國立臺灣大學生農學院農業化學系 碩士論文
Department of Agricultural Chemistry College of Bioresources and Agriculture
National Taiwan University Master Thesis
土壤溶液中砷物種分佈及轉變與其對水稻之毒害 Distribution and transformation of As species in soil
solutions and the toxicity of As to paddy rice
吳懿芳 Yi-Fang Wu
指導教授：李達源 博士 Advisor: Dar-Yuan Lee, Ph.D.
中華民國 98 年 6 月
June, 2009
謝誌
首先我要感謝我的指導教授李達源博士，謝謝老師這兩年來對學生的諄諄教 誨，可以在老師的研究團隊下學習，真的是ㄧ件很棒的事，老師的獨立思考教導 方式，給學生很大的空間，讓學生嘗試地不斷突破自己心中覺得不可能辦到的事，
謝謝老師!感謝我最敬愛的莊愷瑋老師，謝謝老師把懵懂無知的學生帶入土壤實驗 室學習，讓學生不致虛度時光，而且有充實又快樂的大學生活，感謝老師的提拔 與鼓勵，對於學生您總不吝惜地給予嚴厲的鞭策及循循善誘，對於生活及研究也 給予許多的幫助和建議，您的大恩大德學生沒齒難忘。感謝黃正恆老師在學生當 助理的一年裡對學生的照顧與指導，您對學生的指正與建議，學生至今從未忘記；
謝謝白創文學長對學妹的照顧，給學妹多一個學習的機會，就是這一個機會，學 妹得到一個可遇不可求的人生轉捩點，在此向您至上最深的感激。
感謝各位口試委員給予學生諸多的建議與指教，讓學生的論文能夠更致於完 善。感謝何聖賓博士，教導學生製作白金電極及ICP、AA 等儀器設備的操作，老 師詳細的解說與耐心的指導，且不厭其煩的為學生解惑，讓學生對儀器能夠很快 上手並順利完成實驗，此研究能夠完成很感謝老師的大力幫助；感謝鐘仁賜博士，
給學生在種植水稻的建議，您的建議及考量給初次種植水稻的學生很大的幫助；
感謝國立屏東科技大學環境工程與科學系教授廖秋榮博士，百忙之中仍是給予學 生許多建議與指正；感謝國立中興大學土壤環境科學系副教授王尚禮博士，您的 建議給學生很多的思考方向，感覺又是另一番不同的研究方向，能夠與您討論真 的很開心。
在研究方面感謝陳建德老師和劉畊甫同學提供水稻種子及養液配置方法，這 對學生的研究幫助很大。感謝實驗室中最最最美麗又善良的紫慧學姊，您對學妹 的疼愛絕不輸給父母，在學姊的指導下學妹真的受益良多，能夠完成這篇論文真 的都是拜學姐所賜。讓您開車陪著我送樣，讓您陪著我熬夜測樣品，這ㄧ切的ㄧ
於研究給予我適時的提醒與建議。感謝雯婷學姊，雖然與你相處只有短短幾個月，
但是在學妹有問題時，您仍是不厭其煩的教導學妹，詳細分析問題與我討論，真 的很感謝您!感謝實驗室的佳容學姊、瑤瓊學姊和婉菁學姊，對於實驗給予許多建 議及幫助，謝謝學妹淳淳及小茜，幫忙水稻移植及植體清洗工作與一些實驗室的 工作，因為有你們的幫忙，使我可以專心做實驗。
感謝環境檢驗所莊士群組長、郭季華先生和陳明妮小姐，謝謝你們不辭辛勞 的協助，因為你們，學生才得以利用HPLC/ICP/MS 順利的完成研究。
感謝實驗室裡我最親愛的同學-布丁，謝謝妳幫助我測 ICP、洗植體及許多搬 運工作…等，幫助我很多，能夠與你ㄧ起討論實驗真的很開心，這兩年來受您許 多的照顧，也從您身上學到很多做事及學習的方法，您的熱心助人及領導的能力 很令我佩服，很高興能夠與你在同ㄧ間實驗室；也感謝布丁的姐姐幫忙我做實驗，
還經常提供好吃的水果。還有感謝興光幫的大家-品潔、致甫、阿烈、俊廷、阿珠、
火車、小色，感謝你們在這兩年裡給予很大的鼓勵與幫助，能夠認識你們真的很 棒!
最後感謝我的父親-吳銘堺先生和母親-鄭金桂女士，沒有你們就沒有今日的 我，謝謝你們讓我選擇自己的興趣，讓我無後顧之憂地唸書，謝謝你們在我無助 的時候給我加油打氣；還有謝謝姐姐、姊夫、哥哥和大嫂，有你們才有快樂的家，
才有堅強又溫暖的避風港。
摘要
土壤中砷形態的轉變受氧化還原電位、pH 值和微生物的影響。而 As(Ⅲ)的毒性較 As(Ⅴ)大，在溶液中易移動。因此本研究目的在於探討砷在土壤浸水孵育後砷物種 型態及濃度之變化及其對水稻毒害之評估。
本研究以三種土壤性質差異大的土壤－平鎮、太康和將軍系土壤，添加 As(Ⅴ) 製備為0 至 480 mg As(Ⅴ) kg-1等六種不同濃度處理之砷污染土；另取三個不同砷 濃度之關渡平原土壤，為供試土壤。以水土比1：1 的比例作 0 至 42 天的浸水孵 育試驗。土壤溶液抽出後以0.01 M 磷酸溶液作保存，以 HPLC/ICP/MS 測定 As(Ⅲ)、
DMA、MMA 和 As(Ⅴ)含量。結果發現，浸水後，土壤溶液中 As(Ⅲ)濃度隨孵育 時間增加而增加，而總砷濃度以關渡土壤增加最多，且土壤溶液中砷與鐵濃度改 變趨勢相似，可能因土壤浸水期間，土壤溶液中鐵還原導致砷溶出增加。且浸水 後鐵、砷和硫因浸水逐漸還原，砷與鐵、硫形成難溶之化合物，會造成土壤溶液 中砷和鐵含量減少。但在人工製備之砷汙染土，砷在土壤溶液相及固相間未達平 衡，導致土壤浸水孵育後，因砷被土壤固相吸附使溶液相中砷濃度減少。另外發 現在供試土壤之酸性土壤溶液中以As(Ⅲ)佔總砷比例較高，而中性偏鹼性之土壤 溶液則以As(Ⅴ)佔總砷比例較高。浸水孵育後，As(Ⅲ)佔總砷的比例會增加。各供 試土壤種植之水稻，在人工添加480 mg As(V) kg-1處理下皆出現毒害情形。由於 浸水孵育前之土壤溶液中As(Ⅲ)濃度與水稻植體株高有顯著負相關，推估使水稻 株高降低20 %之土壤溶液中 As(Ⅲ)濃度為 0.02 mg L-1；且以NaH2PO4抽出之總砷 濃度與植體株高百分比之劑量反應關係有較顯著的負相關，推估其EC20 為 78.7mg kg-1。因此，此兩種抽出方法可有效評估土壤中砷對水稻毒害之影響。
Abstract
The distribution of As species in soils is influenced by redox potential, pH, and microbial activity. Arsenite is more toxic and mobile than arsenate. Therefore, to understand the As species distribution is very important to evaluate the mobility and phytotoxicity in As-contaminated soils. In this study, the As speciation in soil solutions of flooded As-contaminated soils were determined and the relationship between the As speciation and toxicity to rice plants was investigated.
Three Guandu soils containing different levels of As and three soils spiked with various levels of As(V) were used in this study to determine the As speciation of soil solutions under flooded incubation condition for 42 days. The soil solutions were taken and preserved in 0.01 M H3PO4 immediately and then the concentrations of As(Ⅲ),
DMA, MMA and As(V) were determined using HPLC/ICP/MS. The results showed that in all studied soils As(Ⅲ) concentrations increased with flooding time and the extent of increase was higher in Guandu soils than that in other studied soils. In addition, the change of As concentration had the same pattern with that of Fe. It may result from that As release in soil solution due to Fe reduction or As precipitation with Fe. Moreover, total As concentration in soil solutions also increased with flooding time and the extent of increase was higher in Guandu soils than three As(V)-spiked soils. It may be due to that spiked-As(V) was adsorbed by soil solids during the flooding incubation period.
