利用乳酸菌

國立臺東大學生命科學系碩士班

Department of Life Science National Taitung University

碩士論文

Master Dissertation 指導教授 : 黃祥恩博士 Advisor : Dr. Hsiang-En Huang

利用乳酸菌 Lactobacillus paracasei 發 酵液促進植物生長及增加生物性與非生

物性逆境抵抗能力

Increasing plant growth and resistance to biotic and abiotic stresses by fermented broth of

Lactobacillus paracasei

研究生：許育仁撰

Graduate student：Yu-jen Hsu

中華民國 一百零六 年七月

July, 2017

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謝誌

碩士班訓練終於到了尾聲，當初剛進實驗室我還只是個什麼都不清楚只是跟 著學長姐跑田野調查的小學弟，到帶領學弟做實驗的大學長。在這個的過程中感 謝有 黃祥恩 老師在一旁辛勤的執導，讓我在做實驗的目的上有更加清楚的了解，

並且在我夾在實驗與課業之間，忙得一團亂的時候，提供了非常實用的時間管理 建議，在此特別感謝老師在課業上與實驗上的指導，此外也感謝老師這兩年來讓 我有許多機會能夠參與校內與校外的學術研討會，並且訓練我有勇氣站在台上演 講，將我們的研究成果分享給大家了解，最後再次感謝老師在我不成熟的論文寫 作上，痛苦的修改到還能讓人懂得的內容，此外也十分感謝老師在兩年來除了實 驗與課業，在人際關係處裡上給了很多建議也提醒了我的缺失，也感謝老師提供 國科會計畫與校外計畫申請經費的中給予工讀金，讓我在生活上擁有安穩舒適的 校園生活。

碩士班訓練的尾聲中，感謝 林乃君 與 葛孟杰 老師在暑假的期間，特別坐 上漫途的火車來到台東，聽著我兩年來的研究成果，並且修改我那過於簡略的中 文說明與不是英文的英文論文內容，並且不辭辛勞的在旁註解需要修改的地方，

讓我有機會把讓人看不懂的文字修正好。此外感謝系主任 李俊霖 老師找到資金 填補缺乏資源的生科系，並且在這兩年中處理系上跳電、滅菌釜、製冰機等儀器 故障與維修，讓我能在這麼多危機中平安渡過並且完成實驗。最後格外感謝系上 行政助理 蘇怡菁 學姐，協助我在口頭考詴申請時需要準備哪些資料，並且讓我

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能順利畢業。還有感謝景岳生技公司提供實驗材料與經費，及黃翠尹 學姊總是 能快速地將實驗材料寄過來與每周督促我實驗進度。

碩士班研究的過程中非常感謝 陳俊任 學弟，協助我在實驗過程中，提醒並 幫修改不合理的實驗設計，還有在大太陽底下辛苦的幫忙田間詴驗，此外還要感 謝已畢業的學長姐在實驗技術與課業上的幫忙，以及協助我實驗完成。感謝家人 在碩士班兩年來的支持，讓我在研究中不用擔心生活物資上的缺乏，使得我在研 究中能專心一致，並且順利完成碩士學位，最後再次感謝兩年碩士生涯的家人、

師長、學長姐、同學與學弟妹一路上的幫忙扶持，在未來的生活裡祝福大家平安 喜樂。

許育仁謹誌 106 年于臺東大學

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利用乳酸菌 Lactobacillus paracasei 發 酵液促進植物生長及增加生物性與非生

物性逆境抵抗能力

學生：許育仁

國立台東大學生命科學系 (所)

中文摘要

乳酸菌被認為具有一般環境及食用安全的微生物 (Generally Recognized as Safe (GRAS)，在乳酸菌生產過程中常會伴隨大量廢棄 的發酵液，本研究為落實「搖籃到搖籃」(Cradle to Cradle) 的理念，

將景岳生技公司提供的乳酸菌 Lactobacillus paracasei 發酵液 (No-2) 施用於農作物。檢測其對於環境逆境抵抗能力、根圈微生物族群數量、

病原菌抵抗能力及作物生長的影響。實驗結果顯示，No-2 能夠有效

提升番茄體內過氧化酵素 (peroxidase, POD) 的活性、過氧化氫

(Hydrogen peroxide, H

2

O

2

) 的累積量，同時也會增加細胞膜上的離子

滲漏度，提升 JA 相關抗性標記基因 LeOPR3 、 LeCOI1 與 LeJAZ1 及

SA 相關抗性標記基因 LePR1 的表現量，若將 No-2 經高溫處理後

(Heat-No-2)，也能同時誘導 JA 相關抗性標記基因 LeOPR3 、 LeCOI1

與 LeJAZ1 及 SA 相關抗性標記基因 LePR1 的表現量。此外 No-2 也

能直接抑制炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides 病原菌菌絲生長

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及孢子發芽能力，增強番茄對於炭疽病菌 C. gloeosporioides 的抵抗能 力。環境逆境部分，No-2 能提升番茄幼苗對於 UV-C、高溫及缺水逆 境的耐受能力。No-2 也可以幫助番茄根部維持土壤根圈細菌 Bacillus thuringiensis (HS1) 及 B. amyloliquefaciens (HS3) 的族群數量。在田

間詴驗，結果發現單獨處裡 No-2 能促進番茄植株高度及葉片數，而 Heat-No-2 只能增加植株高度。除了番茄，No-2 也可以增加水稻分糵 數、稻梗長度和稻梗數、洋香瓜的花朵及果實數及番荔枝果實的產量。

但是單獨處裡 No-2 對於番荔枝的田間病害防治效果卻不明顯，但是 如果混合 B. thuringiensis (HS1) 及 B. amyloliquefaciens (HS3) 及鈣離 子之後則具有降低病害的能力，且依然可以維持增加釋迦果實產量的 能力。綜合上訴的研究結果顯示，乳酸菌發酵液 No-2 在正常劑量下 能經由促進植物體內 H

2

O

2

含量、POD 活性誘導抗性基因表現及增加 根部微生物族群數量，等多重方式來同時達到保護植物及提升作物產 量的雙重目標。

關鍵詞 : 乳酸菌 Lactobacillus paracasei 發酵液、生物性逆境、非生物性逆境、

植物生長

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Increasing plant growth and resistance to biotic and abiotic stresses by fermented broth of Lactobacillus paracasei

Author : Yu-jen Hsu

Department of Life Science National Taitung University

Abstract

Plants are often unable to take into account the increase in yield and resistance to stress in the field farming environment.This experiment was applied to crops in the general environment and food safety microbes (Generally recognizedized as Safe (GRAS) microbial lactic acid bacteria Lactobacillus paracasei fermentation broth (No-2).And to detect its effect on adversity resistance, number of rhizosphere microbial

population, pathogen resistance and crop growth.The results showed that No-2 could increase the activity of peroxidase (POD), the accumulation of hydrogen peroxide (H

2

O

2

), and increase the ion permeability on the cell membrane. The expression of LeOPR3, LeCOI1 and LeJAZ1 and LeJAZ1 and SA-related resistance marker gene LePR1 were detected by heat-No2, and the JA-related resistance marker LeOPR3, LeCOI1 and LeJAZ1 and SA-related resistance marker gene LePR1. In addition, No-2 can directly inhibit the growth and spore germination ability of pathogens such as Colletotrichum gloeosporioides, and enhance the resistance of tomato to C. gloeosporioides.The ability to enhance the tolerance of tomato seedlings to UV-C, high temperature and water stress can also help the roots of tomato roots to maintain the number of Bacillus

thuringiensis (HS1) and B. amyloliquefaciens (HS3) populations.In field

vi

trials, it was found that No-2 alone could promote tomato plant height and leaf number, while Heat-No2 could only increase plant height. It is also possible to increase the number of rice, the length of rice stem and the number of rice stem, the number of flowers and fruits of yang melon and the yield of Annona fruit.However, the effect of No-2 on the field disease of Annona lucidum was not obvious, but it was not only possible to reduce the disease after mixing B. thuringiensis (HS1) and B.

amyloliquefaciens (HS3) and calcium Maintain the ability to increase the yield of Sakya fruit.The results of the comprehensive appellations show that the lactic acid bacteria fermentation broth No-2 can induce the resistance gene expression by increasing the content of H

2

O

2

and POD activity in the plant, increase the number of root microbial populations, and so on to protect the plant and raise the crop The dual goal of

production.

Keywords : lactic acid bacteria Lactobacillus paracasei fermentation broth,

biotic stress, abiotic stress, plant growth

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目錄

謝誌………i

中文摘要………ii

英文摘要………..v

圖目錄………...xi

第一章、 前言………...1

第一節、 乳酸菌………...1

第二節、 根 圈 微 生 物 對 植 物 的 影 響… … … 2

一.

根 圈 微 生 物 對 植 物 生 長 之 案 例……… .…2

二.

根圈微生物誘導植物抵抗病原抗性機制

….

………..4

第三節、 根 圈 微 生 物 對 植 物 抵 抗 逆 境 影 響……… .5

一.

根圈微生物對植物抵抗高溫之影響………..5

二.

根圈微生物對植物抵抗乾旱之影響……….6

三.

根圈微生物對植物抵抗炭疽病菌之影響………..………7

四.

根圈微生物對植物抵抗 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 之影響……… …....……8

五.

