腺苷酸抑制虹彩病毒在石斑魚腎臟細胞複製之研究

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(1)腺苷酸抑制虹彩病毒在石斑魚腎臟細胞複製之研究 A study of adenosine-mediated inhibition the replication of iridovirus in grouper kidney cells 耕莘健康管理專科學校副教授 ◎林淑玟 Sui-Wen Lin 國立宜蘭大學生物技術與動物科學所碩士生 ◎黃建智 Jian-Jhih Huang 國立宜蘭大學生物技術與動物科學所副教授 ◎賴裕順 Yu-Shen Lai. 摘要腺苷酸是屬於一種嘌呤類核苷，其結構是由含氮鹽基與五碳糖組成。在先前的研究中指出，腺苷酸能有效的抑制牛痘病毒的複製，因此在本研究中，將要探討腺苷酸是否能抑制石斑魚虹彩病毒在石斑魚腎臟細胞中的複製，並進一步探討其影響機制。研究結果發現石斑魚腎臟細胞事先處理腺苷酸之後，虹彩病毒力價顯著低於沒有處理的組別，隨著腺苷酸濃度的提高，對病毒增殖抑制的情形也隨之提高。接著利用RT-PCR技術來檢測虹彩病毒的早、晚期基因表現，結果發現腺苷酸會抑制虹彩病毒感染複製，並且延遲病毒早、晚基因的表現。. 關鍵詞：腺苷酸、虹彩病毒. 銀紋笛鯛 (Mangrove red snapper; Lutjanus. 壹、前言. argentimaculatus)等魚種(趙家本., 2003)。1992年虹彩病毒目前已知是全世界感染魚類重要病. 台灣澎湖地區養殖嘉臘魚發生死亡的現象，根據. 源菌之一。台灣自從1992年發生虹彩病毒感染嘉. 穿透式電子顯微鏡的觀察，初步鑑定為虹彩病毒. 臘魚事件後，魚類之虹彩病毒感染症歷年來造成. 感染症(Chou et al., 1994)，1993年高雄防治所也. 臺灣養殖漁業經濟上嚴重損失。已証實受感染之. 檢驗出金目鱸感染虹彩病毒自1995年起，也在南. 魚種包括石斑魚 (grouper; Epinephelus hybrid)、. 部養殖的石斑魚陸續爆發虹彩病毒感染症(Chou et. 金目鱸 (giant seaperch; Lates calcarifer)、加州. al., 1998)，病魚無明顯外觀病徵，但出現活力下. 鱸 (largemouth bass; Micropterum salmoides)、龍. 降、食慾降低，累計死亡率高達60%，將病毒接. 膽石斑 (king grouper; Epinephelus lanceolatus)、. 種至KRE (embryo of a hybrid of kelp and red spotted. 金錢魚 (spotted butter fish; Scatophagus argus)、. grouper)細胞株，出現圓形化之細胞病變，但病. 紅衫 (yellow-wax pomfrat; Trachinotus blochii)、. 毒在此細胞繼代後病毒力價有下降的趨勢。在組. 黃錫鯛 (goldlined seabream; Sparus sarba)、老鼠. 織病理學檢查可見脾臟有巨大細胞(giant cells)出. 斑 (humpback grouper; Chromileptes altivelis)，. 現，在穿透式電子顯微鏡觀察病毒直徑為230±10. *通訊作者：賴裕順副教授宜蘭縣宜蘭市神農路一段一號生物技術與動物科學所 [email protected]. Journal of Cardinal Tien College of Healthcare & Management No.10 October 2012. 0 1 5.