Among the studied soils, As(Ⅲ) percentages of total As in solutions of acid soils were higher that As(V). On the contrary, As(V) percentages of total As in solutions in alkaline soils were higher that As(Ⅲ). For the relationship between As species concentration in soil solutions with rice seedling growth, As(Ⅲ) concentration before flooding was significantly and better correlated with plant height of rice seedlings than other As species. The effective toxicity concentrations of decreasing 20% of rice plant height were 0.02 mg As(Ⅲ) L-1. The results also showed that there was a significant relationship between the plant height of rice seedlings and soil arsenic extracted by NaH2PO4, and the effective toxicity concentrations of decreasing 20% of rice plant height were 78.7 mg As(Ⅲ) kg-1. Therefore, soil solutions As(Ⅲ) and NaH2PO4
extracted As could be used for the assessment of availability and phytotoxicity of arsenic in soils.
Key words: soil, arsenite, arsenate, HPLC/ICP/MS, paddy rice.
目 錄
摘要……….Ⅰ Abstract………Ⅱ 目錄……….Ⅳ 表次……….……Ⅶ 圖次……….Ⅷ
第一章 緒論………...1
1.1 砷……….1
1.2 砷的汙染………..3
1.3 土壤中的砷……….4
1.4 環境中氧化還原電位變化對砷之影響………..5
1.5 土壤中砷的測定………...8
1.6 研究目的………...9
第二章 材料與方法……….10
2.1 供試土壤之製備………...10
2.1.1 試驗土壤基本性質分析………10
2.1.2 三種供試土壤添加 As(V)之處理……….14
2.1.3 土壤中砷總量測定：砷化氫原子吸收光譜法………...15
2.2 以 NaH2PO4抽出土壤中砷之含量………...16
2.3 土壤浸水不同天數孵育……….…………18
2.3.1 土壤浸水處理………18
2.3.2 浸水孵育土壤溶液的收集與測定………18
2.4 浸水土壤之氧化還原電位測定………...20
2.4.1 白金電極製備………...20
2.4.2 白金電極校正……….20
2.4.3 供試土壤前處理………...21
2.4.4 供試土壤之氧化還原電位測定……….21
2.5 水稻幼苗之毒性試驗………..24
2.5.1 供試水稻品種………...24
2.5.2 供試土壤前處理 ………...24
2.5.3 秧苗培育………...24
2.5.4 實驗方法……….27
2.5.5 植體分解………...27
2.6 統計分析………...28
第三章 結果與討論………...29
3.1 供試土壤之理化性質………...29
3.2 以磷酸二氫鈉抽出土壤有效性砷…………...33
3.2.1 以 NaH2PO4抽出液中鐵和錳含量………...………...36
3.3 供試土壤在浸水孵育前其土壤溶液相中砷濃度及其物種之分布……...39
3.3.1 未添加任何 As(Ⅴ)之土壤，其土壤溶液中砷濃度及其物種之分布….39 3.3.2 添加 As(Ⅴ)之土壤，其土壤溶液中砷濃度及其物種之分佈………….43
3.3.3 浸水孵育前，土壤溶液中鐵、錳、矽和磷濃度…...44
3.4 土壤浸水孵育 42 天期間，土壤溶液中砷的物種及濃度變化……….48
3.4.1 平鎮系土壤………... ..48
3.4.2 太康系土壤……….………...52
3.4.3 將軍系土壤……….………..56
3.4.4 關渡平原土壤-Gd1………..……… 60
3.4.5 關渡平原土壤-Gd2 ………... 62
3.4.6 關渡平原土壤-Gd3………..64
3.5.1 未添加任何 As(Ⅴ)之土壤浸水 42 天後，其土壤溶液中砷濃度
及物種分佈……….68
3.5.2 各供試土壤浸水 42 天後，其土壤溶液中砷濃度及物種分佈…………71
3.6 水稻幼苗毒性試驗……….73
3.6.1 水稻幼苗生長情形………...73
3.6.2 水稻植體乾重與土壤溶液中或 NaH2PO4抽出之砷含量之關係….…80 3.6.3 水稻幼苗生長試驗之植體分析…...84
第四章 結論…………...91
第五章 參考文獻………..………...92
第六章 附錄………..………...102
表 次
表一、應用高效能液相層析分離儀器測定砷之操作參數………...17
表二、感應式耦合電漿質譜儀 (ICP-MS) 儀器操作參數………...17
表三、木村氏B 配方之水耕栽培液………..26
表四、試驗土壤基本性質………..30
表五、試驗土壤以幾種抽出法測定鐵、錳、鋁和砷………..31
表六、以NaH2PO4 抽出土壤土壤中 As(Ⅲ)、DMA、MMA 和 As(Ⅴ)含量及 pH 改變量………...………...34
表七、浸水孵育前，各供試土壤溶液中As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)和總砷…40 表八、浸水孵育42 天，各供試土壤溶液中 As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)和 總砷含量...69
表九、在各供試土壤中種植水稻，水稻幼苗株高、根部和莖部乾重百分比………74
表十、各抽出法抽出之砷含量和水稻生長之劑量反應關係………...77
表十一、各供試土壤之水稻植體所中砷濃度...85
表十二、水稻幼苗自土壤中所吸收之砷量...87
圖 次
圖一、水中無機砷物種之分佈………..….……….2 圖二、不同Eh 和 pH 時無機砷、鐵和錳活性為 10-4之分佈………...6 圖三、在不同Eh 和 pH 時，砷與硫之物種分佈圖（總砷為 10-5M 和總硫為
10-3M）………....7 圖四、測定浸水土壤之氧化還原電位……….………..23 圖五、水耕育苗……….………..25 圖六、(A)平鎮系和(B)太康系土壤以 NaH2PO4抽出之溶液中鐵和錳含量………..37 圖七、(A)將軍系和(B)關渡平原三種不同砷等級之土壤以 NaH2PO4抽出之溶液
中鐵和錳含量…….………...38 圖八、浸水孵育前，土壤溶液中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA 和 MMA 含量百分比
圖(A)平鎮系；(B)關渡平原；(C)太康系；(D)將軍系………..………..41 圖九、浸水孵育前，(A)平鎮系和(B)太康系土壤分別添加 0、30、60、120、240 和 480 mg As(Ⅴ) kg-1處理下，土壤溶液中鐵、錳、矽和磷含量………...45 圖十、浸水孵育前，(A)將軍系土壤分別添加 0、30、60、120、240 和 480 mg As(Ⅴ) kg-1處理下和(B)關渡平原土壤，土壤溶液中鐵、錳、矽和磷含量…...46 圖十一、添加60 mg As(Ⅴ) kg-1之平鎮系土壤浸水孵育42天期間，土壤溶液中 (A)砷物種和(B)鐵、錳、矽、磷含量隨(C)Eh變化之情...49 圖十二、添加240 mg As(Ⅴ) kg-1之平鎮系土壤浸水孵育42天期間，土壤溶液中 (A)砷物種和(B)鐵、錳、矽、磷含量隨(C)Eh變化之情形…...50 圖十三、添加(A)60和(B)240 mg As(Ⅴ) kg-1之平鎮系土壤浸水孵育42天期間 ，土壤溶液中pH變化之情形…………...51 圖十四、添加60 mg As(Ⅴ) kg-1之太康系土壤浸水孵育42天期間，土壤溶液中 (A)砷物種和(B)鐵、錳、矽、磷含量隨(C)Eh變化之情形…...53
圖十五、添加240 mg As(Ⅴ) kg-1之太康系土壤浸水孵育42天期間，土壤溶液中 (A)砷物種和鐵、錳、矽、磷含量(B)隨Eh(C)變化之情形………...54 圖十六、添加(A)60和(B)240 mg As(Ⅴ) kg-1之太康系土壤浸水孵育42天期間 ，土壤溶液中pH變化之情形……….…..……...55 圖十七、添加60 mg As(Ⅴ) kg-1之將軍系土壤浸水孵育42 天期間，土壤溶液中 (A)砷物種和(B)鐵、錳、矽、磷含量隨(C)Eh 變化之情形……...57 圖十八、添加240 mg As(Ⅴ) kg-1之將軍系土壤浸水孵育42 天期間，土壤溶液 中(A)砷物種和(B)鐵、錳、矽、磷含量隨(C)Eh 變化之情形…………...58 圖十九、添加(A)60 和(B)240 mg As(Ⅴ) kg-1之將軍系土壤浸水孵育 42 天期 間，土壤溶液中 pH 變化之情形……….……...59 圖二十、添加關渡平原土壤-Gd1 土壤浸水 42 天期間，土壤溶液中(A)砷物種 和(B)鐵、錳、矽、磷含量隨(C)Eh 變化情形………..……….61 圖二十一、添加關渡平原土壤-Gd2土壤浸水孵育42天期間，土壤溶液中(A)砷 物種和(B)鐵、錳、矽、磷含量隨(C)Eh變化之情形………...….63 圖二十二、添加關渡平原土壤-Gd3 土壤浸水孵育 42 天期間，土壤溶液中(A) 砷物種和(B)鐵、錳、矽、磷含量隨(C)Eh 變化情形...65 圖二十三、(A)Gd1、(B)Gd2 和(C)Gd3 之關渡土壤浸水孵育 42 天期間，土壤 溶液中 pH 變化之情形………....66 圖二十四、鐵圈照片……….………..67 圖二十五、土壤浸水孵育42 天，土壤溶液中 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA 和 MMA 含量百分比圖(A)平鎮系；(B)關渡平原；(C)太康系；(D)將軍系...70 圖二十六、土壤浸水孵育前與浸水孵育42 天之土壤溶液中 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和 總砷濃度之比較………...………72 圖二十七、供試土壤於人工氣候室種植水稻幼苗生長情形...75
