國立臺東大學應用科學系研究所

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國立臺東大學應用科學系研究所碩士論文

Department of Applied Science National Taitung University

Master Thesis

以銀奈米粒子修飾氧化奈米碳管偵測大滅松

Oxidized multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles for the detection of dimethoate

許君瑋 Chun-Wei Hsu

指導教授：胡焯淳博士邱泰嘉博士 Advisor：Cho-Chun Hu, Ph.D.

Tai-Chia Chiu, Ph.D.

中華民國 105 年 6 月

June, 2016

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國立臺東大學應用科學系研究所碩士論文

Department of Applied Science National Taitung University

Master Thesis

以銀奈米粒子修飾氧化奈米碳管偵測大滅松

Oxidized multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles for the detection of dimethoate

許君瑋 Chun-Wei Hsu

指導教授：胡焯淳博士邱泰嘉博士 Advisor：Cho-Chun Hu, Ph.D.

Tai-Chia Chiu, Ph.D.

中華民國 105 年 6 月

June, 2016

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I

致謝

離開學生身分三年後再次回到學生身分，有些許的不習慣，兩年不算長也不算短的時間，終於又完成人生一個重要階段。感謝我的兩位指導老師胡焯淳老師及邱泰嘉老師，在研究生涯中的悉心教導，讓我可以順利進行實驗並完成他。

也感謝曾韋龍老師不遠千里撥冗前來擔任我的口試委員，感謝他指導我的碩士論文，並且給予見解使論文內容可以更加完善。

這兩年的研究過程中，除了老師的指導外，要感謝實驗室裡的大家，謝謝催化組的先鋒宇晨、松權及紹華，在我一進實驗室時對催化完全不了解的狀況下，

幫我解決不少難題，並且給我很多資料，讓我減少碰壁機會。再者就是和我同期的實驗室夥伴，在研究過程中，和我一起討論的催化組晉瑜、中逸和雅筑；總是陪我熬夜加班再摸黑騎車回市區的電泳組俊良、裕賢和柏邑，後期寫論文時給我不少意見的裕軒及在寫英文文章時幫我修改的子儀，還有裕峰、尹杰、貫廷、元傑、建盛和義聖等等，不論是實驗上幫忙或者平常吃飯閒聊都讓我研究生涯可以更順利更精彩。

最後要感謝我的家人，願意支持我再讀研究所，並且當我的最大後盾，也要感謝身旁一群好朋友、好姐妹，在我難過低潮想放棄時，給我鼓勵和不斷幫我加油打氣，還有和我一起共事的同事靜慧，因為妳的協助，讓我更能無後顧之憂的完成學業。

兩年生活，要感謝的人太多，請容許以畢業證書致上我的感謝，謝謝大家讓我可以順利完成此項任務。

2016 仲夏許君瑋於臺東大學應用科學系筆

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II

中文摘要

本研究利用銀奈米粒子 (Ag NPs) 修飾於氧化後多壁奈米碳管

(OxMWCNTs) 合成具仿過氧化酶催化活性 (peroxidase-like activity) 之複合材料 (Ag NPs/OxMWCNTs) 並偵測大滅松。此複合材料可催化過氧化氫 (H2O2) 和 Amplex red (AR) 的反應，使 AR 氧化為試鹵靈 (resorufin)，並在螢光波長 584 nm 具有紅色螢光。此方法於 100 mM Tris-borate (pH 7.0) 緩衝溶液中，將 1.0 mM H2O2 與 0.1 mM AR 加入含大滅松之 Ag NPs/OxMWCNTs 中，與大滅松反應後，會降低催化活性，因此螢光產物之波長 584 nm 會淬滅且顏色會由紅色轉淡，故可利用催化反應造成螢光之變化偵測大滅松。此方法可專一性的偵測大滅松，偵測範圍 0.01~0.35 μg/mL，偵測極限為 0.003 μg/mL (S/N = 3)，並成功偵測水樣及臍橙中的大滅松。

關鍵詞：奈米感測器；銀奈米粒子；奈米碳管；仿過氧化物酶催化；大滅松

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III

英文摘要

Abstract

A novel method for the detection of dimethoate based on the peroxidase-like activity of silver-nanoparticles-modified oxidized multiwalled carbon nanotubes (Ag NPs/OxMWCNTs) have been developed in this work. The synthesized Ag NPs/OxMWCNTs showed excellent peroxidase-like catalytic activity in hydrogen peroxide-Amplex red (AR) system (in which H₂O₂ is reduced to water and the AR is oxidized to resorufin, with the resorufin fluorescence at 584 nm being used to monitor the catalytic activity). After dimethoate was added to Ag NPs/OxMWCNTs, the interaction between dimethoate and the Ag NPs inhibited the catalytic activity of Ag NPs/OxMWCNTs. The decrease in fluorescence was used for the detection of dimethoate in the range of 0.01~0.35 μg/mL (R²= 0.998) with a detection limit of 0.003 μg/mL (signal/noise = 3). This method exhibited good selectivity for the detection of dimethoate even in the presence of high concentration of other pesticides.

Consequently, the method was applied to measure the concentration of dimethoate residue in lake water and fruit, thus obtaining satisfactory results.

Keywords ： nanosensor, silver nanoparticles, carbon nanotube,

peroxidase-like catalyst, dimethoate

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IV

農藥為用於防除農林作物或其產物有害生物者，或調節農林作物生長或影響其生理作用者或用於調節有益昆蟲生長者及經中央主管機關公告可直接供前述各項目使用者皆屬農藥；農藥原體指用以加工後述各目成品農藥所需之有效成分原料，亦屬農藥 [1]。目前農藥之種類依防治對象不同共分為殺蟲劑 (insecticides)、

殺菌劑 (fungicide)、除草劑 (herbicides)、除蟎劑 (miticides)、殺鼠劑 (rodenticide)、

殺線蟲劑 (nematocide) 、植物生長調節劑 (plant growth regulator) 、除螺劑 (molluscicides) 及除藻劑 (algicides) 等 [2]，依來源可將農藥再分為化學農藥及生物性農藥，而殺蟲劑大多屬於化學農藥，也是目前使用量最多的農藥 [3]。

其中，殺蟲劑依官能基的不同又可分為有機氯 (organochlorines)、有機磷 (organophosphates)、胺基甲酸鹽類 (carbamates)、合成除蟲菊精 (pyrethroid)、類尼古丁類 (nicotinoids) 、昆蟲生長調節劑 (insect growth regulators)、抗生性殺蟲劑 (antiobiotic insecticides)、沙蠶毒素類似物或前驅物 (nereistoxin analogue) 及含苯之比酢類殺蟲劑 (phenylpyrazole) 共 9 類。

有機氯此類農藥是早期被合成出來，對昆蟲具神經毒、胃毒及接觸毒等，但因為殘留期過久，會造成環境的污染，因此已陸續被禁用；滴滴涕 (DDT)、阿特靈 (aldrin)、安殺番 (endosulfan) 等均為此類殺蟲劑 [4]。有機磷的基本結構是磷酸，與磷原子相連的氧、硫、碳及氮有不同的組合，此類農藥因對生物及人類具毒性，因此被視為對環境不友善之農藥，目前各國也都相繼限用或禁用；馬拉松 (malathion)、陶斯松 (chlorpyrifos)、二氯松 (DDVP) 及本篇偵測的大滅松 (dimethoate) 皆為此類農藥 [5]。胺基甲酸鹽類是胺基甲酸的衍生物，對水的溶解度較其他殺蟲劑來的好，因此可隨水淋洗去除，固屬非持續性農藥，加保扶 (carbofuran)、加保利 (carbaryl)、納乃得 (methomyl) 等為此類農藥 [4]。有機磷