根圈微生 物對 植物抵 抗青枯病 菌之 影響

…

……….9

六.

乳酸菌對植物病原菌之影響……… ………….. .10

第四節、 研究動機與目的………10

第二章、 材料方法………..………12

第一節、 實驗材料………..…..………12

一.

植株材料與培養條件………..12

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液………12

三.

微生物材料與培養條件………13

第二節、 實驗方法………13

viii

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對植株生長測詴……..….……….14

二.

植株病害接種………....………..14

三.

細菌在根纏聚檢測方法……….………..…...15

四.

即時聚合酶鏈鎖反應 (Quantitative real time polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)………..16

五.

植株體內過氧化氫含量檢測………..16

六.

過氧化氫酶檢測………..……17

七.

細胞膜離子滲漏檢測………..17

八.

環境逆境處理方法及損傷分級判斷標準……….18

九.

真菌孢子發芽率檢測

………

……….18

十.

統計方法……….19

第三章、 結果………..20

第一節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液對植株生長之影響………20

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液促進番茄生長……….……20

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對其他作物生長之影響………20

第二節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液促進番茄根部 Bacillus 屬細菌殘存能 力………....21

第三節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄體內過氧化物調控…………22

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液增加番茄 H₂O₂ 累積………22

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液提高番茄 POD 的活性………23

三.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液使番茄葉片離子通透提高…………23

ix

第四節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄植株抵抗環境逆境能力…….24

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液可以降低番茄植株因 UV-C 造成的損 傷……….24

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液能提升植物耐熱能力乳酸菌……….25

三.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液可以降低番茄植株因乾旱造成的損..25 第五節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄植株 JA 抗性基因表現及抵抗炭

疽菌的感染及降低炭疽病菌孢子發芽率影響………..26

一.

乳 酸菌 L . para cas e i 發酵液增加番茄 J A 相關基因的表現 量……….………...………….26

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液幫助番茄抵抗 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 ) 的感染及降低 C. gloeosporioides (SA 1 -36-2 )孢子發芽 率………..………...27

第六節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄植株 SA 抗性基因表現及抵抗 Pst DC3000、Pst DC3000 avrrpt2 及青枯菌能力………28

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液增加番茄 PR1 的表現量………28

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液幫助番茄抵抗 Pst DC3000 與 Pst DC3000 avrrpt2 的感染……….29

三.

乳 酸 菌 L . p ar a c a s ei 發 酵 液 無 法 幫 助 番茄 抵 抗 R a l s to n i a solanacearum (Rd4) 的感染……….30

第七節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番荔枝植株在慣行農法葉部綜合病 害防治的能力………..31

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對釋迦病徵沒有差異……….31

x

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液混合土壤根圈細菌 Bacillus sp 及鈣離

子降低番荔枝病害指數……….32

第四章、 討論………..33

第一節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液促進植物生長………33

第二節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液藉由調控 ROS 幫助番茄抵抗 UV、高 溫與乾旱逆境

………..

……….….35

第三節、 乳酸菌 L. paracasei 發酵液幫助番茄抵抗炭疽病菌與 Pst DC3000 感病能力及抑制炭疽病菌孢子發芽………36

第四節、 未來展望……….37

第五章、 參考文獻……….38

附錄……….………101

附錄一、實驗架構………..101

附錄二、Q-PCR 引子條件………102

附錄三、培養基與藥劑配方表………..103

附錄四、實驗儀器………...104

附錄五、UV 逆境損傷分級………105

附錄六、青枯病損傷分級……….….……….107

附錄七、乳酸菌 L. paracasei 發酵液會使番茄鈣離子吸收能力下降………….109

附錄八、乳酸菌 L. paracasei 發酵液無法不會影響番茄光合作用效率………111

xi

圖目錄

圖 1、No-2 與 Heat-No-2 對番茄植株生長的影響。………..57

圖 2、No-2 對水稻生長的影響。……….59

圖 3、No-2 對洋香瓜生長的影響。……….61

圖 4、No-2 對番荔枝果實生長的影響。……….63

圖 5、No-2 與 Heat-No-2 對 Bacillus sp 對番茄根部表面纏聚能力。…………..65

圖 6、No-2 與 Heat-No-2 對番茄葉片 H2O2的含量影響。………67

圖 7、No-2 與 Heat-No-2 對番茄葉片 POD 的活性影響。………69

圖 8、No-2 與 Heat-No-2 對番茄葉片細胞膜離子通透的影響。………..71

圖 9、No-2 與 Heat-No-2 對番茄植株受 UV 逆境的影響。………..73

圖 10、No-2 與 Heat-No-2 對番茄植株耐熱能力。………75

圖 11、No-2 與 Heat-No-2 對番茄植株受乾旱逆境損傷程度的影響。…………77

圖 12、No-2 與 Heat-No-2 對番茄 JA 抗病路徑基因表現量之影響。………….79

圖 13、No-2 與 Heat-No-2 對番茄植株受炭疽菌 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 ) 逆 境損傷程度的影響。……….81

圖 14、No-2 對番荔枝抵抗炭疽病能力的影響。………...………83

圖 15、No-2 與 Heat-No-2 對 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 ) 孢子發芽率的影 響。……….…85

圖 16、No-2 與 Heat-No-2 對番茄 LePR1 基因表現量之影響。………...87

圖 17、No-2 與 Heat-No-2 對番茄抵抗 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 能 力的影響。……….89

圖 18、No-2 與 Heat-No-2 對番茄抵抗 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 avrrpt2 能力的影響。………91

圖 19、No-2 與 Heat-No-2 對番茄植株受青枯菌 R. solanacearum (Rd4) 逆境損傷 程度的影響。……….93

xii

圖 20、No-2 對青枯病菌在番茄根部表面纏聚能力。……….………..95 圖 21、No-2 對番荔枝葉部綜合病害之影響。………...……97 圖 22、No-2 混合土壤根圈細菌 Bacillus sp 及鈣離子對番荔枝葉部綜合病害、果 實數目及大小之影響。……….99

1

第一章、 前言 第一節、 乳酸菌

一. 乳酸菌介紹

乳酸菌屬 (Lactobacillus sp.) 是普遍認為安全的細菌菌種 (generally

regarded as safe, GRAS)(Mehta et al., 2013)，其特性是可將糖類發酵成乳酸，在過 去的研究常被用來作為人體腸道中的益生菌，並且藉由代謝所產生之乳酸改善環 境酸鹼值或產生抗菌物質來抑制腸道中病原菌的生長，除此之外還可藉由活化人 體免疫系統來達到改善體質的功能 (Stiles., 1996)。本研究中所使用的發酵液菌 株為副乾酪乳桿菌 (L. paracasei) 為革蘭氏陽性菌，外觀是典型的桿菌，其細菌 大小為寬度介於 2.0〜4.0 mm，長度介於 0.8〜1.0 mm，不具有運動性，通常以 單一細胞形式或多個細胞形成長鏈狀 (Hessle et al.,1999; Collins et al., 1989)。L.

paracasei 最佳生長條件為 10 至 37℃ 的溫度範圍，在 40°C 以上無法正常生長，

72℃的高溫下能夠存活約 40 秒，在不合適的生長環境並不會形成內生孢子 (Hessle et al.,1999; Collins et al., 1989)。L. paracasei 通常棲息於許多人類組織或 活動環境，如腸道和口腔，以及污水，青貯飼料和乳製品中 (Orlando et al., 2012;

Hessle et al.,1999)。目前研究已知，從各種環境中分離出來不同的 L. paracasei 菌株約有三十四種，有十六種從乳製品中分離出來、十種來自植物另外八種則來 自人類和動物胃腸道 (Smokvina et al., 2013)。L. paracasei 在分類上屬於細菌界 中的厚壁菌門，芽孢桿菌綱、乳桿菌目、乳桿菌科、乳桿菌屬。在過去的分類中 L. paracasei 與同屬的其他種乳酸菌例如乾酪乳桿菌 (L. casei) 和鼠李糖乳桿菌 (L. rhamnosus) 無法從基因型跟表現型上區分 (Collins et al., 1989)。然而，有一 些差異標準用於區分它們，這些差異標準包括營養需求和生長環境 (Smokvinaet

2

al., 2013)。舉例來說，前人研究發現 L. paracasei 具有較好的耐熱性，在成熟的 奶酪中生長良好，並且具有高的蛋白水解活性 (Molin et al., 1993)。除此之外，

L. paracasei 也具有較好的發酵性能，此發酵性能允許它被用作食品加工、膳食 和醫學的補充劑，特別是針對人體胃腸道菌相的改善(Felten et al., 1999)。

第二節、 根圈微生物對植物的影響

一. 根圈微生物對植物生長之案例

植物在土壤中自然生長的環境中根部會被有益的或致病的各種微生物包圍。

對植物生長發揮有益作用的根際細菌 (Rhizobacteria) 稱為促進植物生長根際菌 (plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)，有下列幾個屬：Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Actinoplanes, Azotobacter, Azospirillum , Bacillus ,

Bradyrhizobium ,Pseudomonas 和 Rhizobium 較為常見。生長促進的主要機制包括 生長刺激性植物激素，磷酸鹽的溶解，植物乙烯合成的抑制 (Richardson et.