(2) nm，內有一電子緻密核心，約120±10 nm，將此. (GFV-1)，是由無病徵之金魚中分離出來，並不會. 病毒人工感染健康的石斑魚苗，於11天內累計死. 造成宿主的死亡。. 亡率達100%，此病毒命名為Grouper Iridovirus of. 一般病毒感染宿主細胞後，通常會積極的表. Taiwan (TGIV)。2000年我們自屏東小琉球箱網養. 現病毒基因蛋白以利病毒基因的複製，通常科學. 殖場中疑似罹病(體色較黑，沉底不攝食)的5吋石. 家將病毒DNA的複製做為一個病毒基因表現的分. 斑幼魚中分離出的病原菌，經過DNA序列分析證. 水嶺，在病毒DNA複製之前所表現的病毒基因稱. 實為Iridovirus (Tsai et al., 2005)，命名為Grouper. 為感染早期基因，其基因產物主要被認為和細胞. Iridovirus(GIV)，研究發現至目前為止至少已有. 生存運作並順利調控病毒DNA複製有關。在病毒. 超過140種不同的魚種會遭受Iridovirus感染死亡. DNA複製之後所表現病毒基因稱為感染晚期基. (Essbauer et al., 2001)。. 因，這些基因的功能一般被認為和病毒組裝、分. 虹彩病毒科為直徑大小約120-350 nm的大. 泌和細胞的裂解死亡有關。早期基因一般又可分. 型DNA病毒(Schnitzler et al., 1987; Jakob et al.,. 為極早期基因和一般早期基因，所謂的極早期基. 2001)，主要感染宿主包括無脊椎動物及非哺乳. 因是病毒感染宿主細胞後，病毒基因直接利用宿. 類的脊椎動物(Williams., 1996)，目前可分為五. 主RNA聚合酶來進行病毒RNA轉錄作用，這些基. 個屬，(1) Iridovirus：可感染多種無脊椎動物，. 因產物主要作為調控病毒一般早期基因的表現，. 大多以昆蟲為主，象徵性病毒為Chilo iridescent. 因此病毒早期基因表現如果受到抑制，通常晚期. virus (IV6, 又稱CIV)，病毒直徑約120 nm，為. 基因表現也會受到抑制影響，甚至會影響病毒的. 二十面體，具有脂質外鞘，但感染力對乙醚不敏. 複製與力價。GIV在分類上屬於Ranavirus，目前. 感，受此病毒感染的幼蟲及純化之病毒呈現藍. 病毒基因已被完全解碼(Tsai et al., 2005)，分析結. 紫色之光澤。(2) Chloriridovirus：以感染昆蟲類. 果大約有2百多個基因，這些基因功能中有許多被. 的蚊子為主，象徵性的病毒為Mosquito iridescent. 認為和調控細胞凋亡或訊息傳遞有關，其中ORF. virus (IV3, 又稱MIV)，病毒直徑約180 nm，受. 078R 編碼出具有 BCL 區域的蛋白質，研究結果. 感染的幼蟲及病毒顆粒呈現黃綠色之光澤。(3). 已證實 ORF 078R 所編碼的 GIV-Bcl 這個早期基. Ranavirus：感染兩棲類為主，象徵性的病毒為. 因表現，具有抑制紫外線誘導的細胞凋亡的能力. Frog virus 3 (FV3)，病毒直徑約160-200 nm，最. （Lin et al., 2007），另外我們也在2008年首度證. 初是由豹蛙(leopard frog, Rana pipiens)的腎臟惡. 實GIV會誘導金目鱸肌肉細胞進行細胞凋亡(Lai et. 性腺瘤(adenocarcinoma)分離，但FV3和腫瘤並. al., 2008)。. 無直接關係。(4) Lymphocystivirus：可感染多種硬骨魚類，象徵性的病毒為lymphocystivirus type. 貳、研究動機. 1 (LCDV-1)，病毒直徑約300 nm，屬慢性的疾病，會侵犯真皮層的纖維細胞(fibroblasts)，造成細胞的腫大，形成肉眼可見的結節，這些腫大的纖維細胞在組織病理學下可見有嗜鹼性細胞質內包涵體，此病死亡率極低，絕大部分的病魚可自行復原。(5) Megalocytivirus ：主要感染金魚(goldfish)，象徵性的病毒為Goldfish virus 1. 腺苷酸(adenosine)是一種內生性的嘌呤核苷酸，普遍存在於人體內各組織器官之細胞中，參與體內各種生理活性作用。腺苷酸功能訊息運作主要是透過細胞模表面的四個adenosine receptor subtypes (A1, A2A, A2B, and A3)，這四個adenosine receptor subtypes主要是依據是否有能力去活化或抑制adenylate cyclase活性。A2A 和 A2B receptors.