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及胺基甲酸鹽類此兩種類型農藥可透過抑制昆蟲中乙醯膽鹼酯酶 (acetylcholinesterase；AChE)，使昆蟲死亡。農藥可抑制乙醯膽鹼酯酶，在乙醯膽鹼酯酶被抑制住的情況下，導致生物體內乙醯膽鹼 (acetylcholine；ACh) 不斷累積，造成隨意肌急遽痙孿，終至麻痺而影響呼吸系統 [6]；胺基甲酸鹽類與有機磷殺蟲劑不同的是，對物種的專一性較高 [7]。天然的除蟲菊 (pyrethrin) 價格昂貴且在太陽光下易分解，揮發性低及容易受紫外線影響而分解，因此合成除蟲菊精由天然菊花萃取提煉而成，濃度低即可對昆蟲及水生生物產生高毒性，但此類農藥對人畜是安全的；芬化利 (fenvalerate)、益化利 (esfenvalerate) 及畢芬寧 (bifenthrin) 為此類殺蟲劑 [4]。可尼丁 (clothianidin)、益達胺 (imidacloprid)、賽速安 (thiamethoxam) 等為類尼古丁類殺蟲劑，此類為系統性藥劑，可由植物吸收後由下向上分布，並有良好的根系作用系統；主要機制是作用於昆蟲中央神經系統，並阻斷後段突觸原細胞對乙醯膽鹼接受器。布芬淨 (buprofezin)、二福隆 (diflubenzuron) 等為蟲生長調節劑，此類化合物是抑制幾丁質生物化學合成，扮演抗脫皮劑，導致害蟲在幼期或蛹期死亡，對人畜毒性低及安全。阿巴汀 (abamectin)、賜諾殺 (spinosad) 等為抗生性殺蟲劑，機制為激化乙醯膽鹼與接受者作用，促使昆蟲因此中毒或影響 γ-胺基丁酸的作用而影響神經系統的功能。

培丹 (cartap) 、免速達 (bensultap) 等屬沙蠶毒素類似物或前驅物，這類型的殺蟲劑，作用機制也是在乙醯膽鹼接受器上，造成昆蟲中央神經系統中毒。芬普尼 (fipronil) 為含苯之比酢類殺蟲劑，是 1987 年被發現，機制為干擾氯離子通過 γ-胺基丁酸，藉以擾亂昆蟲中央神經系統，對昆蟲及脊椎動物有相當高之選擇性，並可使用於土壤害蟲防治及種子處理 [8]。

臺灣氣候多變加上潮濕環境，農民對於農作物的施藥是不可避免的，但過多的農藥釋放於環境中，或殘留於農作物上，皆會造成人體健康及環境生態的災害 [9]。

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目前臺灣農藥殘留主要檢測方式有兩種，其一為化學檢驗法 (chemical methods) ，由主管機關訂定公告方法，搭配氣相層析質譜儀 (gas chromatographytandem mass spectrometer；GC/MS/MS) 及液相層析質譜儀

(liquid chromatographytandem mass spectrometer；LC/MS/MS) 當偵測器檢測。其優點為可一次測定農藥項目較多，並且可分別定性與定量；但缺點則是需要昂貴儀器，成本較高。另一種檢測方法稱為生化法 (biochemical method)，此機制透過因農藥會抑制乙醯膽鹼酯酶，可依乙醯膽鹼酯酶抑制效果搭配分光光度計檢測農藥總殘留量；此方法雖可快速且可現場施測，但只能針對有機磷及胺基甲酸鹽類等這兩大類農藥進行總量檢測，雖無法針對農藥分別定性及定量，但由於其方便性因此目前仍有檢測站用此方法進行蔬果中農藥殘留檢測 [10]。

商業化的檢測方式外，近期奈米技術盛行，開始有奈米技術偵測農藥的開發。

藉由奈米微小的體積開發新的分析方法，其優點為分析的探針相對是低成本，所需的設備和試劑也較簡單，並且可不需繁瑣的前處理過程即可有好的淨化效果，

並使偵測更具靈敏度。

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貳、奈米感測器偵測農藥

一、感測器搭配酶之偵測方式

近年來，由於奈米技術開發愈趨於成熟，藉由奈米微小的體積及簡單合成方式，期望開發出低成本、高靈敏度，且改善繁瑣前處理過程之偵測。因此許多利用奈米材料開發的感測器，包含金奈米粒子 ( gold nanoparticle；Au NPs)、銀奈米粒子 (silver nanoparticle；Ag NPs) 或者量子點 (Quantum dots；QDs) 等感測器偵測農藥的方法被發表。

由於乙醯膽鹼酯酶關係，因此一部分的奈米感測器是基於乙醯膽鹼酯酶之作用而開發。2014 年 Yongnian Ni 團隊利用硫代乙醯膽鹼 (acetylthiocholine；

ATCh) 與乙醯膽鹼酯酶之間的作用關係，並搭配檸檬酸鈉包覆銀奈米粒子 (citrate-capped Ag NPs)，製備出可以偵測有機磷農藥三氯松的感測器。由於硫代乙醯膽鹼會被乙醯膽鹼酯酶分解成硫代膽鹼 (thiocholine)，硫代膽鹼上的 SH 官能基，會使銀奈米粒子聚集；而材料之吸收波長 369 nm 吸收峰會因聚集而下降，

一旦加入三氯松後，因可抑制乙醯膽鹼酯酶的作用，使硫代乙醯膽鹼不被水解，

就無法產生硫代膽鹼亦無法使銀奈米粒子聚集，而吸收峰即可回升，藉由吸收峰之變化量定量三氯松濃度。線性範圍是 0.25~37.50 ng/mL ，LOD 為 0.18 ng/mL；

應用於水的偵測，回收率 98.4 %，分析時間也只需 15 分鐘，是個快速的偵測方式 [11]。 2015 年 A. Mukherjee 團隊藉由銀奈米粒子因受到硫代膽鹼 SH 官能基影響而聚集時，其吸收 382 nm 峰值會下降，並且顏色會從本來的黃色轉變成無色；但加入三氯松及馬拉松後，會因抑制乙醯膽鹼酯酶的反應，使銀奈米粒子不會聚集，而吸收 382 nm 峰值會回升，藉由吸收的變化量判定三氯松及馬拉松。此方法偵測極限分別為 2.4020 nM 及 0.0780 nM，並成功用於田埂旁之用水、

蘋果及甘藍菜之檢測 [12]。

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此外，2015 年 Youyu Zhang 團隊藉由合成上轉換奈米粒子 (upconversion nanoparticles；UCNPs)，使其螢光共振能量轉移到金奈米粒子上，產生螢光共振效應 (fluorescence resonance energy transfer；FRET) 偵測甲基巴拉松、大滅松及亞素靈。亦是硫代膽鹼上的 SH 官能基使金奈米粒子聚集，則因上轉換奈米粒子之螢光共振能量無法轉移，因此螢光不變；反之，加入農藥後可抑制乙醯膽鹼酯酶而上轉換奈米粒子可將能量轉移到金奈米粒子。應用於真實樣品 (蘋果、辣椒、黃瓜) 中檢測甲基巴拉松，回收率介於 96.00~110.00 %，RSD 小於 8.43 %，

是個方便、快速且高靈敏的感測器 [13]。2015 年 Feng Gao 團隊藉由內濾效應 (Inner Filter Effect；IFE ) 搭配比色法 (colorimetric) 及磷光法 (phosphorimetric) 的雙訊號機制檢測有機磷農藥，包含對氧磷、巴拉松、毆滅松及二氯松。此方法根據 Mn-ZnS QDs 的磷光會藉由金奈米粒子的內濾效應而淬滅；當農藥加入時，

可抑制乙醯膽鹼酯酶使金奈米粒子的吸收峰回升，而 Mn-ZnS QDs 的磷光則會下降，藉由兩個訊號判定農藥之濃度。可測得農藥偵測極限分別為 0.29、0.59、

0.67 和 0.44 ng/L，此方法用於偵測真實樣品 (水及蘋果汁) 回收率介於 96.80

%~104.50 % [14]。

常見的金、銀奈米粒子外，2013 年 Zhou Nie 團隊則是利用 DNA 當模板，

合成 DNA-templated copper/silver nanoclusters (DNA-Cu/Ag NCs) 材料，亦是利用因產生硫代膽鹼，而使材料聚集，螢光 565 nm 峰值會淬滅，而達馬松的加入，

會抑制硫代膽鹼產生，因此螢光即可回升，利用回升變化量偵測達馬松，同時此方法也用於偵測抗失智的藥物如 Tacrine [15]。

由於乙醯膽鹼透過乙醯膽鹼酯酶的水解產生膽鹼 (choline) 及乙酸 (acetic acid)，而膽鹼可再透過膽鹼氧化酶 (choline oxidase；ChOx) 產生過氧化氫 (hydrogen peroxide；H2O2)，因此有研究是藉由此機制開發感測器。2013 年 Youyu Zhang 團隊利用矽量子點 (SiQDs) 可光激發螢光的特性作為農藥感測器。由於膽鹼因膽鹼氧化酶產生的過氧化氫會抑制矽量子點的螢光。當加入加保利後，加