圖二十八、水抽出之As(Ⅲ)含量與植體株高百分比（% of control）繪製成劑 量－反應關係曲線...78 圖二十九、NaH2PO4抽出之總砷含量與植體株高百分比（% of control）繪製 成劑量－反應關係曲線……….79 圖三十、土壤浸水42 天溶液之總砷含量與植體總乾重百分比（% of control）
繪製成劑量－反應關係曲線………...81 圖三十一、NaH2PO4抽出之總砷含量與植體總乾重百分比（% of control）繪 製成劑量－反應關係曲線………...………...83 圖三十二、供試土壤浸水42 天之土壤溶液中 As(Ⅴ)濃度與植體地上部砷濃度 之相關…...86 圖三十三、供試土壤浸水42 天之土壤溶液中 As(Ⅲ)濃度與植體根部總吸收量 之相關……….88 圖三十四、供試土壤中NaH2PO4抽出之土壤溶液中As(Ⅲ)濃度與植體根部
總砷吸收量之相關………...88 圖三十五、平鎮、太康、將軍和關渡平原(Gd3)土壤之水稻根部照片…………....90
第一章 緒論
1.1 砷砷位於元素週期表上ⅤA 族，為類金屬，原子量為 74.9 g mol-1，離子半徑為 0.58A (三價砷，As(Ⅲ)) 和 0.64o A (五價砷，As(Ⅴ))。砷在地殼組成中佔 0.00005 o
%，其含量於地殼元素中排名第 20 位，於岩石中含有約 0.5-2.5 mg kg-1。砷是多價 元素，在自然界中以-3、0、3 和 5 等型態存在。在環境中的型態為亞砷酸 (H3AsO3、 H2AsO3-)、砷酸(H3AsO4、H2AsO4-、HAsO42-)、亞砷酸鹽、砷酸鹽、一甲基砷酸、
二甲基砷酸、砷化三氫等。
砷為致癌物質，其毒性依型態之不同而異，由於砷酸和亞砷酸的解離常數 (pKa) 不同，砷之型態會隨pH 值之變化而改變。如圖一，自然水體中無機 As(Ⅲ) 之優 勢物種為H3AsO3，而無機As(Ⅴ)多以 H2AsO4–
和HAsO42-
之型態存在。在土壤中 因As(Ⅴ)以離子態存在，較以分子態存在之 As(Ⅲ)容易被金屬氧化物所吸附，所 以As(Ⅲ)較 As(Ⅴ)易移動，對生物之危害程度為 As(Ⅴ)的 60 倍(Ferguson and Gavis, 1972; Jain and Ali, 2000)。
但不論是無機As(Ⅲ)或無機 As(Ⅴ)，對生物體而言皆具毒性。因 As(Ⅴ)之物 化性質與磷酸根 (H2PO4-)相似，它會干擾生物體內之氧化磷酸化作用與 ATP 之生 合成；而毒性較強的As(Ⅲ)則會傾向於與氫硫基鍵結，進而對蛋白質之功能造成 危害。
圖一、水中無機砷物種之分佈 (Meng et al., 2000)。
Figure 1. Inorganic arsenic species in water. The figure shows the distribution of As(Ⅴ) and As(Ⅲ) species as a function of pH at an ionic strength of 0.04 M (Meng et al., 2000).
1.2 砷的汙染
環境中砷的來源包括：人為活動之冶煉場產生的砷氣、製煤廠的煤渣和各種 重要的農業藥劑的使用，如殺蟲劑-砷酸鈣和砷酸鉛、脫葉劑（砷酸鈉、亞砷酸鈉、
DMA [(CH3)2AsO2H]）和除草劑（DSMA(CH3AsO3Na2)、MSMA(CH3AsO3HNa)、
MAA(CH3AsO3H2)）(Woolson et al., 1971)等，因使用過量或處理不當，會在土壤表 面累積，造成砷的污染。
而天然的砷污染大多發生在水的污染中，例如 1980 年代台灣西南沿海（嘉義、
台南等縣）及蘭陽平原（沿海地區五結及冬山等鄉鎮）因天然地質條件造成地下 水中含高量的砷，導致當地居民飲用含砷井水造成砷中毒 (Hsu et al., 1999; Tseng et al., 2000)，為台灣早期的砷中毒案例。
近年，關渡平原農地土壤經檢測，砷含量超過我國環保署 2008 年發佈之土壤 污染管制標準值（60 mg As kg-1），且砷污染之農地面積達128 公頃，推測其因早 期引用地熱谷之含砷溫泉水灌溉農田所致（林，2008）。
相較於自然風化過程，人為活動造成之砷累積較為顯著。由於飲用含砷之水 源，易引發砷的慢性中毒（如烏腳病），甚至會導致人體各器官的病變引發癌症，
因此世界衞生組織 (World Health Organization, WHO) 於 2000 年時，建議將引用水 中砷的標準濃度值由原本之50 μg L-1下修至10 μg L-1，我國於2000 年也將飲用水 標準改為10 μg L-1，而土壤中砷的管制標準仍為60 mg kg-1。
1.3 土壤中的砷
土壤因性質不同，存在土壤溶液中的砷含量也會有差異。而 Porter 等人(1975) 認為存在溶液相中的可溶性砷為可以被植物直接且有效吸收的部份。因此若土壤 溶液中砷愈多，對植物的毒害相對會增加。
土壤中之砷的化合物大部分為 As(Ⅴ) (H2AsO4-、HAsO42-)、As(Ⅲ) (H3AsO30) 和少量的有機砷。許多研究指出無定型的鐵鋁（氫）氧化物 (Pierce, 1982；Sakata, 1987)、黏粒含量 (Elkhatib, 1984) 和 pH 值 (Pierce, 1982; Sakata, 1987; Elkhatib, 1984) 等土壤的性質對砷的吸附的影響很大。Johnson (1969) 研究發現約有 90 % 的砷會存在土壤黏粒相中。而且Frankenberger (2002) 也認為土壤中吸附砷之主要 吸附體為鐵、鋁和錳（氫）氧化物，尤其是結晶性較差的金屬氧化物，可提供較 多的特定表面，使其比結晶性佳的氧化物可吸附高量的砷(Livesey, 1981)。因此土 壤中砷的移動主要是受到吸/脫附反應的影響。
另外，土壤中磷酸根 (H2PO4-) 為陰離子，與 As(Ⅴ)的離子半徑大小和分子量 相似，因此，在土壤中具有相似的物化特性。Rubins 與 Dean (1947) 表示，As(Ⅴ) 和磷酸根 (H2PO4-) 在土壤膠體上可互相取代和交替吸附。由於 As(Ⅴ)與磷酸根 (H2PO4-) 會互相競爭在土壤中的鍵結位置 (Manning and Goldberg, 1996) 及植物 中傳輸系統的吸收位置(Meharg et al., 1994)，因此，在高砷污染的土壤中添加高量 磷肥可能會提高土壤中砷的有效性，反而會增加對植物的毒害。
矽酸在土壤中與 As(Ⅲ)對氧化鐵的吸附行為模式相似，矽酸 (H2SiO3) 的第一 個解離常數為 pK1=9.9 (David and Allison, 1988) ，同屬於弱酸。於土壤中易與砷競 爭吸附位置。因此，Ma 等人 (2008) 指出矽酸於土壤溶液中之含量愈高，愈可能 會降低植物對砷的吸收。
1.4 環境中氧化還原電位變化對砷之影響
土壤中的 pH、氧化還原電位和微生物皆會影響砷型態的改變 (Aggett and O’
Brien, 1985; Masscheleyn et al., 1991; Laverman et al., 1995; Woolson, 1971)。而土壤 中砷的氧化狀態決定其可溶性、移動性、生物有效性及毒性（Penrose, 1974；Duel, 1972；Brannon, 1987）。
由圖二可知，在氧化狀態下，pH 值較低時(pH<6.9)，H2AsO4-為主要砷物種型 態；高pH 值時，則以 HAsO42-為優勢物種；而在還原條件下，pH 值低於 9.2 時，
則以H3AsO30為砷之主要之型態。因此，在好氧的環境下，以As(Ⅴ)物種存在較 穩定，而在厭氧條件下多以As(Ⅲ)存在。
一般土壤的氧化還原電位範圍約為+500 mV（表土）至-300 mV（強還原情況）
(Patrick and DeLaune, 1977)。Deual 和 Swoboda (1972) 之研究指出，在還原條件下，
由於砷鐵化物還原，且As(Ⅴ)會還原為 As(Ⅲ)而進入土壤溶液中( Masscheleyn, 1991a)，導致土壤浸水後可溶性砷增加。如圖二為 Lindsay (1979) 和 Dove (1985) 等人利用熱力學數據評估不同Eh 和 pH 時無機砷、鐵和錳活性為 10-4下之分佈情 形。另外Nickson (1998) 和 Zheng (2004) 也發現存在地下水中微生物分解可溶性 有機碳，使鐵發生還原，造成吸附在鐵上的砷溶出。
Sadiq (1983) 發現在還原條件下，土壤溶液中亞砷酸鹽的可溶性增加，但是在 高度還原時會形成砷硫化物的沉澱（見圖三）。因此，土壤氧化還原電位會影響植 物對砷的吸收，也可能造成砷因淋洗而流失或進入地下水。
圖二、不同Eh 和 pH 時無機砷、鐵和錳活性為 10-4之分佈圖（Lindsay, 1979；Dove, 1985）。
Figure 2. Eh-pH diagram for the As-H2O system. Activities of As, Mn and Fe were all taken to be 10-4（Lindsay, 1979; Dove, 1985）.