(3) 主要是藉由Gάs 進一步活化adenylate cyclase，然. 28℃ 培養 7 天，各自收取細胞培養液並進一步分. 而 A1 和 A3 adenosine receptors主要是藉由 Gάi 來. 析病毒的力價。將104 GK細胞培養於 24 孔細胞. 抑制adenylate cyclase 活性。腺苷酸和病毒感染複. 培養盤中，將待測GIV病毒液以 10％ FBS-L15 培. 製的研究有越來越多的研究報告，首先在1980年. 養液作十倍連續稀釋液，使病毒液濃度稀釋為 10-. Schnitzlein 和Reichmann等人在BHK-21 細胞上證. 1-10-10 ，接著將 24 孔細胞培養盤中的培養液吸. 實腺苷酸會抑制vesicular stomatitis virus的複製，. 除，以 PBS 清洗後，依序加入不同稀釋倍數的病. 接著Sipka 等人在1988年證實腺苷酸會降低HIV. 毒液 1 ml，對照組則加入 1 ml不含病毒的 10％. 在H9T細胞中的表現，2002年 Leão-Ferreira 等人. FBS- L15 培養液，培養於 28℃，以倒立顯微鏡. 研究發現腺苷酸會藉由A2 receptor 來活化PKA進. 每日觀察其細胞病變效應的情形，連續觀察 7 天. 一步抑制vaccinia virus 在BSC-40細胞中的複製。. 並統計計算細胞所產生的病變數，依Reed and. 因此本研究目的是要探討腺苷酸是否會影響抑. Muench 法計算病毒TCID50力價。. 制GIV病毒在石斑魚腎臟(GK)細胞內的複製，此. 四、腺苷酸抑制GIV病毒基因的表現分析. 研究結果將可作未來GIV病毒防治的重要參考資. (一)、細胞RNA萃取:. 料。. 細胞處理腺苷酸和沒有處理的組別當對照組後，利用細胞刮棒收取細胞，將細胞懸浮液取至. 參、材料與方法. 15 ml離心管中，並以1000 rpm離心5分鐘，除去培養液後以1 ml PBS 懸浮細胞，取至1.5 ml離心管，. 一、病毒感染. 並以2000 rpm離心5分鐘，去除上清液，加入0.5. GK細胞株於28℃培養在 10％ FBS-L15 培養液。使用病毒效價分為MOI=0.01與5（MOI: Multiplicity of infection = ratio of infectious virus particles to cells)的GIV病毒，混於 2％ FBS-L15 培養液中進行病毒感染，培養於 28℃，以顯微鏡觀察其變化，並在感染不同時間點後進行試驗。. 二、腺苷酸對細胞生長影響. ml TRIZOL Reagent 將細胞溶解均質化，靜置於室溫3 分鐘，使核酸及蛋白質能完全溶離，加入 100 μl chloroform，激烈振盪2分鐘，混合均勻後靜置室溫下5分鐘，以轉速12,000 rpm，離心15 分鐘，取出無色上層液體，加入250 μl isopropyl輕輕混合均勻靜置15分鐘，使RNA脫水沉澱，再以轉速12,000 rpm，離心10 分鐘，去除上清液後，. 為了解腺苷酸是否會影響GK細胞之生長，. 加入80％ ethanol 後，以1000 rpm，離心5 分鐘以. 將105 GK細胞培養在 25T培養瓶中，放至 28℃培. 洗滌RNA 沉澱，去除上清液，置於室溫10分鐘揮. 養箱中培養約 1 天，接著加入含有不同濃度腺苷. 發乾燥，加入27 μl DEPC 水將RNA 溶解，測量. 酸(0 , 0.25 , 0.5 , 1 , 2 , 3 , 6 mM)的培養基於 28℃. OD260 Value，定量RNA 濃度，置於-20℃備用。. 分別培養1、2、3、4、5、6、7天。在加藥的 1、. (二)、反轉錄反應：. 2、3、4、5、6、7天中每天收集三重複實驗細胞. 以Oligo-dT primer作為引子與SuperscriptTM. 