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保利會使乙醯膽鹼失去作用，因此不會產生過氧化氫，則矽量子點激發螢光特性即可恢復。此方法偵測極限為 7.25 × 10^-9g/L；應用於蘋果、番茄及黃瓜等樣品，

測得值和高效液相層析儀測得值相當 [16]。 2014 年 Jianrong Zhang 團隊用錳參雜硫化鋅量子點 (Mn:ZnS QDs) 搭配磷光法也是此雙酶 (AChE 及 ChOx) 機制偵測 paraoxon。產生的過氧化氫會使量子點磷光淬滅；加入農藥後由於無法產生過氧化氫，因此螢光淬滅效果跟著會變化，藉由此方法偵測 paraoxon，偵測極限為 1.02 × 10^-13 M；於蔬菜和瓜類中有良好回收率，介於 91.0~105.0 %，

RSD 小於 3.0 % [17]。

除了透過乙醯膽鹼酯酶及膽鹼氧化酶的機制開發感測器，2015 年 Xingguang Su 團隊依不同比例合成螢光量子點 (ratiometric fluorescent quantum dot ； RF-QDS) 搭配內濾光效應偵測甲基巴拉松。此方法依不同螢光量子點比例合成的量子點 ( RF-QDs ) 之螢光會藉由金奈米粒子的內濾效應而淬滅，再搭配農藥可抑制胰蛋白酶 (trypsin) 對魚精蛋白 (protamine) 的作用，使魚精蛋白無法讓金奈米粒子聚集而使 RF-QDs 螢光回升，藉由訊號判定農藥濃度。可測得甲基巴拉松的偵測極限為 0.018 ng/mL。此方法用於偵測水、牛奶和米等樣品皆具有良好回收率，介於 95.0~110.0 % [18]。

二、感測器直接偵測方式

除了利用乙醯膽鹼酯酶和膽鹼氧化酶的活性有效偵測農藥外， 2015 年 Hooshang Parham 團隊用銀奈米粒子當探針搭配共振瑞利散射法 (Resonance Rayleigh scattering；RRS) 偵測愛殺松。此原理利用愛殺松和銀奈米粒子反應，

使得銀奈米粒子的瑞利共振散射 (RRS) 強度被淬滅，此偵測極限為 3.70 μg/L；

偵測水樣，具有良好回收率( 92.00~106.20 % ) [19]。另一方面，透過其他化合物修飾於奈米材料上再藉由變化偵測農藥，2011 年 Haibing Li 團隊利用羅丹明 B (Rhodamine B；RB) 修飾於銀奈米粒子再利用螢光偵測農藥 fenamithion。由於羅丹明 B 修飾在銀奈米粒子上，使本身紅色螢光被消光；而 fenamithion 的加

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入，使羅丹明 B 離開銀奈米粒子表面而紅色螢光則恢復，顏色由原來的黃變成紅，除了螢光偵測外，亦可作為比色法偵測。用於真實樣品 (長江、東湖及甘藍菜) 的偵測，其極限皆低於 10.0 nM [20]。此外，2013 年 A.K. Paul 團隊合成二氧化矽包覆銀奈米粒子此殼-核材料，此材料可透過螢光分子與磷酸酯水解酶 (OPH_6His) 接合在金屬表面，再藉由表面電漿共振 (surface plasmon resonance；

SPR) 原理提高螢光靈敏度，用此靈敏度檢測巴拉松代謝物及甲基巴拉松。此材料成功使螢光靈敏度提高 10 倍，因此巴拉松代謝物的偵測極限降至 2.0 ppb，

線性範圍則 5.0~100.0 ppb；甲基巴拉松則為 10.0 ppb，線性範圍 20.0~100.0 ppb ，成功擴大此材料的偵測範圍及降低偵測極限 [21]。

2014 年 Suresh Kumar Kailasa 團隊合成 cyclen dithiocarbamate-functionalized silver nanoparticles (CN-DTC-Ag NPs) 此材料，並透過主客體化學 (host-guest chemistry) 及比色法偵測農藥含得恩地和巴拉刈。原理為此農藥會因主客化學關係使修飾過後的銀奈米粒子聚集，顏色由原來的黃色變成粉色 (德恩地) 及橙色 (巴拉刈)，因此可作為一種比色法偵測。藉由紫外/可見光光譜發現原在 396 nm 有吸收峰，也紅位移到 530 nm 及 510 nm，

得到偵測極限為 2.81 × 10⁻⁶M 及 7.21 × 10⁻⁶M；應用於真實樣品 (水樣、馬鈴薯及小麥) 皆有良好回收率 [22]。同年，Suresh Kumar Kailasa 團隊則用 5-Sulfo anthranilic acid 和二硫化碳 ( CS2 ) 反應後修飾於銀奈米粒子表面 (SAADTC-Ag NPs)，偵測米中的三賽唑。當加入三賽唑後，農藥與材料之間會進行電子的捐贈與接受交互作用 (electron donor - acceptor interactions)，使銀奈米粒子聚集。一樣用紫外/可見光光譜，吸收會從原來 400 nm 紅位移到 500 nm，

顏色由原來的黃色變成粉色，可作為比色法檢測；在米的偵測極限為 1.80 × 10^-7 M [23]。 Suresh Kumar Kailasa 團隊則是選用多巴胺 (dopamine) 接二硫代胺基甲酸鹽 (dithiocarbamate) 修飾於銀奈米粒子用比色法偵測 Mancozeb。此農藥會使修飾過後的銀奈米粒子聚集，顏色由原來的橙棕色變為藍色，因此可作為一種

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比色法檢測。再藉由儀器得到偵測極限為 21.10 × 10⁻⁶M。在水樣及果汁偵測中，

皆有良好回收率，並和氣相層析方法比無顯著差異 [24]。

表面修飾適體 (aptamer)之金奈米粒子於有氯化鈉的條件下，會因適體和金奈米粒子結合，而使金奈米粒子不容易產生聚集，但適當的分析物加入，會因適體和分析物結合，使金奈米粒子失去保護而產生聚集，此變化亦可成為感應器的發想 [25]。2015 年 Ailiang Chen 團隊合成金奈米粒子與適體 (5'-AAG CTT GCT TTA TAG CCT GCA GCG ATT CTT GAT CGG AAA AGG CTG AGA GCT ACG C-3') 搭配比色法快速偵測六種有機磷農藥 (三氯松、裕必松、陶斯松、達馬松、歐殺松及水胺硫磷)。此方法就是根據修飾適體使合成之金奈米粒子有所變化，且金奈米粒子在 520 nm 有吸收峰值亦可藉由吸收值判定農藥濃度，並成功偵測環境水樣，且回收率為 72.0 % ~135.0 % [26]。 2016 年 Nishima Wangoo 團隊則是偵測福瑞松，當農藥加入後，會使金奈米粒子產生聚集，而吸收峰 520 nm 會下降，並且出現 620 nm 的吸收峰，顏色會從本來的紅色轉變成藍色，藉由此方法判定福瑞松的濃度；此方法偵測極限 0.01 nM 並用於蘋果之偵測 [27]。

2016 年 Ying Yu 團隊則是利用適體修飾於量子點 ( ZnS:Mn-Aptamer) 上，搭配螢光回升機制偵測亞滅培及其成像。此螢光會因加入碳奈米管後使螢光共振轉移而螢光淬滅；當亞滅培添加後，ZnS:Mn-Aptamer 會和亞滅培鍵結，使螢光回升，

偵測極限為 0.70 nM，河水和甘藍菜皆有良好回收並和 HPLC 偵測結果相同 [28]。

此外，2014 年 Haibing Li 團隊利用咪唑離子液體 (imidazole ionic liquid；

I-IL) 修飾於金奈米粒子上 (I-IL-Au NPs) 合成出材料，搭配比色法快速偵測益達胺。利用四氯金酸還原法合成金奈米粒子後再與離子液體 (1-propylamino-3-methylimidazolium tetrafluoroborate) 反應；加入益達胺後，金奈