750
250
-250
-500 -750 500
Eh (m V)
750
250
-250
-500 -750 500
Eh (m V)
圖三、在不同Eh 和 pH 時，砷與硫之物種分佈圖（總砷為 10-5 M 和總硫為 10-3 M）
（Ferguson et al., 1972）。
Figure 3.Eh-pH diagram for arsenic at 25℃ and one atmosphere with total arsenic 10-5 M and total sulphur 10-3 M（Ferguson et al., 1972）.
1.5 土壤中砷的測定
對於生物來說，極微量的砷對生物是有益的，但是當其濃度超過某一程度後，
反而對生物造成毒害(Emsley, 1991)。存在土壤吸附相之可利用性砷或植物有效性 砷的危害性較大，因此，必須找到一個抽出方法，抽出土壤有效性砷，對於人體 健康風險評估、訂定適當處置廢棄物之政策和砷對環境危害及安全性之評估與管 理皆是有幫助的。
而大多數污染土皆使用化學抽出法，抽出存在土壤中離子交換相、表面吸附 相、沉澱相、有機物嵌合相和殘留相中的重金屬(Tessier et al.,1979; Sposito et al.,1982; Hickey and Kittrick, 1984; Gibson and Farmer, 1986; Ma and Rao, 1997)。其
主要是利用序列萃取的過程來抽出存在特定化學相中之污染物的含量(Pierzynski, 1998)。而以磷酸鹽溶液抽出土壤有效性砷的使用較廣 (Manning and Martens, 1997;
Loeppert et al., 2002)，是以磷酸根利用配位基交換方式將砷脫附。
一般對於以一種抽出方法抽出土壤中可溶性砷與植物總砷吸收量得到好的相 關之研究較少。因植物可吸收之砷是存在土壤相中為可利用性、可溶性和生物有 效性的砷，所以當土壤中砷濃度增加，對於植物產生之毒性反應也會增加。
若能找到一個好的抽出方法，可有效抽出存在土壤中有效性砷濃度與植體中 總吸收砷量之間的相關性對於土壤、食品或水質之砷濃度限制之規範是有利的。
Adriano (2001)作了許多關於土壤中植物有效性砷的抽出方法之研究。但是對於可 以適當的抽出土壤中的砷並精確反映出植體吸收之總砷的抽出方法或化學藥劑則 較少。
1.6 研究目的
前人研究以 NaH2PO4抽出法、去離子水抽出法及氧化鐵濾紙抽出法抽出土壤 中的砷濃度對於小麥生長皆有顯著的負相關（郭，2008），且以氧化鐵濾紙抽出之 砷濃度與植體地上部之總砷吸收量的負相關性較佳，但旱田和水田之砷物種型態 不同，且其移動性和可溶性又隨土壤浸水後Eh 和 pH 改變而有所不同，對植物之 有效性亦不同。
因此，本研究探討土壤於浸水前、浸水期間及浸水後土壤溶液中砷的物種及 濃度之變化情形，並於浸水狀態下種植水稻，藉由測定水稻植體之總砷吸收量與 土壤溶液中砷濃度之相關性，進一步評估土壤溶液中對水稻產生毒害之有效性砷 濃度。
第二章 材料與方法
2.1 供試土壤之製備2.1.1 試驗土壤基本性質分析
本研究選用三種 pH 值及質地等土壤性質差異較大之台灣代表性土壤表土（未 受砷污染），桃園縣埔心茶改場之平鎮系土壤 (Pc) 、台南學甲鎮美和村之將軍系 土壤 (Cf) 和高雄縣燕巢鄉之太康系土壤 (Tk) 。另以三個砷不同等級之關渡平原 土壤表土 (Gd1、Gd2、Gd3)，共 6 種土壤，經採集、風乾後，磨碎通過 10 mesh 篩網，充分混合後保存於塑膠桶內備用。
1. 土壤水分含量
取附蓋秤量瓶於烘箱內，以 105℃烘 24 小時，視為恆重，之後蓋上秤量瓶蓋 取出，至於乾燥皿冷卻，之後秤秤量瓶重 (W0)，各取通過 10 mesh 篩網的適量試 驗土壤置於稱量瓶中，秤秤量瓶重與土壤重 (W1)，之後將其放入烘箱內，以 105±5℃烘 24 小時，將烘乾後的樣品視為恆重，蓋上瓶蓋取出，置於乾燥皿冷卻，
測定烘乾後稱量瓶重與土壤重 (W2)。
計算水分含量： (%) 100%
0 2
2 1
2 ×
−
= −
w w
w wH O w
2. 土壤質地 (Bouyoucos, 1936)
取 50 g 試驗土壤（通過 10 mesh）置於 500 mL 的玻璃燒杯，加入 200 mL 的 蒸餾水，之後倒入金屬攪拌杯中，加入10 mL 5％偏磷酸鈉 （sodium meta
phosphate，Na(PO3)n (n>3)，和光純藥，試劑級）溶液，並加入蒸餾水加至杯口 2/3 處，在攪拌器 (Eijkelkamp) 下攪拌 10 分鐘，之後將全部土壤懸浮液移入 1000 mL 量筒中，定量至1000 mL，用攪拌槳攪動 20 次後，將攪拌槳取出開始計時，在 20 秒之後放入比重計，於40 秒時記錄比重計讀數 (Ps)，此為黏粒與坋粒之含量，再
含量，並同時做空白與溫度校正。溫度校正是以19.4 ℃為基準，每增 1 ℃，比重 讀數應加0.3，每減 1 ℃，比重計讀數應減 0.3。
計算砂粒、坋粒與黏粒含量；
砂粒(%)=100%-( Ps ×100%
烘乾土重 )
黏粒(%)= Pc ×100%
烘乾土重
坋粒(%)=100%-(砂粒%+黏粒%)
之後以美國農部土壤調查手冊土壤質地分類三角圖判斷各個土壤質地。本實驗為 三重複，控制組只添加5％偏磷酸鈉溶液。
3. 土壤 pH 值 (McLean, 1982)
取通過10 mesh 篩網的定量試驗土壤，加入相同重量蒸餾水，使土壤與蒸餾水 重量比為1：1，攪拌均勻後，靜置 1 小時後，以 pH meter (Orion) 測定土壤 pH 值。
本實驗為3 重複。
4. 土壤有機質含量 (Walkley-Black 之濕式氧化法) (Nelson and Sommers, 1982) 秤取乾重為1 克試驗土壤（過 80 mesh），置於500 mL 三角錐瓶中，加入 10 mL 1N 重鉻酸鉀 (potassium dichromate，K2Cr2O7，J.T. Baker，analysis grade)，搖勻之 後迅速加入20 mL 濃硫酸 (sulfuric acid，H2SO4，Fluka，analysis grade) 將土壤與 溶液搖勻後，靜置30 分鐘，之後加入約 200 mL 蒸餾水，加入 10 mL 85% 濃磷酸，
以降低Fe(Ⅲ)的干擾，之後再加入 O-phenanthroline（取 3.71 g O-phenanthroline 和 1.74 g FeSO4．7H2O 於蒸餾水中，定量至 250 mL）指示劑三滴，另外以 98.05 g Fe(NH4)2(SO4)2．6H2O (Mallinckrodt AR○R)與 10 mL L-1濃硫酸(sulfuric acid 95-97%，
H2SO4，Fluka)，溶於 400mL 蒸餾水中，冷卻後稀釋至 500 mL，配置 0.5 N 硫酸亞
烘乾土重
烘乾土重
計算土壤有機質含量：
O.M(%)=
(g) 100 0.77
1.724 1000
1 4 1.0 12 B) 1 S (
10× − × × × × ×烘乾土重
5. 土壤無定型鐵、錳和鋁氧化物含量 (McKeague and Day, 1966)
秤取24.87 g (NH4)2C2O4‧H2O 和 12.61 g H2C2O4‧2H2O 於 900 mL 之蒸餾水中，
並將pH 調整至 3，之後定量至 1 L，製備草酸銨試劑。秤取 0.3 g 試驗土壤（通過 80 mesh），置於離心管 (Nalgene) 中，加入 30 mL 草酸銨試劑，於暗處震盪 4 小 時後，以離心機在10000 rpm 下離心 10 分鐘，以孔徑 0.45μm 濾膜過濾，將濾液以 蒸餾水稀釋2 倍後以 ICP-OES (Perkin-Elmer，Optima 2000) 在波長 238.204nm 下 分析鐵濃度、在波長257.61 nm 下分析錳濃度、在波長 396.153 nm 下分析鋁濃度 及在波長193.69nm 下分析砷濃度，並同時做空白試驗，以利配置檢量線濃度時作 背景添加，此實驗為三重複。