al., 2009 ; Idris et. al. 2007 ; Gutierrez-Manero et. al. 2001)。前人研究發現 PGPR 本 身具有產生植物激素的能力來促進植物生長。舉例來說，處理 A. brasilense 與 B.

japonicum 能在培養基中產生 indole 3-acetic acid (IAA)、zeatin (Z) 與 gibberellic acid (GA3) 促進大豆 (Glycine max L.) 種子萌發及幼苗的莖與根長度與乾重，此 外這兩株菌在玉米上也有增加幼苗的莖與根的長度及乾重並且促進節間的形成 (Cassan et al., 2009); P. aeruginosa 與 P. synxantha 兩株菌株也具有產生 IAA 的能 力並且能促進大豆與小麥 (Triticum aestivum L.) 的生長 (Sharma et al., 2011)，

Klebsiella pneumonia 可產生 IAA 促進小麥發芽與生長 (Sachdev et al., 2009)，

Rhizobium strain MRP1 促進豌豆 (Pisum sativum) 的生長 (Ahemad & Khan 2011 ;

3

Ahemad & Khan 2010 ; Ahemad & Khan 2009)，Paenibacillus polymyxa 促進辣椒 (Capsicum annuum L. cv. Bukang) 的生長 (Phi et al., 2010)，A. amazonense 增加 水稻 (Oryza sativa L.) 稻穗數目與加快成熟 (Rodrigues et al., 2008)。前人研究發 現 B. subtilis 也具有產生 IAA 的能力 (Zaidi et al., 2006)，能促進番茄 (Solanum lycopersicum L.)、秓葵 (Abelmoschus esculentus) 與莧菜 (Amaranthus sp.) 的生長 (Adesemoye et al., 2008)，B. subtilis 與 P. putida 促進萵苣 (Lectuca sativa L.)。

除了 IAA 之外，前人研究也發現 PGPR 可以產生 Cytokinin 來幫助植物生長，舉 例來說 P. polymyxa 促進小麥生長 (Timmusk et al., 1999)，P. fluorescens 促進大 豆生長 (Garcia de Salamone et al., 2001)，R. leguminosarum 促進油菜 (Brassica campestris cv) 與萵苣的生長 (Noel et al., 1996)。B. pumilus 與 B. licheniformis 則 可產生 GA 幫助植物的生長 (Gutierrez-Manero et. al. 2001)。除了產生植物激素外，

前人也發現 PGPR 藉由溶解磷酸鹽幫助植物對磷的吸收以促進生長。舉例來說，

B. circulans、P. jessenii、P. synxantha 增加小麥磷跟氮的吸收使小麥的產量增加 (Singh & Kapoor 1999 ; Mäder et al., 2011)，P. putida 與固氮細菌提升菜薊 (Cynara scolymus) 胚根和枝條的長度與枝條重量並加速發芽的時間 (Jahanian et al., 2012)，Rhizobium strain MRP1 幫助豌豆 (Pisum sativum) 對磷的吸收 (Ahemad &

Khan 2011 ; Ahemad & Khan 2010 ; Ahemad & Khan 2009)，前人研究顯示同時處 理 B. pumilus 與 P. pseudoalcaligenes 促進水稻長，包含增加植株乾重及植株高 度，在離子吸收方面，B. pumilus 與 P. pseudoalcaligenes 也有促進水稻 N、P、K、

Na 及 Ca 吸收 (Jha & Subramanian., 2013)。除了產生植物激素與藉由溶磷作用幫 助植物吸收磷來促進植物生長，在前人研究也發現 PGPR 促增加植物的光合作用。

舉例來說，在分別接種phosphorus solubilizing bacteria 與 S. meliloti 1021時，四 季豆 (Phaseolus vulgaris) 與水稻的生長和光和光合作用也有所增加 (Collavino et al., 2010)。此外 PGPR 也能促進植物根部微生物的數量，例如 A. chroococcum 和 A. lipoferum 可增加棉花 (Gossypium hirsutum L.) 根部微生物數量 (Anjum et

4

al., 2007)。

乳酸菌在前人研究中發現，除了在發酵過程中所產生的代謝物質具有許多營 養成分，胜肽、胞外多醣和脂肪類物質等 (Scheinbach, 1998)，在對植物生長方 面，乳酸菌發酵萃取物具有促進胡瓜整體發育，包含增加葉片數目、面積、株高，

以及開花數目的現象 (廖, 2005)。在 2013 Limanska 氏研究中發現番茄種子若浸 泡 9 種不同的乳酸菌培養液皆能促進番茄種子發芽率，並提高植株莖部、主根 和側根的生長。除此之外，自然環境中也有部分乳酸菌可從植物周圍分離到，作 為植物之根圈微生物的功能 (Mundt et. al. 1968)。

二. 根圈微生物誘導植物抵抗病原抗性機制

病原微生物感染也是使植物產量減少，造成農業產量損失。在前人研究發現，

PGPR 除了促進植物生長之外，可以通過拮抗養分的競爭、產生抗生素及分泌溶 解酶降低病原微生物的活性 (Handelsman & Stabb .,1996 ;van Loon & Bakker., 2003 ; Weller., 2004)。除了直接抑制病原菌生長之外，PGPR 可以通過間接引起 植物防禦系統 (Haas et. al. 2005) 來降低病害。這種抗性反應現象稱為誘導系統 性抗病 (Induced systemic resistance, ISR)，其可以通過有益微生物被局部誘發，

增強植物對病原體廣泛的系統抗性 (Pieterse et. al., 2014)。

前人研究顯示某些 PGPR 微生物藉著提升植株活性氧化物質 (Reactive

oxygen species, ROS)

以提升植物抗性，例如 B. subtilis 可以幫助瓜科植物產生胼 胝質 (callose)、木質素 (lignin) 與大量累積 H2O2 (Cazorla et al., 2007;

Garcia-Gutierrez et al., 2013)，B. amyloliquefaciens UCMB5113 或 Azospirillum brasilense NO40 兩株 PGPR 菌株能提升小麥種子的 ROS 代謝酵素過氧化氫酶 (peroxidase, POD)(El-Daim et al., 2014)。B. cereus AR156、B. subtilis SM21 和

5

Serratia sp.YX21 能提升黃瓜 (Cucumis sativus L) 過氧化氫酶 (peroxidase) 活 性及調控H2O2累積 (Wang et al., 2012)。

第三節、 根圈微生物對植物抵抗逆境影響

一. 根圈微生物對植物抵抗高溫之影響

植株在生長過程中也有可能遇到高溫造成的逆境。植物因為不能移動到更有 利的環境，植物生長和發育過程上因受到高溫影響經常致死 (Lobell & Fiel., 2007 ; Hasanuzzaman et al., 2012)。植物受到高溫逆境，會造成在植物生長，發育，

生理過程，和產量的改變 (Kotak et al., 2007 ; Hasanuzzaman et al., 2013)。植物在 受高溫逆境的主要後果是過量的活性氧 (ROS)，從而導致氧化壓力 (Mittler et al., 2012; Hasanuzzaman et al., 2013)。植物以各種方式改變其新陳代謝，以抵抗高溫 逆境，特別是通過產生能夠組織蛋白質和細胞結構的相容性溶質，維持由滲透調 節細胞的膨脹，並修改抗氧化系統重新建立細胞的氧化還原平衡和穩態 (Wahid et al., 2007)。此外前人研究也發現，許多 PGPR 和其他微生物也可以透過 ISR (van Loon et al., 1998; Compant et al., 2005)，提高對非生物脅迫的耐受性 (Yang et al., 2009)。舉例來說，處裡 B. amyloliquefaciens UCMB5113 與 A. brasilense NO40 兩 株 PGPR 菌株能提升小麥 (Triticum aestivum) 種子的耐熱性 (El-Daim et al.,

2014)。

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二. 根圈微生物對植物抵抗乾旱之影響

乾旱對作物產量和農業生產力造成極大影響的非生物逆境 (Boyer, 1982 ; Boyer et al., 2013)。為了需要更好地了解乾旱反應機制，前人利用傳統育種和目 標基因組以探討植物對乾旱耐受能力 (Langridge & Reynolds, 2015)，其中包括控 制氣孔關閉時間，光合作用調節，滲透物累積和生長遲緩的分子機制 (Bosco De Oliveira et al., 2012)。氣孔代表了植物用於避免脫水的第一個障礙，同時減少了 向葉肉中供應 CO2。前人研究發現，在受到乾旱逆境情況下植物會增加 ABA 的 累積量調控氣孔關閉避免脫水，PGPR 能藉由增加 ABA 含量幫助植物面對乾旱 逆境，例如處裡 R. tropici 和 P. polymyxa 幫助菜豆 (Phaseolus vulgaris) 抵抗乾 旱逆境 (Figueiredo et al., 2008)。隨著缺水加劇，代謝障礙會進一步限制光合作 用 (Chaves et al., 2009)。前人研究發現，PGPR 幫助植物在乾旱情況下提升光合 作用，例如 Burkholderia phytofirmans 與 Enterobacter sp. FD17 在乾旱條件下增 加玉米光合作用並促進根和苗的生長 (Naveed et al., 2014)；B. thuringiensis AZP2 則可幫助小麥在乾旱逆境下的光合作用 (Timmusk et al., 2014)。在嚴重的缺水條 件下，除了植物的光合作用受到限制之外，ROS 可能會導致對新陳代謝有負面 影響 (Bian & Jiang., 2009; Xu et al., 2014)。乾旱和在復水均會導致根部高度積累 H2O2 (Bian & Jiang., 2009)，而處裡B. cereus AR156，B. subtilis SM21 和