米粒子會聚集，顏色則由原來的紅變成藍，可作為一種比色法檢測。藉由紫外/可見光光譜儀等儀器定量可測得偵測極限為 5 × 10^-7M。真實水樣 (黃河、

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東湖) 中，偵測極限為 1 × 10^-5M 及 1 × 10^-6M [29]。 Tae Jung Park 團隊以檸檬酸鈉做為保護劑迴流合成約 13 nm 的金奈米粒子。利用咪唑和金奈米粒子聚集使其吸收峰改變，並在與大利松、丙基喜樂松和護粒松結合後，於 600~700nm 範圍間的特徵吸收峰變化進行偵測。此方法分別可測得農藥 LOD 為 53.30、53.60 和 27.90 ppb [30]。2014 年 Suresh Kumar Kailasa 團隊利用抗壞血酸 (ascorbic acid) 修飾金奈米粒子搭配比色法偵測二氯松。抗壞血酸先修飾於金奈米粒子表面，再加入二氯松；而二氯松與抗壞血酸之間會產生氫鍵，使金奈米粒子聚集。

儀器鑑定下，吸收會從原來 525 nm 紅位移到 620 nm，顏色由原來的櫻桃紅變成紫色，可作為比色法檢測，偵測極限為 42.940 μM。應用於真實樣品 (水樣、

蘋果汁及小麥) 皆有良好的回收率 [31]。

近幾年利用奈米技術於農藥感測器漸被重視及開發，藉由感測器能簡單快速偵測及成本相對較低的情況下，可改善前處理複雜與耗時耗力之問題，雖無法同時定量多種農藥，但於農產品檢驗上仍是一個重要的課題。

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參、仿過氧化酶催化活性感測器

過去幾十年裡，研究人員陸續開發了人工合成酶來取代天然酶，如：環瑚精 (cyclodextrins)、金屬複合材料 (metal complexes)、紫質 (porphyrins)、聚合物 (polymers)、樹枝高分子(dendrimers) 和生物分子 (biomolecules) 等已經被廣泛的應用於模仿天然酶的結構和功能，且其成本較為低廉。由於奈米技術的成熟，一些奈米材料亦有良好的仿酶活性，因此奈米材料人工酶 (nanozymes) 此領域在近十年被廣泛應用於生物傳感 (biosensing)、免疫測定 (immunoassays)、幹細胞增生 ( stem cell growth ) 和去汙能力 (pollutant removal) 等，比起人工酵素或天然酵素，奈米材料有更好的應用性 [32]。

其中，天然的過氧化物酶 (peroxidases) 廣泛存在自然界中，在細菌、真菌、

植物和動物皆有存在，藉由過氧化氫 (H2O2) 的還原可催化許多氧化反應，如血紅素等 [33,34]。其中，2007 年 Lizeng Gao 團隊開發磁性奈米材料四氧化三鐵 (Fe3O4) 具有仿辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase；HRP) 的催化活性，再有 H₂O2 的狀態下，可催化 HRP 的多種受質發生氧化反應，如可將 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 及 H2O2 反應成氧化態 TMB (oxidize TMB；

oxTMB) 及水，因此合成出具仿過氧化酶活性之奈米材料 [35]。因此，近幾年，

利用仿過氧化物酶的機制製作成的奈米材料 [36-38] 應用之研究日趨崛起。在生物醫學檢測上，2011 年有團隊利用氧化石墨烯 (graphene oxide；GO) 、四氧化三鐵 (Fe3O4) 及鉑奈米點 (Pt nanodots) 包覆於金奈米棒 (Au nanorods) 的殼核結構 (Au@Pt) 搭配仿過氧化酶活性偵測腫瘤標記物攝護腺特定抗原 (prostate specific antigen；PSA) 及小鼠的器官成像 [39-41]。

由於此過氧化物酶是和過氧化氫有關，2009 年 Jianchun Bao 和 Huangxian Ju 團隊合成 FeS 奈米材料，透過此機制搭配 TMB 的氧化，偵測過氧化氫。

除了偵測過氧化氫，若再加入葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase；GOx)，即可在偵測葡萄糖，成為雙酶機制的感測器。近幾年，開發 Au NPs [42] 、石墨烯氧化物

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(GO) [43] 或利用 GO [44] 或碳 [45] 修飾在 Fe₃O₄ 之複合材料及銅奈米團簇 (copper nanoclusters；CuNCs) [46] 等材料皆可同時偵測過氧化氫及葡萄糖。另外，

除了搭配 TMB 當受質外，2008 年 Erkang Wang 團隊則是選用 Fe₃O₄搭配 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) 當受質，亦成功偵測過氧化氫及葡萄糖 [47]。

除偵測過氧化氫和葡萄糖外，2010 年 Xiaogang Qu 團隊利用單壁碳奈米管 (single-walled carbon nanotubes ； SWNTs) 搭配 TMB 偵測單核苷酸多型性 (single nucleotide polymorphism；SNP) [48]。2013 年 Jinsong Ren 和 Xiaogang Qu 團隊利用牛血清蛋白 (bovine serum albumin；BSA) 還原並保護金奈米團簇 (Au nanoclusters；AuNCs) 形成 BSA-AuNCs，此複合材料亦具有仿過氧化酶活性，

因此在含有 H₂O2 的情況下，會催化 TMB 的氧化反應產生藍色產物的 oxTMB；

若在此系統加入多巴胺，會因多巴胺吸附於材料上並抑制催化反應，因此 oxTMB 的吸收峰 652 nm 會隨著多巴胺濃度增加而降低，藉由此方法多巴胺偵測極限為 10.0 nM [49]；2015 年 Niveen M. Khashab 亦是利用 BSA-AuNCs 搭配仿過氧化酶機制可使 TMB 氧化；系統中若加入鈾，此團隊推測由於鈾會與 BSA 的羥基結合導致金奈米團簇聚集，因此抑制仿過氧化酶活性，利用此方法可偵測海水中的鈾 (uranyl；UO₂²⁺) [50]。

TMB 此受質儀器是搭配紫外/可見分光光譜儀 (UV-vis) 判讀，而 2012 年，

亦有團隊利用金奈米粒子 (Au NPs) 與 Amplex UltraRed (AUR) 再含過氧化氫的狀態下，亦會有仿過氧化酶活性並會使 AUR 氧化成 oxidized AUR，搭配螢光儀可偵測金屬離子，如鉛與汞 [51,52]、兒茶酚胺激素 (catecholamines) [53]。

另一種受質 Amplex Red (AR) 也可和具仿過氧化酶之奈米材料搭配，也可應用在生物檢測 [54-56] 及汞離子 [57]。

比起天然酵素會受限於環境中 pH 值、溫度等嚴峻條件之影響，自行合成仿過氧化酶活性之奈米材料成本相對較低、製備簡單、較不受環境酸鹼或溫度等

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影響，穩定性也較天然的好，因此廣泛應用於生物催化及相關檢驗領域等。

在農藥方面搭配仿過氧化酶活性之奈米材料，2012 年 Huan-Tsung Chang 團隊，合成金銀奈米粒子在含有 H₂O₂情況時對 AUR 具有極高的催化活性，再搭配螢光感測器偵測乙醯膽鹼。其原理是因乙醯膽鹼會經乙醯膽鹼酯酶反應形成膽鹼，而膽鹼再經由膽鹼氧化酶反應形成過氧化氫；而合成的奈米粒子可在過氧化氫存在下進行催化反應，使得 AUR 反應成螢光產物。此方法成功針對乙醯膽鹼具有優異的選擇性且偵測極限可達 0.210 nM [58]。 2013 年 Xiyun Yan 團隊，利用乙醯膽鹼、乙醯膽鹼酯酶及膽鹼氧化酶之間反應，生成過氧化氫。加入自行合成磁性奈米材料 Fe₃O4，因仿過氧化酶的催化活性，透過加入 TMB 的顏色變化，快速偵測有機磷農藥和神經毒劑；其原理因加入有機磷農藥，可抑制乙醯膽鹼酯酶的作用，而無法產生過氧化氫，使 TMB 無法變色，再以吸收光譜儀定量農藥；甲基對氧磷偵測極限為 10.0 nM；毆殺松為 5.0 μM 及沙林毒劑為 1.0 nM [59]。2014 年 Vipul Bansal 團隊開發利用合成適體 (acetamiprid-specific S-18 aptamer) 與金奈米粒子 (Au NPs) 結合，抑制金奈米粒子的活性當農藥感測器。原理為利用金奈米粒子本身可仿過氧化酶活性機制，但添加合成適體使活性被抑制；再添加農藥 (亞滅培) 後會和適體結合，使金奈米粒子活性恢復；而 TMB 的顏色變化 (無色變藍紫色) 可作為一種視覺檢測；再藉由紫外/可見光光譜儀等儀器定量可測得亞滅培 0.10 ppm。本方法只需 10 分鐘，是個快速且便利的偵測方式 [60]。