6. 土壤游離性鐵、錳和鋁氧化物含量 (Mehra and Jackson, 1960)
配置0.3 M 檸檬酸鈉 (sodium citrate，NaC6H5O7．2H2O ，J.T.Baker，analysis grade) 與 1.0 M 碳酸氫鈉 (sodium hydrogen carbonate，J.T.Baker，NaHCO3，analysis grade)，取體積比為 8：1 配製成檸檬酸鈉-碳酸氫鈉混合液，並調整 pH 至 7.3。秤 取0.25 g 試驗土壤（通過 80 mesh），置於離心管中，加入 20 mL 檸檬酸鈉-碳酸氫 鈉混合液，將離心管置於75-80℃的恆溫水浴槽，使瓶內、外溫度達平衡後，加入 1 g 連二亞硫酸鈉 (sodium dithionite，Na2S2O4，Fluka)於離心瓶中，持續攪拌ㄧ分 鐘，間歇攪拌15 分鐘後，趁熱以離心機在 10000rpm 下離心 10 分鐘，收集上清液。
重複加入20 mL 檸檬酸鈉-碳酸氫鈉混合液與 1g 連二亞硫酸鈉於離心瓶中及攪拌 和離心步驟二次，若土壤未呈灰色，可重複抽出步驟且增加連二亞硫酸鈉添加量；
烘乾土重(g)
收集三次上清液後定量至100 mL，以 0.45μm 濾膜過濾，將濾液稀釋 2 倍後，以 ICP-OES (Perkin-Elmer，Optima 2000) 分析鐵、錳、鋁和砷濃度，同時做空白試驗，
以利配置檢量線濃度時作背景添加，此實驗為三重複。ICP-OES 測定條件如下：
Wavelength：Fe: 238.204nm；Mn: 257.61 nm；Al: 396.153 nm；As:193.69 nm Viewing mode: axial mode
Plasma gas flow: 1.5 L/min Auxiliary gas flow: 0.2 L/min Nebulizer gas flow: 0.8 L/min RF power: 1300 Watts
Sample uptake rate: 1.5 mL/min
2.1.2 三種供試土壤添加 As(V)之處理
根據行政院環保署法規，ㄧ般土壤中砷之土壤污染管制標準值（全量）為60
mg kg-1，因此，當土壤中砷總量超過60 mg kg-1時，為受砷汙染之土壤。本研究以 三種不同性質之代表性土壤，製備6 種不同砷汙染程度土壤，為模擬關渡之污染 土壤，因已分析關渡土壤中總砷濃度約520 mg kg-1，因此，實驗將人工添加As(Ⅴ) 之土壤上限訂於480 mg kg-1。
秤取 12.497 g 砷酸鈉（disodium hydrogen arsenate heptahydrate，Na2HAsO4． 7H2O，J.T.Baker，analysis grade） 於蒸餾水中，之後定量至 1 L，配製 3000 mg As(Ⅴ) L-1溶液。分別取0、15、30、60、120、240 mL 之 3000 mg As(Ⅴ) L-1溶液加入適 量蒸餾水中混合，倒入1.5 kg 的土壤中，之後添加蒸餾水至土壤達飽和容水量，
利用玻棒將土壤與溶液充分混合，製備0、30、60、120、240 和 480 mg As(Ⅴ) kg-1 供試土壤，之後將土壤於室溫下風乾。風乾後再將土壤磨碎、過10 mesh 篩網，加 蒸餾水至飽和容水量並攪拌均勻，室溫下風乾，重複加水及風乾之乾濕交替步驟 三次，模擬田間狀況，乾濕交替時間ㄧ次為20 天。完成後將供試土壤研磨過 10 mesh 篩網，並將土壤充分混合均勻，儲放於塑膠筒內，作為土壤浸水、有效性砷抽出、
氧化還原電位監測和水稻幼苗生長試驗之用。
2.1.3 土壤中砷總量測定：砷化氫原子吸收光譜法（行政院環保署環境檢驗所，
2002，NIEA S310.62C）
秤取風乾之土壤 1 g （精秤至 1 mg，過 80 mesh 篩網），置於 125 mL 三角錐 瓶中，加入5 mL 30 % 過氧化氫 (hydrogen peroxide 30%，H2O2，Sigma Aldrich，
analysis grade) 後，將三角瓶置於加熱板上，溫度為 75-80℃，加熱至近乾，然後 冷卻至室溫。加入5 mL 30 % 過氧化氫後，重複加熱和冷卻步驟。之後再加入 10 mL 30 % 過氧化氫，加熱至近乾，然後冷卻至室溫，以分解土壤有機質。待土壤 完全冷卻後，加入9.6 M 鹽酸 (先取少許蒸餾水，緩慢加入 796 mL 濃鹽酸
(hydrochloric acid 37%，MERCK，analysis grade)後定量至 1 L) 溶液 30 mL，以 150 rpm 震盪 1 小時後，於室溫下靜置 24 小時。以 Whatman No.40 或同級品濾紙過濾，
用水定量至50 mL。同時做空白試驗。此實驗為三重複。取 5 mL 土壤消化液於 50 mL 定量瓶中，加入 5 mL 濃鹽酸 (hydrochloric acid 37%，HCl，MERCK，analysis grade)，混合均勻。之後再加入 5 mL 還原劑（5% KI (potassium iodide，Riedel-de Haën，analysis grade) 與 5% ascorbic acid (L (+)-ascorbic acid puriss，Sigma Aldrich，
analysis grade) 混合液），搖晃瓶身使溶液混合，以石蠟膜封住瓶口，於室溫下靜 置隔夜，使五價砷還原為三價砷。之後以蒸餾水定量至50 mL，並以氫化物產生器 原子吸收光譜儀測定砷濃度 (FI-HG-AAS，Perkin-Elmer AAnalyst 200) 。調整波長 193.7nm 為測定砷的最大吸光度，調整還原劑(0.2 % 氫硼化鈉 (sodium
borohydride，NaBH4，Fluka，analysis grade) 溶於 0.05 %氫氧化鈉溶液 (sodium hydroxide，NaOH，J.T.Baker，analysis grade) 流速為 4-7 mL/min，流洗液為 10 % 濃鹽酸，其流速調整為9-11 mL/min。另以 CRM025-050 土壤標準樣品驗證本方法 之回收率。
2.2 以 NaH2PO4抽出土壤中砷之含量（Huang et al., 2006）
取 119.99 g NaH2PO4‧H2O (sodium dihydrogen phosphate，MERCK，analysis grade)溶於蒸餾水中，定量至 2 L，配製 0.5M 磷酸二氫鈉溶液。秤取 2 g 供試土壤
（過10 mesh）於 50 mL 離心管中，加入 30 mL 0.5M 磷酸二氫鈉溶液，並以試管 攪拌器將溶液與土壤混合均勻，實驗為三重複，同時作空白試驗。於往復式振盪 器中以170 rpm 震盪 2 小時，之後以 10000 rpm 離心 10 分鐘。離心後，迅速以 0.45μm 濾膜過濾，取3 mL 濾液加入已添加 3 mL 0.02 M 磷酸溶液之離心管，蓋上蓋子將 離心瓶左右震盪，使土壤濾液與保存液充分混合，並放入冰箱中低溫保存，之後 以HPLC/ICP/MS (Agilent Technologies 1200 series fitted with 7500cs ICP-MS，條件 設定見下頁) 測定溶液中砷的各物種含量。另取 3 mL 濾液加入已添加 3 mL 之 10 % HNO3的離心管中，蓋上蓋子將溶液充分混合後以ICP-OES (Perkin-Elmer，Optima 2000) 測定溶液中鐵和錳含量，最後測定濾液的 pH 值。所有的測定須在 12 小時 內完成，避免砷物種改變、鐵沉澱或pH 值改變等因素影響測定值。
表一、應用高效能液相層析分離儀器分離砷物種之操作參數。
Table 1. Arsenic species was separated with HPLC under the following conditions.