Serratia sp.YX21 能提升黃瓜 (Cucumis sativus L) 過氧化氫酶 (peroxidase, POD) 活性，以保護植株在受乾旱逆境下的損傷 (Wang et al., 2012)。此外，B.

thuringiensis AZP2 則是可以提升小麥在乾旱逆境下的過氧化氫酶 (catalase, CAT) 與超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 酵素活性 (Timmusk et al., 2014)。

而在前人研究發現 SA 可以調節monodehydroascorbate reductase, (MDHAR)、

dehydroascorbate reductase, (DHAR)、GSH peroxidase, (GPX），等重要酵素及 glntathim (GR) 來降低乾旱逆境下植物的氧化壓力 (Alam et al., 2013）， PGPR

7

能藉由誘導植物的 SA 路徑幫助植物抗旱，例如 P. chlororaphis 分泌揮發性化合 物誘導阿拉伯芥 (Arabidopsis thaliana) 的 SA 路徑基因 PR1 表現量幫助植物抵抗 乾旱逆境 (Cho et al., 2008)，B. licheniformis 提升辣椒 PR1 表現量幫助植物抵抗 乾旱逆境 ( Lim and Kim, 2013)。

UV 誘導葉片的光形態變化包括葉片尺寸減小，葉片厚度增加，會破壞植物 的 DNA 和改變植物的代謝，包括增加植物酚類化合物的合成和抑制光合作用 (Wargent et al., 2013; Jansen & Gaba., 1998.)。UV-B 是具有細胞毒性的，會破壞細 胞許多原本該有的平衡，包括核酸、脂質、光合作用相關色素及蛋白質與造成氧 化壓力 (Hollósy ., 2002; Jansen & Gaba., 1998)。研究指出將阿拉伯芥暴露在 UV-B 及 UV-C 之下會增加其發生點突變的機率 (Kovalchuk I. et al., 2000;

Haliem E. et al., 2013)。植物在 UV 輻射暴露中顯著誘導 SA 的積累 (Fodor et al., 1997 ; Horváth et al., 2002) 。而前人研究發現 PGPR 具有調控植物 SA 的能力，

故本實驗欲探討乳酸菌發酵液是否也有保植物在 UV 逆境條件下的抵抗能力。

三. 根圈微生物對植物抵抗炭疽病菌之影響

炭疽病菌 Colletotrichum sp. 為真菌性病原菌，Colletotrichum 為無性世代，

屬於腔菌綱 (Coelomycetes)，寄主廣泛包括許多種經濟作物，如香蕉、木薯、高 粱、玉米、番茄、木瓜、番荔枝、龍眼、芒果、波菜、豆類、黃瓜等作物 (Dean et al., 2012, Cannon et al., 2012)，可感染植株的葉片、莖部與果實 (Cai et al., 2009)。

在高濕度環境下藉由分生孢子感染寄主。分生孢子附著於植物細胞上，伸出附著 器 (appressorium)，將主要菌絲 (primary hyphae) 深入植物細胞膜上，此時病原 菌為短暫的活體營養型，之後要從植物生上獲得養分時，轉換成死體營養型，將 次要菌絲分支整個深入細胞體內，使得植物細胞死亡。前人研究發現，PGPR 可

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以通過 ISR 增強植物對 Colletotrichum sp.系統抗性。舉例來說，前言研究利用 B. cereus AR156 增加 NPR1 基因表現、過氧化酵素 POD、SOD、CAT 及 H2O2

的累積，並且能有效降低 Colletotrichum sp.在枇杷的感染(Wang et al., 2014)。P.

polymyxa 與 B. subtilis 也具有降低 Colletotrichum sp. 在蘋果上造成的病害 (Young et al., 2016)。B. subtilis 在人蔘 (Panax ginseng) 上也有幫助抵抗

Colletotrichum sp.。除了藉由誘導植物產生抗性之外，PGPR 被報導藉由產生抗 菌劑拮抗 Colletotrichum sp.，降低植株上的病害。舉例來說，P. polymyxa、B. cereus、

B. thuringiensis和 B. subtilis 皆能抑制Colletotrichum sp 菌絲生長 (Lamsal et al., 2012; Wang et al., 2014; Hojin et al., 2014; Young ., 2016 )

四. 根圈微生物對植物抵抗 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 之影響

P. syringae pv. tomato為番茄的病原菌 (Cuppels, 1986)，其中 P. syringae pv.tomato DC3000 (Pst DC3000) 已解開全基因组序列，故作為該病原菌的模式細 菌 Pst DC3000利用第 III 型分泌系統感染植株 (type three secretion system, TTSS;

Buttner & Bonas et al., 2002; Staskawicz et al., 2001; Alfano & Collmer., 2004;

Mudgett., 2005; He et al., 2004)。細菌使用 TTSS 將大量的效應蛋白 (effector protein) 注射到宿主細胞中 (Collmer et al., 2002; Greenberg & Vinatzer, 2003;

Chang et al., 2005; Nomura & He, 2005)。除了利用 TTSS 感染植株之外，這種病 原體產生 JA 模擬植物毒素 coronatine (COR)，可以誘導 JA 路徑基因抑制 SA 路 徑，以此感染植株。前人研究發現，PGPR 可以通過 ISR 增強植物對 P. syringae tomato 抗性，舉例來說，前人研究發現 B.cereus AR156 能藉由誘導阿拉伯芥 SA 路徑抵抗 Pst DC3000 (Niu et al., 2011)，S. marcescens、B. pumilus、P. fluorescens

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與 B. pumilus 誘導 NPR1 幫助植物抵抗Pst DC3000，此外前人研究也發現如果將 S. marcescens、B. pumilus、P. fluorescens 與 B. pumilus 處理在轉殖 NahG (SA deficient) 的阿拉伯芥上，則無法幫助植物抗Pst DC3000 (Ryu et al., 2003)。除了 誘導 SA 路徑外，B. cereus AR156 提升番茄在 P. syringae tomato 接種下 POD 的 酵素活性 (Halfeld-Vieira et al., 2006)，同時處裡 B. pumilus 及 B. amyloliquefaciens 提升番茄果氧化酵素 POD 與 PPO 酵素活性抵抗 P. syringae tomato NS4 感染

(Lanna-Filho et. al., 2017)

五. 根圈微生物對植物抵抗青枯病菌之影響

除了上述細菌性病菌之外，青枯病也是茄科植物上常見病害，而青枯病菌 R. solanacearum 為造成此病害的病原菌。青枯菌為細菌性維管束病害其病體生 存於土壤中，為土壤傳播型細菌病原菌，屬於革蘭氏陰性能夠移動的桿菌，除了 茄科植物外可感染全球許多農作物並限制其生產量，其中在馬鈴薯上可造成褐腐 病，而在菸草及香蕉，亦會造成細菌型萎凋病或南方萎凋病。植株萎凋病徵是青 枯病菌自植株受傷的部位、根尖、側根產生時的裂縫進入維管束中生長，並產生 胞外多醣體抑制木質部水分運輸而造成的現象 (Abramovitch et al., 2006)。前人 研究發現，PGPR 可以通過 ISR 增強植物對 R. solanacearum 抗性，舉例來說，

B. amyloliquefaciens 和 B. artrophaeus 藉由產生揮發性化合物抑制 R.

solanacearum 生長並誘導植物 SA 抗病路徑基因 EDS1 與 NPR1 表現量 (Tahir et al., 2017)。芽孢桿菌屬蘇力菌 B. thuringiensis 能幫助番茄啟動植物 SA 抵抗青 枯病菌 R. solanacearum 的感染 (Hyakumachi et al., 2013) B. amyloliquefaciens 能抑制青枯病菌 R. solanacearum 的生長並幫助花生抵抗青枯病菌 R.

solanacearum 的感染 (Wang & Liang. 2014)。

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六. 乳酸菌對植物病原菌之影響

根據前人研究顯示乳酸菌也具有抑制植物病原菌生長的能力。包含灰黴病之 真菌 Botrytis cineriea，造成早疫病的 Alternaria solani，疫病菌病害 Phytophthora drechsleri Tucker，鎌孢菌 Fusarium oxysporum 以及 Colletotrichum 屬的炭疽病 菌的生長。除真菌性病害，乳酸菌也顯示出能有效對於茄科青枯病菌 R.

solanacearum 造成之萎凋有明顯的控制，並能直接抑制茄科青枯病菌之生長 (Narasimha Murthy et. al. 2012)。對 Xanthomonas Campestris 顯著降低疾病症狀 (Visser et. al.1986 ; Mojgan et al 2012)。

第四節、 研究動機與目的

番茄容易遭受生物逆境和非生物逆境影響，目前都仰賴化學農藥或肥料解決 這些問題，導致農藥殘留和環境污染。近年來以有機資材作為防治的方法受到重 視，過去研究證實非致病性微生物和其發酵濾液能夠誘導植物抗性基因表現及促 進植物生長發育，然而目前沒有研究探討乳酸菌發酵濾液是否能誘導番茄抗性基 因表現，抵抗生物及非生物逆境。因此，希望藉由本研究來探討乳酸菌 L.

paracasei 發酵液在溫室中，是否能夠誘導並表現番茄的抗性基因來抵抗生物及 非生物逆境。此外，以田間詴驗探討乳酸菌 L. paracasei 發酵液是否能促進番茄 及其他作物的生長發育並且以慣行農法探討乳酸菌 L. paracasei 發酵液是否提升 釋迦果實數目與大小及降低葉片的自然發病率。此外為了避免過多活菌施用於田

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間對環境造成影響，因此本實驗將 No-2 經過滅菌後，並探討是否有對植物有促 進生長及對生物與非生物逆境是否有影響。

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第二章、 材料與方法 第一節、 實驗材料

一.