對於奈米材料搭配仿過氧化酶活性之偵測農藥，雖可能需透過乙醯膽鹼酯酶及膽鹼氧化酶兩種酶的搭配下才可進行，但由上述文獻表現亦有良好的偵測結果，

因此也是另一種偵測農藥之方式。

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肆、研究目的

因臺灣的氣候潮濕溫暖、土地狹窄，使農作物的收成量備受重視，為改善環境或病蟲的危害，使農藥被廣泛的運用於農業耕作上，但農藥的殘留也會造成生物體的危害，因此用藥是否安全之檢驗更是不可忽略的議題。農藥殘留的檢測依舊是需要利用氣相層析串聯質譜儀 (GC/MS/MS) 和液相層析串聯質譜儀 (LC/MS/MS) 進行偵測。雖說可定性及定量的農藥數較多，但由於儀器昂貴，並且需有專業人員進行施測，因此需要開發快速篩測農藥的檢測方式。奈米粒子技術的感測器近幾年亦被開發，許多文獻指出農藥檢測需搭配乙醯膽鹼酯酶 (AChE) 和膽鹼氧化酶 (ChOx) 一同添加進行偵測；又或者需透過額外添加適體等修飾於奈米材料進行偵測。

因此，本實驗希望能開發簡單便利之偵測農藥殘留的方法，文獻中提到單壁奈米碳管具仿過氧化酶活性，但多壁奈米碳管 (multiwalled carbon nanotubes；

MWCNTs) 具有低成本優勢，因此選擇多壁奈米碳管和銀奈米粒子利用碳管上官能基一步合成複合材料；另搭配仿過氧化酶活性偵測農藥之文獻需額外添加乙醯膽鹼酯酶及膽鹼氧化酶才可進行實驗，因此本實驗期望再不額外添加此兩種酶的狀況下，藉由直接添加過氧化氫及 AR 進行仿過氧化酶活性之反應。期望找到最佳化條件合成複合奈米材料，再藉由仿過氧化酶活性使 AR 氧化成的氧化產物 resorufin，並藉由 resorufin 螢光峰值變化偵測農藥；除了儀器偵測，亦期望藉由紅色之顏色變化進行比色法檢測。此方法期望可有效的偵測真實樣品，也和現行農藥偵測之公告方法比較，期望獲得相似結果。

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第二章、材料與方法壹、藥品與試劑

一、藥品

本實驗所使用的農藥標準品大滅松 (Dimethoate)、可尼丁 (clothianidin)、加保扶 (carbofuran) 、芬化利 (fenvalerate) 、納乃得 (methomyl) 、賓克隆 (pencycuron)、二氯松 (dichlorvos)、克收欣 (kresoxim-methyl) 和加保利(carbaryl) 購自 Sigma-Aldrich 公司，圖 2-1 為農藥之結構式。多壁奈米碳管 (Multiwalled carbon nanotubes；MWCNTs) (外徑 < 8 nm 、長度 10~30 μm 、碳純度 > 95 %)、

硫酸 (sulfuric acid；H₂SO4)、硝酸 (nitric acid；HNO3)、硝酸銀 (silver nitrate；

AgNO3) 、氫氧化鈉 (sodium hydroxide ； NaOH) 、三羥甲基氨基甲烷 (Tris (hydroxymethyl) aminomethane；Tris)、硼酸 (boric acid；H3BO3)、二甲基亞碸 (dimethyl sulfoxide ； DMSO) 及醋酸 (acetic acid ； CH3COOH) 購自 Sigma-Aldrich 公司；HPLC 級甲醇(Methanol；MeOH)、氰甲烷 (acetonitrile；

ACN) 購自 J. T. Baker 公司。

有關樣品前處理 (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe；QuEChERs) 所需試劑，購自 Agilent 公司，N-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (簡稱 Amplex red；AR) 購自 Invitrogen 公司；雙氧水 35 % (hydrogen peroxide solution；H2O2) 購自 Acros Organics 公司。實驗所需去離子水的部份其電阻值 ≧ 18.0 MΩ/cm 。

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圖 2- 1 研究所需檢測農藥之結構式

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二、標準品與化學溶液之配製

(一) 農藥標準品：農藥標準品：以甲醇配製成 1000 μg/mL 母液 (stock solution)，避光保存於 -20 ℃ 備用。實驗時，依所需濃度以甲醇稀釋之。

(二) 銀離子溶液：精秤 0.0849 g 硝酸銀溶於 20 mL 去離子水中，配製成 25 mM 溶液，置於 4 ℃ 備用。

(三) 氫氧化鈉溶液：精秤 6.40 g 氫氧化鈉溶於 20 mL 去離子水中，配製成 8 M 溶液，置於 4 ℃ 備用。

(四) Tris-borate 緩衝溶液：分別精秤 2.4228 g 三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 及 6.1830 g 硼酸分別溶於 100 mL 與 200 mL 去離子水至完全溶解，再以 500 mM 硼酸將 Tris 調製 pH 7.0 再加入去離子水定容至 200 mL，

置於 4 ℃ 備用。

(五) Amplex Red (AR) assay kit：Amplex red assay kit 內含 5.0 mg 粉末，退冰至室溫，再以 1944 μL 的 DMSO 回溶，置於 -20 ℃ 冰箱保存，

Amplex red 激發波長為 550 nm，放光範圍 550~750 nm。

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貳、儀器

複合材料由美國 FEI. 公司，型號 Tecnai G2 F20 S-TWIN 的高解析穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscopy；TEM) 、美國 Thermo 公司，型號 K-Alpha 的 X 射線電子能譜儀 (X-ray photoelectron spectroscopy；XPS) 及美國 Perkin Elmer 公司，型號 Frontier IR spectrometer 的傅立葉轉換紅外線光譜儀 (FTIR) 進行鑑定。

螢光光譜儀由日本 Hitachi 公司所生產，型號 F-4500，光學組件含光源 150 W Xe 燈；單光器為凹面光柵系統，900 lines/mm，偵測波長範圍 200~800 nm，

掃描速度可設定 15~30000 nm/min，光譜解析度 1.0 nm。本實驗使用之參數：

激發光波長設定為 550 nm；激發光狹縫及入射光狹縫設定為 5 nm；掃瞄速度 2400 nm/min；PMT 電壓設定為 700 V，放射光掃描範圍 350~700 nm。

多功能盤式螢光分析儀由美國 Tecan 公司生產，型號 Infinite® 200 PRO，

光源為高能量氙氣燈，激發光波長偵測範圍 230~850 nm，散射光波長偵測範圍 280~850 nm。本實驗使用參數：激發光波長設定 550 nm，放射光掃描範圍 550~600 nm，偵測放光波長 584 nm。

液相層析串聯質譜儀，液相層析儀選用美國 Aglient 公司，型號 1200，搭配 Aglient 公司生產的層析管柱，型號為 Poroshell 120 SB-C18，管柱內徑 2.1 mm、總長 100 mm、填充粒徑大小為 2.7 μm。質譜儀選用德國 Bruker 公司生產，型號 HCT，搭配離子源為電噴灑游離法 (electrospary ionization；ESI) 並在正離子模式下進行偵測。

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參、實驗方法

一、Ag NPs/OxMWCNTs 材料製備

氧化碳管參考 Ahmad Amiri 團隊發表之文獻並進行修改[61]，秤取 0.50 g 多壁奈米碳管置入雙頸瓶中，加入濃硫酸/濃硝酸 (體積比 = 3:1)，加熱至 80 ℃ 冷凝迴流 24 小時，反應後的產物利用離心機 12000 rpm 離心 10 分鐘，再以二次水純化，反復離心純化至中性後，放入烘箱乾燥 48 小時 (80 ℃)。待冷卻至室溫，將氧化後的多壁奈米碳管以 0.50 mg/mL 回溶於去離子水中，避光保存於 4 ℃ 下備用。