表二、應用感應式耦合電漿質譜儀 (ICP-MS) 儀器測定砷之操作參數
Table 2. Arsenic was determined with ICP-MS (Agilent 7500cs) under the following conditions.
HPLC ( PRP-100X Anion Exchange) Agilent Technologies 1200 series Mobile phase 30 mM (NH4)2HPO4 , pH 6.5 Flow rate 1. 5mL/min
Injection volume 50μL
Run time 18 min
ICP-MS Parameter RF Power 1500 W Sample depth 8 mm Carrier gas 0.95 L/min Makeup gas 0.21 L/min Extract 1 8.7 V Extract 2 -85 V Omega bias-cs -34 V Omega lens-cs 8.8 V Cell entrance -36 V QP focus -8 V Cell exit -56 V Octopole bias -18 V OP bias -16 V
Cell gas flow 3 mL/min He
2.3 土壤浸水不同天數孵育 2.3.1 土壤浸水處理
秤取 20 g 供試土壤（過 10 mesh 篩網）於 50 mL 離心瓶（高 15 cm，直徑 6 cm）， 秤量離心瓶加土重。根據行政院農業委員會、農業試驗所等單位編印的作物施肥 手冊，針對水稻種植實施三要素推薦施肥用量：N：110 kg ha-1；P2O5：40 kg ha-1； K2O：90 kg ha-1。為模擬種植水稻之土壤浸水情況下砷的變化，須在20 g 土壤中 施用等量的基肥，另控制水土比為1：1，所以將 5.238 mg 20 g-1 soil 硫酸銨 (ammonium sulfate，Riedel-de Haën，(NH4)2SO4，Analysis)、0.767 mg 20 g -1 soil 過 磷酸鉀 (potassium dihydrogen phosphate，KH2PO4，MERCK，pro analysi) 和 1.080 mg 20 g-1 soil 氯化鉀 (potassium chloride，KCl，MERCK，pro analysi) 配製為高濃 度養液，各取5 mL 和蒸餾水 5 mL，加入 20 g 供試土壤中，以試管攪拌器將溶液 與土壤混合均勻，秤量總重量(W1)，實驗為三重複。之後將離心瓶於 25℃下，以 旋轉式振盪器150 rpm 振盪 30 分鐘。打開離心瓶瓶蓋，分別將離心瓶靜置於恆溫 箱中20～25℃下浸水 0＊、3、6、12、24、42 天（其中人工添加 As(V)之供試土壤 0 、30、120、480 mg As(V) kg-1 soil 僅作 0 天和 42 天之浸水孵育），每隔三天添 加蒸餾水至W1，使土壤維持在水土比1：1 之比例的浸水狀態下。
0＊：上述之浸水0 天是指水土比 1：1 之離心管，在經過 30 分鐘振盪後立即以高 速離心機 10000 rpm 離心 10 分鐘，之後經 0.45 μm 濾膜過濾後取出土壤溶液，完 全沒有經過靜置孵育之過程。
2.3.2 浸水孵育土壤溶液的收集與測定
收集土壤溶液的前一天添加蒸餾水至 W1，收集土壤溶液當天，將離心瓶蓋上 蓋子後，秤重並紀錄。離心前手搖離心瓶15 秒，立即以高速離心機 10000 rpm 離 心10 分鐘，之後迅速以 0.45 μm 濾膜過濾，取 3 mL 濾液加入已添加 3 mL 0.02 M
磷酸溶液的離心管，蓋上蓋子將離心瓶左右震盪，使土壤濾液與保存液充分混合，
並放入冰箱中低溫保存，之後以HPLC/ICP/MS（Agilent Technologies 1200 series fitted with 7500cs ICP-MS，條件設定參數如表一、二）測定溶液中砷的各物種含量。
HPLC 分離管柱 (PRP-100X Anion Exchange) 分離砷物種依序為 As(Ⅲ)、DMA、
MMA、As(Ⅴ)，其分離時間約為 2.1 7 min、2.96 min、4.38 min 和 8.25 min。
另取 3 mL 濾液加入已添加 3 mL 10 %硝酸溶液的離心管中，蓋上蓋子將溶液 充分混合之後以ICP-OES (Perkin-Elmer，Optima 2000) 測定溶液中鐵、錳、矽和 磷含量。最後測定濾液的pH 值。所有的測定須在 12 小時內完成，避免砷物種改 變、鐵沉澱或pH 值改變等因素影響測定值。
2.4 浸水土壤之氧化還原電位測定 2.4.1 白金電極製備（何，2007）
剪取 3 cm 的白金線（直徑 0.5 mm，純度 99.997%）、25 cm 的銅線（直徑 2 mm）
和20 cm 的玻璃管（內徑 4 mm，外徑 5 mm）。以硼砂 (di-sodium tetraborate decahydrate ，Na2B4O7．10H2O，MERCK，prto analysi) 作為助熔劑，將白金線與 銅線一端都沾上少量硼砂，利用高溫火焰將兩端連接在一起，冷卻後，以數位三 用電錶(DHA，DMM-93B)，調整電阻測定範圍為 20 K，正負極分別接觸白金線和 銅線，測量之電阻值若顯示0.002 Ω，視為導電良好之成功品。之後將已連接好的 白金線和銅線穿入長20 cm，內徑 4 mm 玻璃管中，前端白金線露出約 1 cm，以高 溫火焰將玻璃管開口封住並與白金線緊密結合，之後慢慢離開火焰，冷卻後，將 白金電極半成品放入105℃烘箱，烘乾後將電極半成品浸入水中一天，測試玻璃管 是否與白金線密合，如電極半成品的玻璃管中未進水即為可使用之電極，之後再 放入105℃烘箱烘乾，以 RTV 矽膠（RTV Sealant 748）將玻璃管另一開口與銅線 封住，銅線露出玻璃管約3 cm，於室溫下靜置 3 天，儲放於有乾燥劑之夾鍊袋中 備用。
2.4.2 白金電極校正
各取4 g Quinhydrone 粉末分別加入 400 mL pH 4 和 pH 7 的緩衝溶液中，以攪 拌子攪拌約一小時，製備Quinhydrone 飽和緩衝溶液，因 Quinhydrone 具有固定之 氧化還原電位，且氧化還原電位(Eh)與 pH 間存在著一定的關係，因此，將白金電 極在Quinhydrone 飽和之 pH 4 和 pH 7 緩衝溶液中靜置 2 小時，之後放入 Ag/AgCl2
參考電極，以氧化還原電位測定儀 (model 420A，ORION) 測得之氧化還原電位 (Ehobs)，帶入公式(2)計算，每支白金電極得一固定斜率，若其斜率(m)不在-50 至-60 mV 之間（因斜率理論校正值為-59 mV，即增加一個 pH 單位，Eh 減少 59 mV），
則此白金電極不能使用，須重新製作。之後以斜率及EpH4或EpH7值計算參考電極
電位 (Eref) ，每一支白金電極皆有其各自的斜率(m)及 Eref。
2.4.3 供試土壤前處理
取 200 g 人工添加 As(Ⅴ)並經三次乾濕交替之供試土壤 0、60、240 mg As(Ⅴ) kg-1 soil 和關渡土壤 (Gd1、Gd2、Gd3) 置於 300 mL 塑膠燒杯中，每ㄧ處理二重複，
共計24 個樣品。另模擬水稻種植之基肥施用和控制水土比 1：1，則添加 185 mL 的蒸餾水和氮、磷、鉀高濃度養液（分別取5.238 g (NH4)2SO4、0.767 g KH2PO4、 1.0798 g KCl 定量至 500 mL）各 5 mL，於 200 g 供試土壤中，以玻棒將溶液和土 壤攪拌均勻後，於室溫下靜置。
2.4.4 供試土壤之氧化還原電位測定
將製作完成之白金電極插入浸水的供試土壤中，每盆一支，並以溫度計固定 夾做固定，令白金電極置於300 mL 塑膠盆中央位置，以氧化還原電位測定儀 (model 420A，ORION) 監測人工添加 As(Ⅴ)之供試土壤 0、60、240 mg As(Ⅴ) kg-1 soil 和關渡土壤(Gd1、Gd2、Gd3)，浸水 42 天期間的氧化還原電位變化，其裝置 見圖四。另以pH meter (model 920A，ORION) 測定上清液的 pH 值變化。約每 四天測定一次，並每天沿杯壁緩慢添加少許的蒸餾水至水土比1：1 之刻線，以補 充液體表面蒸發之水份。為使所測得之氧化還原電位 (Eh) 能夠互相比較，需將所 測得之電位值 (Eobs) 加上 Eref，之後以斜率校正回pH 為 7 時之 Eh（公式(3））。
公式：
) ...(1 0.0592pH -
E - E
E 0Q,HQ ref
obs = 2
E ：實測值，obs E0Q,H2Q：理論值，E ：參考電極。 ref 假設-0.0592=m，E0Q,HQ-E = b
二式相減：E'obs-Eobs =3m， ...(2) 3
-E
m=E'obs obs
pH=7 時的氧化還原電位值：
3)Eh=Eobs+Eref +(pH-7)×m ...(
pH：上清液之 pH 值，m：白金電極之斜率。
圖四、測定浸水土壤之氧化還原電位。
Figure 4. Determination of redox potential of flooded soils.
