但彼此進行了不同的轉譯後修飾。

(2)相向基因產物，茵不同細胞階段需要，彼此和不同蛋白做交互作用， (3)

成者是基因進行不同的剪裁(splcing) ，產生不同蛋白。 (4) 來自不相同基因 產物，完全兩種不相同的蛋白。因細胞株處於分裂中，此時出現在細胞株

的 bindingprotein '可能是因應細胞分裂時所需的蛋白。不同於存在白血球 及乳房組織細胞的 binding protein 。

在圈(二)白血球細胞的 CGG品P 不會和己甲基化的 (CGG/CCG)IO DNA

結合的實驗中，由結果看來，白血球細胞的 CGG-BP 的確不會與己甲基化 的 (CGG/CCG) lO DNA結合。然而仍有一爭議之處，是當初設計實驗時無用 詳考量到， ~r;是未事先確定 (CGG/CCG) lO DNA 是否已完全甲基化，因此產

生圈(二 )lane 3 、 4 、 7 、 8 的結果，或許是來自於 CGG-BP 和未甲基化

(CGG/CCG)^lO DNA 的結合。故為了慎重起見，此實驗需要再次重做，並事

(CGG/CCG)^lO DNA 的結合。故為了慎重起見，此實驗需要再次重做，並事

在文檔中 翩翩 (頁 21-32)