複合材料參考並修改 Xuping Sun 團隊發表之文獻 [62]，秤取 930.0 μL 氧化後的多壁奈米碳管 (0.50 mg/mL) 與 31.0 μL 硝酸銀 (25 mM)，放置於乾浴機加熱至 90 ℃，接著加入 39.0 μL 氫氧化鈉 (8 M) 反應 30 分鐘後冷卻至室溫。

以離心機 14000 rpm 離心 10 分鐘，去除上層溶液 950.0 μL 並加入去離子水 950.0 μL 重復數次至 pH 值為 7.0，此步驟為純化複合材料並去除未反應之離子。

二、利用 Ag NPs/OxMWCNTs 材料偵測大滅松

添加不同濃度 10.0 μL 大滅松與 10.0 μL 甲醇混合於 20.0 μL Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料中，使用迴旋式混合器 130 rpm 避光搖晃 15 min

使其均勻反應後，加入 100.0 μL 去離子水、20.0 μL Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、 20.0 μL H2O2 (1.0 mM) 及 20.0 μL AR (0.1 mM)，再反應兩小時後以 14000 rpm 離心 10 分鐘，取上層液，使用多功能盤式螢光分析儀測量，

激發波長設為 550 nm，偵測放光波長 584 nm，偵測 AR 螢光產物 resorufin 的螢光強度。

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三、真實樣品的偵測 (一) 真實樣品前處理

水樣取至臺東大學校內之湖水，先利用 0.45 μm 濾膜過濾，再以 Amicon ultra-0.5 mL centrifugal filters (3 KDa) 以 12000 rpm 離心 15 分鐘去除水中之雜質。

臍橙購買至臺東市市場，利用 QuEChERs 方式萃取。先秤取 10.00 g 打碎後均勻之樣品於 50.0 mL 離心管中，添加 10.0 mL 含 1.0 % 醋酸的氰甲烷溶液，及含 4.00 g 硫酸鎂與 1.00 g 醋酸鈉粉劑劇烈搖晃 1 分鐘後，以 5206 rpm 離心 1 分鐘，取 6.0 mL 上層有機溶劑轉移至含 0.30 g primary secondary amine (PSA) 與 0.90 g 硫酸鎂的離心管中，搖晃 1 分鐘後，以 5206 rpm 離心 2 分鐘後取 1.0 mL 上清液用空氣吹乾回溶甲醇 1.0 mL 製成待測液。

(二) 真實樣品的偵測

取前處理完畢之 10.0 μL 真實樣品，分別添加 10.0 μL 不同濃度之大滅松，混合於 20.0 μL Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料中，使用迴旋式混合器 130 rpm 避光搖晃 15 min 使其均勻反應後，加入 100.0 μL 去離子水、20.0 μL Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、 20.0 μL H2O2 (1.0 mM) 及 20.0 μL AR (0.1 mM)，再反應兩小時後以 14000 rpm 離心 10 分鐘，取上層液，使用多功能盤式螢光分析儀測量，

激發波長為 550 nm，偵測放光波長 584 nm 偵測 AR 螢光產物 resorufin 的螢光強度。

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四、利用 LC/MS/MS 偵測大滅松

為確保本實驗方法是有效可行的，利用液相層析串聯質譜法印證。液相層析串聯質譜儀搭配 Aglient 公司 Poroshell 120 SB-C18 的管柱；在管柱溫度為 40.0 ℃、進樣體積 3.0 μL、流速 0.18 mL/min、正離子模式下進行偵測。液相層析儀移動相 A 為氰甲烷，B 為去離子水，利用梯度流洗 (表 2-1) 模式將樣品沖提至質譜。質譜在多重反應監測 (Multiple Reactant Monitoring；MRM) 模式下，母離子為分子離子 [Dimethoate + H]⁺ = 230 m/z，定量離子為 199 m/z，定性離子為 171 m/z [63]；質譜圖如圖 2-2 所示。

表 2- 1 液相層析儀之流洗條件

Time (min) Mobile phase A (%) Mobile phase B (%)

0.0 20.0 80.0

12.0 40.0 60.0

35.0 90.0 10.0

40.0 90.0 10.0

42.0 20.0 80.0

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圖 2- 2 大滅松之質譜圖。使用 0.5 μg/mL 大滅松，經液相層析串聯質譜儀搭配正離子模式偵測。

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第三章、實驗結果

壹、Ag NPs/OxMWCNTs 材料合成與鑑定

一、Ag NPs/OxMWCNTs 材料製備

材料製備方面，經由參考之文獻得知在鹼性環境下，石墨烯 (graphene oxide；

GO) 上的羥基 (hydroxyl group) 會使銀離子 (Ag⁺) 還原成銀奈米粒子 (Ag NPs) [62]。因此在材料合成過程中，進行硝酸銀和氫氧化鈉添加濃度合成之銀奈米粒子於氧化過後多壁奈米碳管量之探討及其催化效果。

硝酸銀探討濃度為 5.0、10.0、15.0、25.0、30.0 和 35.0 mM，如圖 3-1 發現在 25.0 mM 有最佳螢光；推測可能原因是因氧化過後的多壁奈米碳管上的官能基不足讓更多的銀反應，因此選擇 25.0 mM 做為最後添加濃度。

由於反應條件需在鹼性條件下，因此氫氧化鈉濃度探討 2.0、4.0、6.0、8.0 和 10.0 M，圖 3-2 得知當鹼性濃度正比於催化能力，但超過 8.0 M 時，催化效果則開始下降。由於硝酸銀及氫氧化鈉在無還原劑下會反應生成氧化銀 (Ag₂O ) [64]。本實驗利用氧化過後碳管當還原劑，但因官能基在有限的情況下產生之銀奈米粒子亦有限，因此最後實驗中氫氧化鈉的添加濃度選擇 8.0 M。

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圖 3- 1 不同硝酸銀濃度還原於複合材料之仿過氧化酶活性探討。不同濃度硝酸銀，添加於氧化後的多壁奈米碳管、氫氧化鈉 (8 M) 並與去離子水、Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、H₂O2 (1.0 mM) 及 AR (0.1 mM) 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。標準偏差為三次獨立實驗測量後誤差值計算而成。

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圖 3- 2 不同氫氧化鈉濃度還原於複合材料之仿過氧化酶活性探討。不同濃度氫氧化鈉，添加於氧化後的多壁奈米碳管及硝酸銀 (25 mM) 並與去離子水、

Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、H2O2 (1.0 mM) 及 AR (0.1 mM) 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。標準偏差為三次獨立實驗測量後誤差值計算而成。

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二、Ag NPs/OxMWCNTs 材料鑑定

圖 3-3(A) 為穿透式電子顯微鏡 (TEM) 影像圖，用來鑑定材料之大小，由圖看出銀奈米粒子吸附在多壁奈米碳管表面上，表示硝酸銀有藉由多壁奈米碳管上的羥基還原銀奈米粒子於碳管上，圖 3-3(B) 則由 TEM 亦算出銀奈米粒子的平均粒徑大小為 37.0 nm。

傅立葉轉換紅外線光譜儀 (FTIR) 對經氧化過後的多壁奈米碳管表面之官能基結構進行鑑定 (圖 3-4)，經氧化過後的多壁奈米碳管 (黑線) 在 3200~3400 cm^-1 有 O-H 的伸縮振動訊號；於 1700~1750 cm^-1 有 C=O 伸縮振動訊號；而 1600~1680 cm^-1 有 C=C 伸縮振動訊號。表示此材料成功合成並具有羥基和羧酸基；亦也因材料表面有親水基團，因此經修飾後的奈米碳管在水中具有更良好的分散性 [61]。

由 X 射線電子能譜儀 (XPS) 進行材料之元素分析及表面化學組成，由圖 3-5 得知此複合材料由 85.88 % 的 C 1s、7.92 % 的 O 1s 和 3.58 % 的 Ag 3d 共同組成。圖 3-6 為 C 1s 分析圖，波峰值 284.48 和 286.18 eV 為碳管中 sp² (C=C/C-C) 和 C-O [65]；圖 3-7 為 O 1s 分析圖，波峰 531.33 和 532.68 eV 為 O=C 和 C-O [66]