2.5 水稻幼苗之毒性試驗 2.5.1 供試水稻品種
選用臺灣地區廣泛栽種之水稻 (Oryza sative L.) 品種－台農六十七號。
2.5.2 供試土壤前處理
取各供試土壤 200 g 置於 300 mL 的塑膠燒杯中，每ㄧ處理三重複，共計 63 個樣品。添加200 mL 的蒸餾水，使水土比為 1：1 （土壤高度 4 cm，水面高度 3 cm）， 以玻棒將水和土壤攪拌均勻後，於20～25℃下靜置 12 天，並於移植稻株前 3 日，
根據行政院農業委員會、農業試驗所等單位編印的作物施肥手冊，針對水稻種植 實施三要素推薦施肥用量：N：110 kg ha-1；P2O5：40 kg ha-1；K2O：90 kg ha-1。經 計算後在200 g 供試土壤中，須添加 0.0524 g (NH4)2SO4、0.0077 g KH2PO4和0.0108 g KCl。所以分別取 5.238 g (NH4)2SO4、0.767 g KH2PO4、1.0798 g KCl 定量至 500 mL 配製為高濃度養液後各添加5 mL 於土壤溶液中。實驗為三重複。
2.5.3 秧苗培育
首先將台農 67 號水稻置於 50 ml 的燒杯中，加入 2％的次氯酸鈉溶液，浸泡 消毒30 分鐘。之後將水稻用蒸餾水沖洗約 10 分鐘，完全洗除次氯酸鈉殘留液。
把水稻平鋪於濕潤擦手紙上，並置於培養皿中，將培養皿用錫箔紙完全包覆（遮 光），放入37℃的恆溫箱中，經過 1-2 天的催芽。待發芽後，播種於特製網架上（圖 五），網架置於600 mL 的玻璃燒杯中，以錫箔紙將燒杯包住，避免藻類滋長，並 添加木村氏B 配方之水耕栽培液 (Kimura B solution，表三) ，至淹過種子的一半。
水耕液配法為，取900 mL 蒸餾水於定量瓶中，分別加入 1 mL A 原液、1 mL B 原 液和1 mL C 原液，然後定量至 1 L。之後以氫氧化鈉和鹽酸調整 pH 值至 4.7。育 苗期間，每天加水二次，每三天更換ㄧ次培養液，放置於20-25℃人工氣候室內之 鐵架上。
圖五、水耕育苗。
Figure 5. The hydroponics of rice seedings.
表三、木村氏B 配方之水耕栽培液（戶刈義次，1963）。
Table 3. The Kimura B solution.
Kimura B solution
Stock A in 1 L
500 X (NH4)2SO4 24.1 g
KNO3 9.25 g
MgSO4 33.0 g
KH2PO4 12.4 g
Stock B in 1 L
500 X Fe-citrate 7.5 g
Ca(NO3)2 30.0 g 1 N HCl 500 mL
Stock C' in 1 L Stock C' x 1/10 = Stock C 10000 X H3BO3 1.55 g
MnSO4．H2O 0.34 g ZnSO4．7H2O 0.58 g CuSO4．5H2O 0.13 g
H2MoO4 0.08 g
Kimura B solution in 1 L
Stock A 1 mL
Stock B 1 mL
Stock C 1 mL
pH 4.7 - 4.8
2.5.4 實驗方法
將長至四葉的台農 67 號水稻幼苗移植至處理的供試土壤中，選取五株高度相 當且強壯之水稻幼苗，插入塑膠盆中間位置，使水稻幼苗可平均吸收養分，稻株 插入土壤的深度約指節一節之距離，使稻株直立，每盆五株，每一處理三重複。
本試驗在台大生農學院之人工氣候室中進行，溫度範圍為20-25℃的自然光照透明 室內，將盆栽置於鐵架上，每天適量的補充水份至土面上固定高度（水土比1：1），
種植滿三十天後全株採收。採收後，以自來水將根部沖洗乾淨，再以0.1 N HCl 潤 洗兩次，洗去根表面的細小土粒，之後再以蒸餾水沖洗，以擦手紙將植體上多餘 水分吸乾後，將稻株分為地上及地下部，並測量株高後分別放進信封袋中。
2.5.5 植體分解 (修改自 Cai et al., 2000)
將信封袋置於 70-80℃的烘箱中 48 小時後，取出信封袋秤量植體乾重，之後 將植體剪碎，依植體可能之砷濃度低到高的順序以植體磨碎機磨碎植體，將植體 粉末混合均勻儲放於玻璃瓶中備用。
1.植體分解方法
取 0.1-0.2 g 植體粉末於 50 mL 分解瓶中。添加 10 mL 濃 HNO3，手搖分解瓶，
使植體粉末與濃硝酸混合，將分解瓶置於加熱板上加熱，加熱溫度至125℃，加熱 2 小時。靜置冷卻後，緩慢添加 1 mL 的 H2O2，125℃加熱 30 分鐘。拿起分解瓶置 於厚紙板上後冷卻，以去離子水定量至50 mL。同時做空白試驗，實驗為三重複。
將分解液以0.45 μm 濾膜過濾後，濾液以氫化物產生器原子吸收光譜儀 (FI-HG-AAS， Perkin-Elmer AAnalyst 200)測定濾液中砷含量。
2.6 統計分析
本研究分別將水、NaH2PO4抽出和浸水42 天抽出之土壤溶液中砷含量
（As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和總砷）取對數值，將供試土壤所生長之水稻株高換算為控制組
（未添加As(Ⅴ)）之百分比（關渡平原土壤以砷濃度較低之 Gd1 土壤作為控制組）， 採用非線性迴歸方程式來套配土壤在水、NaH2PO4抽出和浸水孵育42 天抽出之土 壤溶液之砷含量和水稻幼苗生長劑量-反應關係 (sigmoidal dose-response
relationship, SigmaPlot software) 曲線，並由此非線性迴歸方程式去推估水稻受毒害 使其株高為生長最適條件（控制組）之80%時，土壤分別以水、NH2PO4抽出和浸 水孵育42 天抽出之土壤溶液之砷含量 (Effective Concentration, EC20) 。
除了使用水稻株高作為受害依據外，本研究也將供試土壤所生長之水稻植體 乾重換算為控制組（未添加As(Ⅴ)）之百分比（關渡平原土壤以砷濃度較低之 Gd1 土壤作為控制組），採用非線性迴歸方程式來套配水、NaH2PO4抽出和浸水孵育42 天抽出之土壤溶液中砷含量（As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和總砷）和水稻幼苗生長之劑量-反應 關係。
第三章 結果與討論
3.1 供試土壤之理化性質本實驗使用之供試土壤其理化性質分析結果如表四、表五，其中母質方面，
平鎮系是紅壤，太康為台灣黏土，將軍則為砂頁岩土壤，而關渡平原土壤的母質 則為安山岩。
在 pH 值方面，平鎮系屬酸性土壤（pH 4），且三個砷不同等級的關渡平原土 壤為偏酸性（pH 4.8-5.1），而將軍系土壤為中性（pH 7.5），太康系土壤則偏鹼性
（pH 7.8）。以土壤質地來看，除將軍系土壤為壤土外，其他皆屬黏土，且平鎮、
太康和關渡土壤之黏粒含量為將軍土壤黏粒的兩倍以上。
另以濕式氧化法測得土壤有機質含量，以農業試驗所農田肥力調查報告之土 壤有機物含量分級（林，1967），平鎮系和將軍系分別為 15 和 14 g kg-1，屬於較低 等級(1~2%)；太康土壤有機質為 21 g kg-1，屬中等級(2~3%)；關渡土壤為 49-55 g kg-1，屬高等級(>3%)。
而土壤中所含的鐵鋁錳氧化物，以草酸銨所抽出之範圍為 3.5-21 g kg-1，其中 關渡平原土壤無定型鐵含量為平鎮系土壤的3-6 倍。無定型鐵含量依序為：Gd3(21 g kg-1) > Gd2(15 g kg-1) > Gd1(12 g kg-1) > Cf(4.1 g kg-1) > Pc(3.5 g kg-1) > Tk(2.6 g kg-1)。以 DCB 抽出之游離氧化鐵含量之依序則為：Gd3(35g kg-1) > Pc(28 g kg-1) >