植株材料與培養條件

實驗進行使用番茄 (Solanum lycopersicum) 農友 301 (農友種苗公司, Taiwan)， 種子利用無菌水清洗 1 分鐘 2 次後，置於 4 °C 春化 14 小時。種子培養於介質 (真 珠石 : 泥炭土 = 1 : 2) 中，每 3 天澆水一次。培養於 26 °C，光照 12 小時與黑暗 12 小時循環，光照強度 400 μmol m^-2s^-1 的恆溫培養房中。於發芽 15 天後移植 2 吋塑膠軟盆中。詴驗田番荔枝 (Annona squamosal) 品種為台東二號 (大目種)，

先將番荔枝種子利用 75 % 酒精滅菌，放置於黑暗環境 4℃進行春化作用 24 小 時後，種植於介質中 (真珠石 : 泥炭土 = 1 : 2)，每 3 天澆水一次。培養於 26 °C，

光照 12 小時與黑暗 12 小時循環，光照強度 400 μmol m^-2s^-1 的恆溫培養房中。慣行 農法田番荔枝 (A. squamosa) 品種為台東二號 (大目種)，田區位於台東縣知本東 57 縣道旁。慣行農法田水稻，為將秧苗插秧後兩周後始進行生長詴驗，田區位於 台東市台 11 縣旁。慣行農法田洋香瓜，將 15 天洋香瓜苗定植於溫室中，於定植 一周後開始進行生長詴驗，田區位於台東縣知本東 57 縣道旁。

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液

乳酸菌 L. paracasei 發酵液 (No-2) 為 DE Man, Rogosa and Sharpe (MRS, 1%

Proteose Peptone, 1% Beef Extract, 0.4% Yeast Extract, 0.1% Polysorbate 80, 2%

glucose, 0.5% Sodium Acetate, 0.02% Magnesium Sulfate, 0.005% Manganese Sulfate, 0.2% dipotassium Phosphate) 培養基發酵乳酸菌 (L. paracasei)，去除活

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菌體後，所剩下之基質為原液。Heat-No-2 製備則是將 No-2 經由高壓滅菌釜 121

℃ 1.25 atm 5 分鐘。

三.

細菌材料與培養條件

根 圈 有 益 微 生 物 芽 孢 桿 菌 分 別 為 B. thuringiensis (HS1) 與 B.

amyloliquefaciens (HS3)分離自台東縣台 11 線，利用 16S rRMA 引子鑑定，產物 大小 800 bp，經由基龍米克斯公司解序後，利用美國國家級生物資訊中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 資料庫作序列比對，由此確 認細菌名稱。土壤病原菌青枯病菌 R. solanacearum (Rd4)。上述菌株皆培養於液 態培養基中 (Nutrient Broth pH 7.0, NB) (ST-Bio, Taiwan)，在全黑暗中培養於 28 °C，

震盪轉速 150 rpm 的培養基中生長。

P. syringae pv. tomato DC3000 與 P. syringae pv. tomato DC3000 avrRpt2 菌 株來自台灣大學植物科學所，分別培養於 KBM含 50 ppm Rifampicin 與 KBM 含 50 ppm Rifampicin 及 Kanamycin在全黑暗中培養於 28 °C，震盪轉速 150 rpm 的 培養基中生長。

真菌分離株 C. gloeosporioides (SA 1-36-2) 分離自台東釋迦園，經由 ITS1 與 ITS4 引子鑑定，PCR 產物大小 600 bp，經由基龍米克斯公司解序後，利用美國 國家級生物資訊中心資料庫作序列比對，由此獲得病原菌名稱(資料沒有呈現)，

病原菌培養在含有 2 % 瓊脂培養於馬鈴薯培養基 (Potato dextrose agar medium, PDA)，培養條件為 28 ℃，黑暗培養，培養於液態 PDB (Potato dextrose broth medium, PDB) 的培養條件為：28 ℃，150 rpm 。炭疽病菌產生孢子條件為培養 於 1/5 倍 PDA，26 ℃，黑暗培養，培養 15 天。

第二節、 實驗方法

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一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對植株生長測詴

番茄生長測詴 : 將培養於恆溫培養房 40 天大番茄定植於溫室中，於移植生 長一周後，處理 10% No-2 及 10% Heat-No-2，7 天處理一次每株處理 100 mL。

番茄植株高度、葉片數與繁殖組織計算方法分別為，從土壤表面到植株頂芽距離 為植株高度，葉片數的部分為計算有獨立葉柄為一片葉片，繁殖組織在花的部分，

分為花萼還沒完整打開為花苞完整打開為花朵，在果實部分依顏色分為青果及熟 果。

水稻生長測詴 : 為水稻秧苗定植 14 天後。選一排 20 株水稻，開始處理 No-2 原液，每次處理 12 L No-2 14 天處理一次，共處理 7 次。水稻分糵數、稻 穗數及稻穗長度測量方法水稻分糵數為計算水稻稻梗，70 天後測量稻穗數及稻 穗長度。

洋香瓜生長測詴 : 處理 10% No-2，每 7 天處理一次，每株處理 100 mL 的 藥劑，洋香瓜繁殖組織計算部分在洋香瓜處理 28 天後計算花朵數，在處理 42 天後計算果實數目。

番荔枝生長測詴 : 在實生苗部分，落葉後將 10% No-2 處理於番荔枝苗根部，

7 天處理一次每株處理 1 L。而在慣行農法田間間詴驗部分，在強剪枝後進行地 上部噴灑 1 L 並且在根部澆灌 4 L 1% No-2 及混合藥劑 (含 1% No-2、0.2% 鈣 離子、10⁷ CFU/mL 的 B. thuringiensis , HS1 與 B. amyloliquefaciens , HS3)，每 42 天處理一次。番荔枝繁殖組織部分則是將番荔枝果實分為小於 2 公分、2~5 公分 間及大於 5 公分進行計算。

二.

植株病害接種

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將過夜培養的病原細菌 R. solanacearum Rd4、Pst DC3000 與 Pst DC3000 avrRpt2，以 RO 水將菌液調整至 10⁷ CFU/mL。葉部抽氣接種法是將田間處理 11 次後之番茄葉片浸泡於 10⁷ CFU/mL Pst DC3000 avrRpt2 (含 0.025 % silwet L-77 surfactant, Helena Chemical, US) 利用幫浦抽氣 5 分鐘兩次，每次間隔 3 分鐘洩壓，靜置 4 天後拍照觀察。病斑數量計算方法為葉片黑化壞疽為一個病 斑。根部澆灌接種法是將調整好的 R. solanacearum Rd4 ( 含磷酸鹽緩衝溶液, pH7 100 mM) 50 mL 澆灌於恆溫培養房中處理為 25 mL 10% No-2 與 10%

Heat-No-2 9 天後的番茄根部，靜置 9 天後拍照觀察與計算發病率。發病分級分 標準詳見 (附錄 5 )。發病率 (%) 換算公式為 (N0*n+N1*n+N2*n+N3*n+N4*n) /(Nt*nt) *100，N 為級數，n 為樣本數，Nt 為總級數，nt 為樣本總數。

培養於斜面 1/5 PDA 培養基上的炭疽病菌以 5 mL 0.1% water agar 含 0.05% Tween 20 震盪 5 分鐘後利用血球計數器計算孢子數量。將分生孢子調整 濃度至 10⁶ spores/mL (含 1/5 PDB 及 10 mM MgSO4)，之後將分生孢子噴灑接種 於田間處理 11 次後將番茄葉片。於接種 5 天後計算病斑數病斑數量計算方法為 葉片黑化壞疽為一個病斑。另外在番荔枝接種部份，方法為將分生孢子噴灑接種 於處理 5 次後番荔枝葉片，於接種 6 天後進行拍照觀測，並在 2、4、6 與 8 天 後計算發病率。發病率檢測方為，將接種葉片利用繪圖軟體 potoshopcs5 計算黑 化壞疽面積並利用發病率公式為 (壞疽面積/葉片全部面積*100)。

三.