圖 3-8 為 Ag 3d 分析圖，波峰值 368.23 和 374.03 eV 分別為 Ag 3d5/2 和 Ag 3d3/2 [67]，進一步解析 Ag 3d5/2 波峰可得到 367.93 和 368.28 eV 兩個波峰值，

分別代表銀離子 (Ag⁺) 及金屬銀 (Ag⁰) [68, 69]，由結果得知碳管上的銀會有兩種狀態，因此確認本實驗方法可利用氧化過後多壁奈米碳管在鹼性環境下還原硝酸銀形成銀奈米粒子。

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圖 3- 3 合成 Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料之穿透式電子顯微鏡 (TEM) 影像圖(A)。經計算後銀奈米粒子平均立徑分佈圖 (B)。是利用氫氧化鈉 (8M)，添加於氧化的多壁奈米碳管及硝酸銀 (25 mM) 所自行合成 Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料。

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圖 3- 4 不同材料之傅立葉轉換紅外線光譜儀 (FTIR) 光譜圖。分別為純多壁奈米碳管 (紅色線) 及利用氫氧化鈉 (8M)，添加於氧化後的多壁奈米碳管及硝酸銀 (25 mM) 所合成 Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料 (黑色線)。

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圖 3- 5 合成 Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料之 X 射線電子能譜儀 (XPS) 圖。

是利用氫氧化鈉 (8M)，添加於氧化後的多壁奈米碳管及硝酸銀 (25 mM) 所合成之。

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圖 3- 6 合成 Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料之 C 1s 的電子能階分析圖。是利用氫氧化鈉 (8M)，添加於氧化後的多壁奈米碳管及硝酸銀 (25 mM) 所合成之。

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圖 3- 7 合成 Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料之 O 1s 的電子能階分析圖。是利用氫氧化鈉 (8M)，添加於氧化後的多壁奈米碳管及硝酸銀 (25 mM) 所合成之。

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圖 3- 8 合成 Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料之 Ag 3d 的電子能階分析圖。是利用氫氧化鈉 (8M)，添加於氧化後的多壁奈米碳管及硝酸銀 (25 mM) 所合成之。

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貳、Ag NPs/OxMWCNTs 材料仿過氧化酶活性偵測大滅松

一、Ag NPs/OxMWCNTs 材料偵測大滅松之反應機制

進行大滅松偵測之前，先探討複合材料在不同濃度過氧化氫及 AR 下對仿過氧化酶催化活性進行評估。由圖 3-9 知在 1.0 mM H2O2 狀態下，AR 濃度在 0.1 mM 有最佳催化效果，而得到最高的螢光值；高於此濃度後，則會使催化效果降低，因此螢光值隨著下降，推測過多的 AR 不會和 1.0 mM H2O2 產生反應，

而導致螢光值降低。圖 3-10 是 0.1 mM AR 狀態下，H₂O2 在 1.0 mM 後反應幾乎維持在相似之催化結果，因此最後選擇 1 mM 為最後添加濃度。

為了評估 Ag NPs/OxMWCNTs 催化活性，我們利用 0.1 mM 時的 AR 氧化物 resorufin 的螢光強度來判讀，包含單純銀奈米粒子 (Ag NPs)、多壁奈米碳管 (MWCNTs)、氧化多壁奈米碳管 (OxMWCNTs)、銀奈米粒子/氧化多壁奈米碳管 (Ag NPs/OxMWCNTs) 和大滅松加入 Ag NPs/OxMWCNTs 中，共五種系統進行 resorufin 的螢光探討 (圖 3-11)。

圖 3-11 中，取 0.15 mg/mL 多壁奈米碳管及氧化過後多壁奈米碳管 (曲線 b、c)，進行催化反應，皆對螢光無明顯增強現象，表示多壁奈米碳管本身無仿過氧化酶的催化活性。利用 1.0 mM AgNO3 與 20.0 % 檸檬酸鈉在沸騰下反應 10 分鐘，合成出銀奈米粒子 (曲線 a) 雖有些許催化活性，但螢光強度小於 Ag NPs/OxMWCNTs 的螢光強度 (曲線 d)，因此表示經銀奈米粒子修飾氧化過後的奈米碳管具有仿過氧化酶的催化活性，並能增強 resorufin 的螢光強度；推測催化活性可能來自於銀奈米粒子與多壁奈米碳管之間，有更強的電子轉移的交互作用，使氧化還原的能力更強。

另外，加入了大滅松後 (曲線 e)，推測大滅松結構上的硫和材料上的銀產生交互作用，使大滅松吸附在材料上導致材料的催化效果降低而螢光強度跟著下

降。由圖中照片亦可看出自行合成之複合材料顏色有明顯由無色轉紅色

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(照片 d)，而加入大滅松後因抑制材料之催化反應，因此顏色會由紅色漸轉成淡紅色 (照片 e)。這結果表明，大滅松可能會和氧化過後奈米碳管上的銀奈米粒子產生交互作用，使得材料的催化活性被抑制，反應機制如圖 3-12，而無論是否氧化過後的多壁奈米碳管皆無催化效果，因此也可排除碳管的干擾性。

由 resorufin 螢光強度的變化量檢測大滅松，分別添加不同濃度 (0.01~1.0 μg/mL) 之大滅松，進行實驗，利用大滅松添加濃度和 resorufin 之螢

光強度作圖，由圖 3-13 結果得知，隨著大滅松濃度的增加，螢光強度跟著下降，

大滅松達一定量時，螢光強度則維持；此方法線性範圍為 0.01~0.35 μg/mL (R² = 0.998)，偵測極限 (LOD) 為 0.003 μg/mL，定義在 S/N = 3，此偵測極限低於臺灣蔬果農藥殘留偵測極限 (0.01 μg/mL)，此結果表明是可以偵測大滅松並且定量之。

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圖 3- 9 不同 AR 濃度對於複合材料之仿過氧化酶活性探討。利用自行合成之 Ag NPs/OxMWCNTs 與去離子水、Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、 H2O2 (1.0 mM) 及不同濃度 AR 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。標準偏差為三次獨立實驗測量後誤差值計算而成。

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圖 3- 10 不同 H₂O2 濃度對於複合材料之仿過氧化酶活性探討。利用自行合成之 Ag NPs/OxMWCNTs 與去離子水、Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、不同濃度 H₂O2 及 AR (0.1 mM) 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。標準偏差為三次獨立實驗測量後誤差值計算而成。

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圖 3- 11 不同材料之仿過氧化酶活性探討。分別單純銀奈米粒子濃度 (a)、多壁奈米碳管 (0.15 mg/mL) (b)、氧化多壁奈米碳管 (0.15 mg/mL) (c)、自行合成之

Ag NPs/OxMWCNTs (0.15 mg/mL) (d) 及 0.1 μg/mL 大滅松加入 Ag NPs/OxMWCNTs (0.15 mg/mL) 中 (e)；分別與去離子水、Tris-borate 緩衝

溶液 (100 mM，pH 7.0) 、H₂O2 (1.0 mM) 及 AR (0.1 mM) 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。內圖為不同材料反應後之顏色變化。

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圖 3- 12 利用 Ag NPs/OxMWCNTs 複合材料偵測大滅松之示意圖。自行合成複合材料具仿過氧化酶活性，可催化過氧化氫與 AR 的氧化還原反應；由於大滅松可能吸附於材料上，抑制材料的催化活性，使 AR 氧化產物 resorufin 螢光降低。

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圖 3- 13 利用合成複合材料對大滅松之偵測。內圖為偵測大滅松之校正曲線圖。

以大滅松添加濃度和 resorufin 之螢光強度作圖。反應條件為不同濃度大滅松添加於氧化後的多壁奈米碳管與去離子水、Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、H2O2 (1.0 mM) 及 AR (0.1 mM) 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。

標準偏差為三次獨立實驗測量後誤差值計算而成。

(50)

39

二、Ag NPs/OxMWCNTs 材料之選擇性與干擾

抗干擾及選擇性的能力是開發感應器重要的實驗之一，為了評估此感測器的選擇性及干擾，除了大滅松，也選了其他殺蟲劑類農藥，包含亦屬有機磷農藥之二氯松，和有機磷農藥作用機制類似的胺基甲酸鹽類農藥選加保扶、納乃得和加保利及屬類尼古丁類之可尼丁還有合成除蟲菊精類的芬化利；除了殺蟲劑亦選了殺菌劑賓克隆和克收欣等共八種農藥，進行三種不同實驗探討。