Gd2(21 g kg-1) > Gd1(16 g kg-1) > Tk(15 g kg-1) > Cf(7.6 g kg-1)，平鎮系中其（氫）氧 化鐵大部分為結晶性為主，而關渡平原土壤則多以無定型鐵為主。游離性錳的含 量在各土壤中皆很低，含量範圍為0.11-0.39 g kg-1。各供試土壤之無定型鋁含量範 圍為0.8-2.6 g kg-1和游離鋁為1.1-3.1 g kg-1，其在各土壤中分佈趨勢與鐵氧化物相 似。無定型態鋁以Gd3、Gd2 最高，其次為平鎮土壤，將軍土壤為最低。
‡: W alkl ey -B lac k metho d
51 Cl ay 47 .4 32 .3 20 .3 4.9 Gd3
55 Cl ay 52 .3 30 .9 16 .8 4.8 Gd2
49 Cl ay 40 .5 35 .3 24 .2 5.1 Gd1
14 Lo am 20 .2 48 .5 31 .3 7.5 Cf
21 Cl ay 49 .3 30 .8 19 .9 7.8 Tk
15 Cl ay 44 .9 29 .6 25 .5 4.0 Pc
g k g
-1-- --- --- - % --- -- -- -- S oil:H
2O=1:1
Or ga ni c m att er ‡ Te xt ure Cl ay Si lt Sand pH So il ‡: W alkl ey -B lac k metho d
51 Cl ay 47 .4 32 .3 20 .3 4.9 Gd3
55 Cl ay 52 .3 30 .9 16 .8 4.8 Gd2
49 Cl ay 40 .5 35 .3 24 .2 5.1 Gd1
14 Lo am 20 .2 48 .5 31 .3 7.5 Cf
21 Cl ay 49 .3 30 .8 19 .9 7.8 Tk
15 Cl ay 44 .9 29 .6 25 .5 4.0 Pc
g k g
-1-- --- --- - % --- -- -- -- S oil:H
2O=1:1
Or ga ni c m att er ‡ Te xt ure Cl ay Si lt Sand pH So il
表四、試驗土壤基本性質。 Table 4. Physical and chemical properties of the studied soils. ‡: Walkley-Black method.
e manganese, iron, and aluminum oxides extracted by dithionite-citrate-bicarbonate method.
ese, iron, and aluminum oxides extractedby ammonium oxalate method.
528 270 248 3141 2612 261 211 34570 21288
192 120 101 2559 2603 149 117 21348 15370
164.13 3.84 1634 1660 155 111 16136 12066
6.7 N.D.N.D.1061 816 248 232 7587 4110
11N.D.N.D.2024 1192 393 386 14974 2627
11N.D.0.125 5661 2489 329 232 27626 3459
---mg kg-1 ---Total AsAs ¶As §Al ¶Al §Mn¶Mn§Fe ¶Fe § e manganese, iron, and aluminum oxides extracted by dithionite-citrate-bicarbonate method.
ese, iron, and aluminum oxides extractedby ammonium oxalate method.
528 270 248 3141 2612 261 211 34570 21288
192 120 101 2559 2603 149 117 21348 15370
164.13 3.84 1634 1660 155 111 16136 12066
6.7 N.D.N.D.1061 816 248 232 7587 4110
11N.D.N.D.2024 1192 393 386 14974 2627
11N.D.0.125 5661 2489 329 232 27626 3459
---mg kg-1 ---Total AsAs ¶As §Al ¶Al §Mn¶Mn§Fe ¶Fe § 出法測定鐵、錳、鋁及砷。 The amounts of Fe, Mn, Al and As extracted by various methods of the studied soils.
以環檢所2002 年公告土壤中砷總量測定方法，測得三個不同砷等級之關渡平 原土壤的總砷含量分別為17、203、520 mg kg-1。而未添加As(Ⅴ)之平鎮、太康和 將軍土壤，其土壤總砷含量分別為11、11、6.7mg kg-1。平鎮、太康、將軍和Gd1 土壤總砷濃度皆低於土壤砷污染管制標準值60 mg kg-1。而關渡平原土壤因早期引 用磺港溪之溫泉水灌溉，導致土壤中含高含量的砷和鐵，屬於天然之砷污染土壤
（徐，2009）。
3.2 以磷酸二氫鈉抽出土壤有效性砷
土壤中的砷有各種型態並非全部可以被植物吸收利用，因此土壤全量砷無法 用來代表或評估對人體、植物及土壤微生物的危害風險。砷與磷同屬ⅤA 族元素，
在土壤中也同樣是以陰離子型態存在，具有相同的吸附行為(Violante and Pigna, 2002; Carina, et al., 2007; Wauchope, 1975)。且磷酸與砷酸解離常數(pKa)相近，但磷 酸分子較小，價數高，對土壤之吸附力較砷酸及亞砷酸高(O’Niell, 1995)。與磷酸 相比，磷酸鹽的抽出對土壤的損害低(Min et al., 2008)，由於磷酸根化學性質與 As(Ⅴ)較相似(Terwelle and Slater, 1967)，在土壤中會相互競爭土壤及植體上吸附位 置。且磷酸根可有效的抽出土壤中與鐵、鋁結合相的砷(Alam et al., 2001)，也就是 存在土壤中交換相及吸附相部份的砷，此為土壤固相中容易受環境改變而溶於土 壤溶液中，利於植物或土壤微生物吸收的部份。因此磷酸鹽被廣泛應用於土壤有 效性砷的抽出。Huang 等人（2006）發現以 0.5 M NaH2PO4抽出之砷含量與該土壤 種植之作物中砷含量作相關，得到有很好的相關性。因此本實驗以此方法評估土 壤中砷的生物有效性。
在無 As(Ⅴ)添加處理下，在六種供試土壤之 NaH2PO4抽出液中砷物種大部分 為As(Ⅴ)，約佔總砷 83 %-98 %。抽出之 As(Ⅴ)含量依序為（表六）：Gd3(58.9 mg kg-1) > Gd2(27.7 mg kg-1) > Gd1(2.14 mg kg-1) > Cf(1.51 mg kg-1) > Tk(1.44 mg kg-1)
> Pc(0.23 mg kg-1)。表示土壤在氧化狀態下與鐵錳結合之可交換性砷及土壤溶液中 的砷物種以As(Ⅴ)最多。與水抽出砷含量相比，NaH2PO4抽出之砷含量較水抽出 高出很多（約13-2535 倍），且大部分皆是 As(Ⅴ)。
而抽出之 As(Ⅲ)含量以 Gd3 為最高，大致為：Gd3(2.21 mg kg-1) > Gd2(1.75 mg kg-1) > Gd1(0.43 mg kg-1) > Cf(0.04 mg kg-1) > Tk(0.03 mg kg-1) > Pc(0.01 mg kg-1)。
其含量約為As(Ⅴ)的 1/4-1/275 倍，表示風乾土壤狀態下，土壤中砷大部分是以 As(Ⅴ)存在。