計算數目，了解不同濃度腺苷酸對GK細胞生長影. Ⅱ RNaseH-反轉錄酶（Gibco-BRL）進行反轉錄. 響。. 反應，製造出一段互補之cDNA，以此來當作PCR. 三、GIV病毒力價測定. 之模版。首先，於滅菌過之eppendrof 內，置入. 5盤10公分細胞培養皿各自培養106GK細. 2 μg total mRNA 、1 μl Oligo-dT、1 μl dNTP. 胞，分別處理不同濃度的腺苷酸(0 , 0.1 , 0.25 , 0.5. （10mM）、補DEPC 水至總體積為22μl，於. , 1mM) ，作用30分鐘後加入MOI=0.01的GIV，. 65℃下反應5分鐘，靜置於4℃ 10分鐘，加入6 μl. Journal of Cardinal Tien College of Healthcare & Management No.10 October 2012. 0 1 7.

(4) 5X First Strand Buffer、1 μl 0.1M DTT（0.1M）、 1 μl SuperscriptTM ⅡRTase， 25℃下反應5分鐘，再37℃下反應60分鐘，70℃下反應15分鐘，即完成反轉錄之步驟，得到cDNA，將其保存於 -20℃，作為後續PCR實驗用。 (三)、聚合酶鏈鎖反應（Polymerase chain reaction, PCR）聚合酶鏈鎖反應是在最終體積 50 μl 的反應溶液中進行分別加入 template DNA （0.05 μg）、 dNTP（0.2 mM）、forward primer（0.1 μΜ）、. 圖一：不同腺苷酸濃度(0 , 0.25 , 0.5 , 1 , 2 , 3 , 6 mM)對GK細胞的生長影響，圖表數值均為三重複實驗平均數值。. reverse primer（0.1 μΜ）、0.5 μl的 (5 U/μl） Bio Taq DNA polymerase、5 μl 的 10X PCR buffer. 二、腺苷酸抑制GIV病毒在細胞內增殖. （含有1.5 mM MgCl2）、最後補滅菌水至 50. GK細胞株為一能夠讓GIV病毒感染複製的. μl。PCR 反應是在 95℃ 5 分鐘，循環一次，95℃. 細胞株。當添加低病毒量MOI=0.01，培養於28℃. 40 秒，52℃～56℃ 40 秒（視不同引子而定），. 環境下並且讓病毒有足夠的時間感染與複製。結. 72 ℃ 1-2 分鐘循環 35 次，最後以 72℃ 作用 10 分. 果發現有處理腺苷酸的組別，其病毒力價明顯低. 鐘，使延長（extension）作用完全。最後PCR產. 於沒有處理的組別，隨著濃度的提高，病毒力價. 物利用瓊脂糖膠體電泳分析確認目標物之分子量. 也隨之降低(圖二）。另外，利用PCR檢測細胞內. 大小。. 的病毒基因體含量，用GIV病毒的外鞘蛋白基因 (major capsid protein, MCP）做為檢測目標基因來. 肆、結果. 檢測細胞內病毒基因體的含量，結果顯示隨著腺苷酸濃度的提高，外鞘蛋白的含量隨之減少（圖. 一、腺苷酸對GK細胞的生長影響為了研究腺苷酸對本研究採用的GK細胞株生. 三），說明在添加腺苷酸時，病毒基因體在細胞內的含量有明顯降低。. 長的影響，結果顯示在高於3 mM 腺苷酸的環境中，對GK細胞生長有抑制，並且有強烈的毒性反應。隨著濃度的降低，對GK生長影響的情形也趨於平緩，在0.5 mM 腺苷酸環境中時，對於細胞的影響是較小的，因此本論文選取0.5mM腺苷酸來探討對GIV感染複製影響（圖一）。. 圖二：腺苷酸對於GK細胞內病毒量之影響。GK 細胞分別處理不同濃度的腺苷酸(0 , 0.1 , 0.25 , 0.5 , 1mM) ，作用30分鐘後加入GIV （MOI=0.01），28℃ 培養 7 天，收取細胞培養液測量病毒的力價，圖表數值均為三重複實驗平均數值。.