實驗一，除了 0.5 μg/mL 大滅松，再分別將材料添加再其他含 0.5 μg/mL 的八種農藥中，並一樣進行實驗反應 (圖 3-14)，發現只有大滅松會使催化活性降低，導致螢光下降。實驗二，將 0.5 μg/mL 大滅松及材料分別加入已含有 5.0 μg/mL 的其他農藥中 (圖 3-15)，由圖表示，即使其他農藥高於大滅松的濃度 10 倍，感測器亦對大滅松偵測有效果。

除了其他農藥的干擾實驗，在實驗三則是針對合成之材料是否對金屬離子亦有影響進行探討，因此分別將 1.0 μM 的金屬離子，包含氯化鐵 (Fe³⁺)、氯化亞鐵 (Fe²⁺)、氯化銅 (Cu²⁺)、硝酸鋅 (Zn²⁺)、氯化鎂 (Mg²⁺)、氯化鈣 (Ca²⁺) 和氯化鉀 (K⁺)，共 7 種常見金屬離子進行實驗測試 (圖 3-16)，發現這七種金屬離子對材料的仿過氧化酶活性皆無干擾。

由實驗一和二可得知此材料對大滅松有選擇性，推測可能選擇的奈米碳管除具有立體效應外還因氧化過後，導致材料變得較疏水性，因此可特別針對大滅松並也較容易吸附；除碳管本身可能產生的專一性外，在碳管上的銀奈米粒子是分散在碳管上，也可能增加大滅松吸附在材料上的機會，因此合成之材料才對大滅松有選擇性。結果顯示，開發的 Ag NPs/OxMWCNTs 材料，可能在混和的農藥下，排除干擾偵測大滅松。

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圖 3- 14 合成複合材料對不同農藥之選擇性偵測。將材料分別加入含 0.5 μg/mL 之不同農藥中再與去離子水、Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、H2O2 (1.0 mM) 及 AR (0.1 mM) 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。A 代表單純 Ag NPs/OxMWCNTs ，B~J 分別代表材料加入大滅松、可尼丁、加保扶、芬化利、納乃得、賓克隆、二氯松、克收欣和加保利。標準偏差為三次獨立實驗測量後誤差值計算而成。

(52)

41

圖 3- 15 合成複合材料對大滅松之干擾實驗。將材料和 0.5 μg/mL 大滅松分別加入含 5.0 μg/mL 之不同農藥中再與去離子水、Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，

pH 7.0) 、H2O2 (1.0 mM) 及 AR (0.1 mM) 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。 A 代表單純 Ag NPs/OxMWCNTs ， B 代表 0.5 μg/mL 大滅松，C~J 分別代表材料與大滅松加入可尼丁、加保扶、芬化利、納乃得、賓克隆、二氯松、

克收欣和加保利。標準偏差為三次獨立實驗測量後誤差值計算而成。

(53)

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圖 3- 16 合成複合材料對金屬離子之偵測。將材料分別加入含 1.0 μM 之不同金屬中再與去離子水、Tris-borate 緩衝溶液 (100 mM，pH 7.0) 、H2O2 (1.0 mM) 及 AR (0.1 mM) 反應後並進行 AR 氧化產物之螢光偵測。 A 代表單純 Ag NPs/OxMWCNTs ， B~H 分別代表材料加入 Fe³⁺, Fe²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, 和 K⁺等金屬離子。標準偏差為三次獨立實驗測量後誤差值計算而成。

(54)

43

參、真實樣品的偵測

我們利用 Ag NPs/OxMWCNTs 材料搭配仿過氧化酶活性偵測水樣及臍橙中的大滅松。真實樣品透過前處理後，分別添加不同濃度的大滅松，進行此方法的偵測及透過 LC/MS/MS 的偵測。由表 3-1 可得知，湖水的回收率介於 84.80~99.30 %，RSD 值小於 2.65 (n = 3)；臍橙回收率介於 93.80~105.00 %，RSD 值小於 1.19 (n = 3)。和 LC/MS/MS 比較，亦有類似結果，並利用學生式 t (student's t；t-test) 進行兩者實驗間是否有顯著性差異 (significant difference) (表 3-2)。計算結果為 1.078 及 0.329，皆在 95 % 的可信區間 (n=3)。因此，本研究開發之方法，是和現有檢驗方法無明顯差異。

除了和現有檢驗方法比較外，也和其他偵測大滅松之文獻相比[70-75]

(表 3-3)。雖我們的偵測極限無法低於有添加乙醯膽鹼酯酶之文獻，但，本方法可再不需透過添加天然 "酶" 下即可進行實驗；和其他不需透過酶之文獻相比，

本篇研究所用基質也非單純水樣測試。本篇研究材料易於合成方便使用且偵測極限又低於現行公告方法之偵測極限 (0.01 μg/mL)，因此我們認為，是一個方便且低成本的偵測方法。

(55)

44

表 3- 1 真實樣品同時用本實驗方法與 LC/MS/MS 進行大滅松之偵測

Sample

Added (μg/mL)

Ag NPs/OxMWCNTs method LC/MS/MS method Found

(μg/mL)

Recovery (%, n=3)

RSD (%, n=3)

Found (μg/mL)

Recovery (%, n=3)

RSD (%, n=3) Lake Water

0.045 0.043 95.60 0.28 0.045 100.00 1.56 0.150 0.149 99.30 0.38 0.149 99.30 0.22 0.250 0.211 84.80 2.65 0.250 100.00 0.15 Orange

0.030 0.030 100.00 0.59 0.031 103.30 2.78 0.080 0.075 93.80 0.36 0.079 98.75 1.75 0.120 0.126 105.00 1.19 0.123 102.50 0.58

表 3- 2 本實驗方法與 LC/MS/MS 方法差異性計算

Sample t_calculated t_table

lake water 1.078 4.303

orange 0.329 4.303

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45

表 3- 3 實驗方法與其他文獻之比較

Sensors Matrix Detection mode

LOD (μg/mL)

Ref.

silver nanoparticles deposited on poly-o-phenylenediamine

none

molecular imprinted with electrochemical

5.00 × 10^-4 [70]

SPCE│CNTs/ZrO2/PB/Nf│

Fe₃O₄/Au -AChE^a

Chinese cabbage

electrochemical 5.60 × 10^-7 [71]

GO/ Fe3O4/AChE^b pakchoi electrochemical 1.80 × 10^-1 [72]

Fe3O4/AChE/ChO/TMB/H2O2 fruit UV-Vis absorption 2.52 × 10^-3 [73]

SA/KIO4/FeCl3/phen^c

milk and water

kinetic-spectrophotometric

method

2.16 × 10^-2 [74]

Ag NPs/

p-sulphonato-calix[4]resorcinarene

industrial waste water

UV-Vis absorption 1.83 × 10^-4 [75]

Ag NPs/OxMWCNTs

lake water orange

fluorescence 3.00 × 10^-3 this study

a screen printed carbon electrodes；SPCE, carbon nanotubes；CNTs, prussian blue；PB, Nafion；Nf

b graphene oxide；GO

c sulphanilic acid；SA, 1,10-phenantroline；phen

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46

第四章、結論

本實驗藉由合成銀奈米粒子修飾於氧化後的奈米碳管

(Ag NPs/OxMWCNTs) ，使其具有仿過氧化酶的催化活性，在有過氧化氫的條件下，可催化 AR 氧化成具有紅色螢光的產物 (resorufin)。本實驗於 100 mM

Tris-borate solution (pH 7.0) 中，將 0.1 mM AR 和 1.0 mM H2O2 與大滅松加入複合材料中，由於大滅松會與銀奈米粒子間產生交互作用，抑制此複合材料之催化活性，降低 AR 氧化的紅色螢光產物 resorufin 產生，藉此螢光會淬滅，藉由

resorufin 螢光變化有效偵測大滅松。此外，於選擇性及抗干擾測試，另選八支農藥和金屬離子與大滅松同時進行測試，其偵測結果不受其他農藥干擾。真實樣品偵測部分，分別添加不同濃度之大滅松於水樣及臍橙中，結果具有良好的回收率；並與傳統方法 (LC/MS/MS) 比較，得到良好的正相關性，由 t-test 計算出有 95 % 的可信區間，表示兩種方法之間並無顯著差異，因此本方法具有潛力於偵測樣品之大滅松。

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第五章、參考文獻

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