細菌在植物根部纏聚能力檢測方法

參考 (Chen et al., 2013)的方法測詴在番茄根部纏聚能力 B. thuringiensis (HS1) 與 B. amyloliquefaciens (HS3)，為將培養 14 小時 HS1 與培養 16 小時 HS3 菌液調整至 O.D.= 0.8 後倒入 2 Kg 土壤中 (真珠石: 泥炭土 = 1 : 2，土壤 菌數 = 10⁸ CFU/g) 加入 150 mL 的藥劑 (10 % No-2 或 Heat-No-2)，於 1、5、9、

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13、17、21 和 30 天後取番茄根部秤重後放入 50 mL tube，加入 20 mL 0.1 % WA 含 0.025 % SILWET L-77 利用震盪機沖洗 5 分鐘後取 1 mL 序列稀釋，將 100 L 稀釋後的菌液利用玻璃珠塗在 LB 培養基中放置於 28 ℃ 1 天後數菌落數。

青枯菌在番茄根部纏聚測詴方法為，將 R. solanacearum (Rd4) 培養於 NB 培養基 28 ℃ 14 小時，將菌液倒入 2 Kg 土壤中 ( 土 : 珍珠石 = 2 : 1，土壤 菌數 = 10⁷ CFU/g) 並加入 150 mL 的藥劑 ( 10 % No-2 或 Heat-No-2)，於 1、5 天後取番茄根部秤重後放入 50 mL tube，加入 20 mL 0.1 % WA 含 0.025 % SILWET L-77 震盪 5 分鐘後取 1 mL 序列稀釋，將 100 L 稀釋後的菌液利用玻 璃珠塗在 NB 培養基中放置於 28 ℃ 1 天後數菌落數。

四.

即時聚合酶鏈鎖反應 (Quantitative real time polymerase chain reaction, Q-RT –PCR)

收取番茄葉部組織，利用總量 RNA 迷你詴劑 (Tissue Total RNA Mini Kit) (Favorgen, Taiwan) 抽取植物組織總量 RNA，經由 MMLV Reverse Transcription kit (Protech, Taiwan) 將 1 μg RNA 反轉錄成 cDNA，再加入 1 μL 10 mM Q-正反引子 (Blossom, Taiwan) (附錄 1)、2 μL 10X PCR 緩衝液、1 μL 2.5 mM dNTP、0.1 μL 5 units/μl Pro Taq DNA polymerase、10μl 2X super SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, US) 與無菌水體積填補至 20 μL，以 Quantitative real-time PCR StepOne 儀器 (附錄 3) 進行 Q-RT-PCR，將 LeEFlα 基因的 RNA 放大到最 高螢光數量的循環數作為分母，與待測基因的 RNA 放大到最高螢光數量的循環 數作為分子，由兩者所獲得循環數比值作為相對值的數據。

五.

植株體內過氧化氫含量檢測

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參考 (Jana & Choudhuri, 1981) 植株移植生長 5 天後，將 25 mL 10% No-2 與 10% Heat-No-2 澆灌於植株根部。於 No-2 處理 0、12、24、36 和 48 hr 後取 植物頂部第二片葉片 0.05 g 放入 1.5 mL 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 600 μl 磷酸鹽緩衝液 (50 mM, pH 6.8) ，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 9,000 g 離心 25 分鐘取 400 μl 上層溶液，換製新的微量離心管，加入 200 μL 硫酸鈦 (TiSO4) 溶液，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 6,000 g 離心 15 分鐘取 200 μL 上 層 溶 液 ， 即 為 待 偵 測 過 氧 化 氫 溶 液 ， 利 用 波 長 410 nm 檢 測 ， 以 {[(X410-0.0011)/0.0004]*1.5}/重量(mg) 換算過氧化氫含量。

六.

過氧化氫酶檢測

參考 (MacAdam,et.al 1992) 的方法，將移植生長 5 天後，將 25 mL 10% No-2 與 10% Heat-No-2 澆灌於植株根部。於 No-2 處理 12、24、36、48 hr 後取植物 頂部第二片葉片 0.05 g 放入 1.5 mL 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 1,000 μL 磷酸鹽緩衝液 (50 mM, pH 5.8) ，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 12,000 g 離心 20 分鐘取 10 μL 上層溶液。加入 100 μl 磷酸鹽緩衝液、100 μL 鄰甲氧基 苯酚 (Guaiacol) 與 90 mL 過氧化氫 (39 mM)，均勻混合後，即為待偵測過氧化 氫酶溶液。利用波長 470 nm 檢測，以 [(△A₄₇₀)/26.6*反應體積 (mL)*稀釋倍率 /反應時間/重量 (g)] 換算過氧化氫酶活性。

七.

細胞膜離子滲漏檢測

參考 (Wu & Wallner, 1983) 將移植生長 5 天後，將 25 mL 10% No-2 與 10%

Heat-No-2 澆灌於植株根部。於 No-2 處理 0、12、24、36、48 hr 後取植物頂部 第二片葉片浸泡於 1 mL 超純水中，700 mmHg 真空抽氣 5 分鐘，放氣 2-3 分

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鐘，重覆 3 次，靜置 5-10 小時，測離子滲漏量，之後沸水煮 10 分鐘，冷卻 20 分鐘，再測離子滲漏量，計算離子滲漏率公式為 (原離子滲漏量/煮沸後離子滲 漏量) × 100 %。

八.

環境逆境處理方法及損傷分級判斷標準

UV-C 損傷測詴方法為，將處理 RO 水、No-2 與 Heat-No-2 9 天後番茄植株 處理 UV-C 253.7 nm 30 分鐘，於 24 小時進行損傷程度分級觀測。損傷分級分 標準詳見 (附錄 4)。損傷率 (%) 換算公式為 (N0*n+N1*n+N2*n+N3*n) /(Nt*nt)

*100，N 為級數，n 為樣本數，Nt 為總級數，nt 為樣本總數。

高溫損傷測詴方法為，將處理 RO 水、No-2 與 Heat-No-2 9 天後番茄植株 處理 45℃ 6 小時後拍照，並於 24 小時進行損傷程度分級觀測。高溫損傷 (%) 公式為 [(捲曲葉片數/總葉片數)*100%]

乾旱損傷測詴方法為，將處理 RO 水、No-2 與 Heat-No-2 9 天後停止澆水，

於 14 天 進 行 拍 照 觀 測 與 計 算 損 傷 比 率 。 損 傷 率 (%) 換 算 公 式 為 (N0*n+N1*n+N2*n+N3*n) /(Nt*nt) *100，N 為級數，n 為樣本數，Nt 為總級數，

nt 為樣本總數。

九.

真菌孢子發芽率檢測

將分生孢子調整濃度至 10⁴ spores/mL (含 1/5 PDB 及 10 mM MgSO4)。取 20

L 的分生孢子懸浮液滴在 2 % water agar 中。靜置室溫六小時後隨機取樣 50

顆孢子計算孢子發芽率。孢子發芽標準為當發芽管長度達到孢子長度一半判定為 發芽。

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十.

統計方法

經由 SPSS 12.0 統計軟體，單因子變異數分析，(One way analysis of , ANOVA)，假設相同變異數 Duncan 氏，顯著水準 p <0.05 。比較平均數經由 Microsoft Excel 2013 計算所得。

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第三章、 結果

第一節、

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對植株生長之影響

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄生長之影響

為了瞭解乳酸菌發酵液 No-2 是否會影響植株生長。我們首先利用番茄植株 做為測詴。結果顯示，不論是處裡 No-2 及 Heat-No-2 的番茄植株均較水處裡對 照組大 (圖 1A)。實驗結果顯示，在第一次處理 10% No-2 及 10% Heat-No-2 後 平均植株高度分別較水處理增加 2.45 cm 及 2 cm，統計分析結果具有顯著差異。

追加處理 8 次後處理組平均植株高度較水處理增加 19.6 cm 及 17.1 cm (圖 1B)，

統計分析結果具有顯著差異。而在平均葉片數部分處理組相比水處理組增加了 2.75 片。但 10% Heat-No-2 處裡組葉片數無法增加 (圖 1C )。在繁殖期部分，處 理 6 次 10% No-2 及 10% Heat-No-2 後讓番茄花苞顯著增加 1.05 個及 0.9 個。處 理 7 次後 10% No-2 及 10% Heat-No-2 處理番茄已經出現花朵，處理 8 次後 10%

No-2 處理組已經產生青果而 10% Heat-No-2 則沒有青果產生(圖 1D)。

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對其他作物生長之影響

除了番茄之外本實驗也想知道 No-2 對其他作物是否有促進生長的效果，因 此進一步詴驗了水稻、洋香瓜及番荔枝。在水稻部分，將 12 L 的藥劑澆灌於植 物基部，分別於第 0、14、28、42、56 和 70 天處理藥劑。並計算分糵數、稻穗 數及稻穗長度。實驗結果顯示，處理 10% No-2 4 次後水稻外觀圖如圖 2A，平均 分糵數相較對照組增加了 9.35 根 (圖 2B)，平均稻穗長度則是增加了 2.65 cm (圖

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2C )，而平均稻穗數增加了 2 根 (圖 2D)，統計分析結果均具有顯著差異。在洋 香瓜的部分，將 100 mL 的藥劑澆灌於植物基部，別分於第 0、14、28 和 42 天 處理藥劑。並計算花朵數及果實數。實驗結果顯示，處理 10% No-2 28 天後植物 外觀圖如圖 3A，No-2 處理組的平均花朵數相較於水處理組增加了 8.7 個 (圖 3B)，

而平均果實數，則是增加了 1.6 個 (圖 3C)。在番荔枝的部分，將 80 L 的 No-2 平均噴灌於 20 棵慣行農法番荔枝植株。並計算果實大小及數目。實驗結果顯示，

於 84 天進行第二次 No-2 處理後平均果實數目增加了 3.24 顆，統計分析結果具 有顯著差異，且處理組已有直徑大於 5 cm 果實，在處理後 94 天發現平均果實 增加了 9.78 顆，統計分析結果具有顯著差異，且發現 No-2 處理果實在直徑大於 5 cm 平均果實數的部分相較於 84 天增加了 2.08 顆，而在第二次處理 21 天後 No-2 處理平均果實數較水處理增加 4.21 顆，但是果實大小沒有顯著差異 (圖 4)。

綜合上述實驗，處理 10% No-2 能增加番茄植株高度、葉片數及繁殖組織數 促進結果，而 10% Heat-No-2 只有增加植株高度與繁殖組織數，對葉片數則沒 有影響。而在其他作物方面，No-2 處理能增加水稻分蘗數、稻穗數及稻穗長度 也可增加洋香瓜花朵數及果實及促進番荔枝果生長及增加果實數目。

第二節、

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對土壤有益微生物對番茄根部表面纏 聚能力

為了瞭解乳酸菌發酵液促進植株生長是因為影響土壤有益微生物纏聚於植 物根部及增加其族群數量，本實驗利用兩株土壤有益微生物 B. thuringiensis (HS1) 與 B. amyloliquefaciens (HS3)，探討這兩株微生物在處理 No-2 土壤環境中在番 茄根部的殘存能力。實驗結果顯示，在水處理組別，B. thuringiensis (HS1) 的菌 數量在第 1 天為 10⁶ CFU/g root 到了 9 天後菌數降了 100 倍，然而在處理了 No-2

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1 天後發現能提高根部 HS1 10 倍的族群數量而在 9 天後菌數下降了 10 倍，但相 較於水處理組菌數高了 100 倍，並且 HS1 的族群數量能維持到 30 天後。而處理 Heat-No-2 的組別，在 1 天後 HS1 族群數量相較水處理組多了 8 倍，而在 9 天後 菌數下降 9 倍但是相較於水處理組則是多了 100 倍，並且能維持至 30 天後 (圖 5A)。此外，本實驗也詴驗了另一株 Bacillus 屬細菌 B. amyloliquefaciens (HS3)。

實驗結果顯示，在水處理組別 HS3 的菌數量在第 1 天為 10⁷ CFU/g root，到了 5 天後菌數降了 100 倍，然而在處理了 No-2 1 天後發現 HS3 的族群數量沒有提升，

而 5 天後菌數下降了 10 倍，但相較於水處理菌數高了 10 倍，並且 HS3 的族群 數量能維持到 30 天後。而處理 Heat-No-2 的組別，在 1 天後 HS3 族群數量相較 水處理組多了 8 倍，而在 9 天後菌數下降 9 倍但是相較於水處理組則是多了 16 倍，並且能維持至 30 天後 (圖 5B)。

綜合上述實驗，處理 10% No-2 能增加 B. thuringiensis (HS1)在根部族群數量 並且維持至 30 天，但在 B. amyloliquefaciens (HS3)部分只有維持細菌族群量的功 能，而 10% Heat-No-2 能增加 B. thuringiensis (HS1) 及 B. amyloliquefaciens (HS3) 在番茄根部族群數量，此外也能維持至 30 天。

第三節、

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄體內過氧化物調控

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液增加番茄 H₂O₂ 累積

為了確定 No-2 是否具有促進番茄過氧化物累積的功能，達到提升番茄抵抗 逆境的能力。將番茄植株培養於植物房，生長至 20 天後處理 10% No-2。每株 處理 25 mL。於 0、12、24、36 和 48 hr 後取頂部第二片葉片 0.05 g 以 TiSO4 呈 色法讀取波長 410 nm 的 OD 值。實驗結果顯示，在處理 No-2 12 小時後相較 水處理 H2O2累積提升了 4 倍，而在 24 小時後 No-2 處理組 H2O2明顯降低，在

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36 小時 H₂O₂又再一次小量提升。在前人研究 PGPR 也釋放誘導物提升植物抗性 產生 ROS，因此本研究將 No-2 經過高溫處理後得到 Heat No-2 並測詴是否有誘 導植物抗性之能力。實驗結果顯示，在處理 Heat No-2 12 小時後 H₂O₂累積相較 於水處理組提升了 4 倍並維持到 24 小時 (圖 6)。綜合以上結果表示，No-2 及 Heat No-2 在處理 12 小時後相較於水處理皆能提升 4 倍 H₂O₂累積。而 Heat No-2 提升效果較 No-2 延長到了 24 小時。

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液提高番茄 POD 的活性

過多的過氧化氫會造成植物細胞死亡，因此植物會啟動清除過氧化氫的酵素 以保護植物細胞。將 No-2 及 Heat No-2 處理番茄後，於 12、24、36、48 hr 後 取頂部第二片葉片 0.05 g 以 Guaiacol 呈色法讀取波長 470 nm 的 OD 值，利 用 (△A470) / 26.6*反應體積 (mL)*稀釋倍率/反應時間/重量(g) 換算 POD 活性。

檢測過氧化氫酶 (POD) 的活性。實驗結果顯示，No-2 處理在 24 小時後，酵素 活性相較於水處理顯著的提升 5 倍並能維持至 48 小時。另外在處理 Heat No-2 在處理後 12 小時快速提升 2 倍的過氧化氫酶活性並且維持到 36 小時。綜合以上 結果表示確認了 No-2 及 Heat No-2 具有促進過氧化氫含量累積和提升過氧化氫 酶的活性，幫助番茄增強抵抗逆境的能力 (圖 7)。

三.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液使番茄葉片離子通透提高

為檢測 No-2 及 Heat No-2 是否有助於番茄快速感受逆境，因此利用離子滲漏 率來測詴。將 No-2 及 Heat No-2 處理番茄後，於 0、12、24、36、48 hr 後取頂

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部第二片葉片以 (細胞破裂前離子含量/細胞破裂後離子含量)*100 (%) 得到離 子滲漏率。實驗結果顯示，在 No-2 處理 48 小時候使離子通透率相較水處組提升 了 3 倍 (圖 8)，而 Heat No-2 則沒有差異。

第四節、

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄植株抵抗環境逆境能力

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液可以降低番茄植株因 UV-C 造成的損傷

在自然生長環境中，過量的紫外線 (UV-C) 造成植株葉部過氧化物大量累積，

並破壞 DNA、蛋白質和細胞膜等結構造成植物死亡。因此本研究為了確認 No-2 提升了番茄 ROS 的累積與清除的能力是否能抵抗 UV 逆境。將番茄植株培養 於植物房，生長至 20 天後處理 No-2，每株處理 25 mL。處理 9 天後進行UV-C 253.7 nm 照射 30 分鐘，於 24 小時進行損傷程度分級觀測。實驗結果顯示，

在照射 UV-C 30 分鐘並靜置 24 小時後，水處理組葉片已經捲曲死亡，而分別 處理 No-2 與 Heat-No-2 的植株葉片捲曲的情況有明顯降低 (圖 9A)，將上述 損傷作分級並量化分析損傷率，結果顯示 UV-C 在水處理組別造成的損傷率高 達 86.67 ± 8.16%，而 No-2 與 Heat-No-2 的損傷率則分別為 16.32 ± 8.16% 與 26.67 ± 13.3% (圖 9B)，為了更進一步確認細胞受損傷的程度，於照射 UV-C 30 分鐘後靜置 12 小時取頂部第二片葉片以 (細胞破裂前離子含量/細胞破裂後離 子含 量)*100 (%) 得到離子滲漏率。結果顯示，UV-C 在水處理組別造成的細胞 損傷率高達 90.26 ± 3.71%，而 No-2 與 Heat-No-2 的損傷率則分別為 51.89 ± 5.17% 與 63.1 ± 7.99% (圖 9C)。這個結果表示 No-2 與 Heat-No-2 增加番茄

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對 UV-C 的耐受能力。

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液能提升植物耐熱能力乳酸菌

除了紫外線影響植株發育之外，高溫也會影響番茄生長或造成植株死亡，此 外也會造成植物內部過氧化物的累積造成植物損傷甚至死亡。因此本研究為了確 認 No-2 提升了番茄 ROS 的累積與清除的能力是否能抵抗高溫逆境。因此將番 茄植株培養於植物房，生長至 40 天後處理 No-2，每株處理 25 mL。9 天後處 理 45℃ 6 小時後拍照。實驗結果顯示，在高溫 45℃ 處理 6 小時靜置 24 小時 後，水處理組葉片已經捲曲死亡，而分別處理 No-2 與 Heat-No-2 的植株葉片 則沒有捲曲的情況 (圖 11A)，將上述損傷作分級並量化分析損傷率，結果顯示 在 45℃ 處理下，水處理組別的損傷率 41.43 ± 4.04%，而 No-2 與 Heat-No-2 的 損傷率則分別為 15.15 ± 1.07% 與 6.9 ± 0.78% (圖 11B)，而且 Heat-No-2 較 No-2 能保護番茄受高溫逆境的損傷。這個結果表示 No-2 與 Heat-No-2 增加番茄對 高溫的耐受能力。

三.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液可以降低番茄植株因乾旱造成的損傷

高溫逆境也可能伴隨乾旱，因此為了確認 No-2 是否能幫助番茄抵抗乾旱逆 境。本研究將番茄植株培養於植物房，生長至 40 天後處理 No-2，每株處理 25 mL，9 天後停止澆水，於 14 天進行拍照觀測。實驗結果顯示，在斷水 14 天 後，水處理組葉片已經捲曲乾枯死亡，而分別處理 No-2 與 Heat-No-2 的植株 葉片則沒有乾枯的情況 (圖 10A)，將上述損傷作分級並量化分析損傷率，結果

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顯示在乾旱處理下，水處理組別的損傷率 100%，而 No-2 與 Heat-No-2 的損傷 率則分別為 54.17 ± 8.59% 與 41.67 ± 9.31% (圖 10B)，這個結果表示 No-2 與 Heat-No-2 增加番茄對乾旱的耐受能力。

第五節、

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄植株 JA 抗性基因表現及抵抗炭 疽菌的感染及降低炭疽病菌孢子發芽率影響

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液增加番茄 JA 相關基因的表現量

過去研究顯示植株體內的 ROS 也會當作訊號傳訊分子誘導植株抗性路徑，

其中 JA 路徑為其中一條。本研究為了確認處理 No-2 是否為啟動 JA 抗病路徑，

利用 Q-RT-PCR 檢測 JA 生合成基因 LeOPR3 及下游受 JA 調控基因 LeCOI1 和 LeJAZ1，在水、No-2 與 Heat-No-2 處理番茄植株基因表現量。在 Q-RT-PCR 的檢測結果顯示，在 10% No-2 處理 1 天後 JA 生合成基因 LeOPR3 增加了 3.2 倍，而在 3 天後相較於水處理的表現量則沒有差異 (圖 12 A)。在 LeCOI1 表現 量方面，在 No-2 處理 1 天後增加了 3.5 倍，且在處理 3 天後相較於水處理還是 有 3.18 倍的差異(圖 12 B)。而 LeJAZ1，在 No-2 處理 1 天後增加了 3.5 倍，而在

3 天後相較於水處理的表現量則沒有差異 (圖 12 C)。而在 Heat-No-2 處理 1 天 後 JA 生合成基因 LeOPR3 增加了 2.4 倍，而在 3 天後相較於水處理的表現量則 沒有差異 (圖 12 D)。在 LeCOI1 表現量方面，在 Heat-No-2 處理 1 天後增加了

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2.25 倍，且在處理 3 天後相較於水處理還有 1.2 倍的差異 (圖 12 E)。而 LeJAZ1，

在 No-2 處理 1 天後增加了 1.54 倍，而在 3 天後相較於水處理的表現量則沒有差 異 (圖 12 F)。上述結果顯示 No-2 與 Heat-No-2 處理確實能增加植株體內 JA 相關 的抗病路徑LeOPR3 及下游受 JA 調控基因 LeCOI1 和 LeJAZ1基因表現。

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液幫助番茄抵抗 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 ) 的感染及降低 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 ) 孢子發芽率

在過去的研究顯示，增加 JA 抗病相關路徑的表現，能增加植株抵抗炭疽病 菌的感染。所以本實驗特別使用 C. gloeosporioides (SA 1-36-2) 接種處理 No-2 與 Heat-No-2 番 茄 植 株 ， 來 檢 驗 No-2 與 Heat-No-2 處 理 對 於 植 物 面 對 C.

gloeosporioides (SA 1-36-2) 感染時的影響。實驗中將番茄植株培養於植物房 40 天，移植至溫室。一周後處理 10% No-2 及 Heat-No-2，7 天處理一次每株處理 100 mL。於處理 11 次後進行孢子接種詴驗(10⁶ spore/mL 分生孢子懸浮液, 含有 10 mM MgSO4 和 1/5 PDB)，於接種後五天進行拍照觀測，並計算病斑。結果顯 示 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 ) 會讓 Mock 組的植株葉片出現黃化及黑色腐爛 的壞疽斑，而在 No-2 與 Heat-No-2 處理植株則沒有黃化(圖 13 A)。病斑數統計 結果顯示在 Mock 已經有 65.67 ± 5.6 個病斑時，在 No-2 與 Heat-No-2 處理組分 別的平均病斑數有 9 ± 1.47 與 24.33 ± 2.46 個 (圖 13A)，這個結果顯現 No-2 與 Heat-No-2 處理的番茄會增加 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 )的抵抗能力。

此外，為了確定提升對抗 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 )的效果不侷限於番茄，

因此本研究將 No-2 處理於番荔枝苗根部，7 天處理一次每株處理 1 L。於處理 5 次後進行孢子接種詴驗(10⁶ spore/mL 分生孢子懸浮液, 含有 10 mM MgSO4 和

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1/5 PDB)，於接種 6 天後進行拍照觀測，並在 2、4、6 與 8 天後計算發病率。結 果顯示 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 ) 會讓 Mock 組的植株葉片出現黑色腐爛的 壞疽斑，而在 No-2 處理植株黑色病斑相較於 Mock 有較小的面積 (圖 14 A)。利 用軟體分析病斑比例，結果顯示 Mock 組在接種 4、6 與 8 天後已經有 34.89 ± 7.48%、47.84 ± 9.1% 與 60.99 ± 12.62%的發病比率，在 No-2 組的發病比率有 17

± 1.97%、29.14 ± 5.55% 與 34.5 ± 7.2% (圖 14 B)。這個結果顯示 No-2 處理增加 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 )的抵抗能力不局限於番茄，在番荔枝也有一樣的效 果。

在前人研究乳酸菌也具有抑制真菌生長的能力，因此本研究將 No-2 與 Heat-No-2 混合 C. gloeosporioides (SA 1-36-2) 10⁶ spore/mL 分生孢子懸浮液(含有 10 mM MgSO4 和 1/5 PDB) 點於 water agar 中於 6 小時後利用顯微鏡計算分生孢 子發芽率。結果顯示 Mock 組在 6 小時後已經有 98 ± 1.22%的發芽率，在 No-2 組的發芽率有 85.5 ± 1.3% (圖 15)。這個結果顯示 No-2 處理抑制 C. gloeosporioides (SA 1-36-2 ) 的分生孢子發芽。

第六節、

乳酸菌 L. paracasei 發酵液對番茄植株 SA 抗性基因表現及抵抗 Pst DC3000、Pst DC3000 avrRpt2 及青枯菌能力

一.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液增加番茄 PR1 的表現量

過去研究顯示植株體內的 ROS 除了誘導 JA 路徑也會同時開啟 SA 抗病路徑。

本研究為了確認處理 No-2 是否再啟動 JA 抗病路徑之外也同時也開啟 SA 路徑，

利用 Q-RT-PCR 檢測 SA 路徑標記基因 LePR1。在 Q-RT-PCR 的檢測結果顯示，

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在 No-2 處理 1 天後 SA 路徑標記基因 LePR1 增加了 3.5 倍，而在 3 天後相較於 水處理的表現量則沒有差異 (圖 16 A)。而在 Heat-No-2 處理 1 天後 SA 路徑標 記基因 LePR1 增加了 7.1 倍，且在處理 3 天後相較於水處理增加了 3.4 倍差異 (圖 16 B)。上述結果顯示 No-2 與 Heat-No-2 處理在誘導 JA 相關的抗病路徑時也會同 時啟動 SA 路徑標記基因 LePR1 的基因表現。

二.

乳酸菌 L. paracasei 發酵液幫助番茄抵抗 Pst DC3000 與 Pst DC3000 avrRpt2 的感染

在過去的研究顯示，增加 SA 抗病相關路徑的表現，能增加抵抗 Pst DC3000 的感染。所以本實驗特別使用 Pst DC3000 與 Pst DC3000 avrRpt2 接種處理 No-2 與 Heat-No-2 番茄植株，來檢驗 No-2 與 Heat-No-2 處理對於植物面對 Pst DC3000 與 Pst DC3000 avrRpt2 感染時的影響。實驗中將番茄植株培養於植物房 40 天，

移植至溫室。一周後處理 No-2 及 Heat-No-2，7 天處理一次每株處理 100 mL。

於處理 11 次後將番茄葉片浸泡於 10⁷ CFU/ml Pst DC3000 含有 (0.025%

silwet L-77) 利用幫浦抽氣 5 分鐘兩次每次間隔 3 分鐘洩壓靜置 4 天後拍照觀察，

並計算病斑。結果顯示 Pst DC3000 會讓 Mock 組的植株葉片出現黑色腐爛的壞 疽斑，而在 No-2 與 Heat-No-2 處理植株則只有少量病斑(圖 17 A)。病斑數統計 結果顯示在 Mock 已經有 26.63 ± 3.8 個病斑時，在 No-2 與 Heat-No-2 處理組分 別的平均病斑數有 11.65 ± 2 與 12.65 ± 1.71 個 (圖 17 B)，這個結果顯現 No-2 與 Heat-No-2 處理的番茄會增加 Pst DC3000 的抵抗能力。

在過去的研究顯示，如果將來自 P. syringae JL1065 的這段 avrRpt2 不會被番 茄辨識到的基因轉進 Pst DC3000，能增加 Pst DC3000 對番茄的感染。所以本實 驗使用 Pst DC3000 avrRpt2 接種處理 No-2 與 Heat-No-2 番茄植株，來檢驗 No-2