(5) 毒感染後不論在早期或是晚期的基因表現，皆. (A). 有延遲基因表現的現象發生。正常GIV感染GK 細胞，早期表現基因Bak(078R)在感染後0.5小時此基因就會表現，但在GK細胞添加0.5 mM腺苷酸後，Bak(078R)延遲到2小時候才會表現此基因(圖五）。相同現象也出現在另一個早期基因 TNFR(030L)，原本在0.5小時此基因會表現，有添加腺苷酸後在2 小時才會表現此基因(圖六）；另外在病毒晚期表現基因的分析，病毒MCP(045R) 晚期基因原本在2 小時後基因會表現，但在添加腺苷酸，感染3小時後才會表現此基因(圖七），. (B). 同樣結果也出現在MMPA(059L)晚期基因，原本在2小時此基因會表現，有添加腺苷酸後會在12小時才會表現此基因(圖八）。. 圖三：腺苷酸對於病毒基因體含量之影響。GIV 病毒感染處理不同腺苷酸濃度的GK細胞， 7天後收取細胞並抽取全部的DNA，利用 PCR進行GIV病毒MCP基因含量的檢測，來判別GIV病毒基因體含量。(A) 不同腺甘酸濃度作用GK細胞，GIV病毒MCP基因電泳圖。M: marker ；Lane 1：0 ；Lane 2： 0.1 mM ；Lane 3：0.25 mM ；Lane 4：0.5 mM ；Lane 5：1 mM。；(B) A圖MCP基因量化。. 三、腺苷酸延遲抑制GIV病毒基因的表現實驗結果得知腺苷酸有抑制GIV病毒在細胞內複製的現象，進一步探討腺苷酸是如何抑制 GIV病毒的複製，首先觀察其基因表現的變化，將處理0.5 mM腺苷酸和沒有處理腺苷酸的細胞，分別在感染後不同時間點，利用RT-PCR方式檢. 圖四：利用 RT- P C R 定量 G K 細胞 β - a c t i n 基因量。(A)對照組：未添加腺苷酸；(B)實驗組：利用MOI=5的GIV病毒感染添加0.5 mM 腺苷酸的GK細胞。M：marker, C： uninfection。. 測GK細胞β-actin基因表現，結果顯示0.5 mM 腺苷酸不會影響GK細胞內基因表現(圖四)。接著進一步探討腺苷酸是否會影響GIV病毒基因表現，結果發現處理0.5 mM腺苷酸的組別，GIV病. Journal of Cardinal Tien College of Healthcare & Management No.10 October 2012. 0 1 9.

(6) 圖五：利用RT-PCR分析被感染GK細胞內GIV病毒早期基因Bak(078R)表現。(A)對照組：未添加腺苷酸；(B)實驗組：添加0.5 mM 腺苷酸。M：marker, C：uninfection。. 圖七：利用RT-PCR分析被感染GK細胞內GIV病毒晚期基因MCP(045R)表現。 (A)對照組：未添加腺苷酸；(B)實驗組：添加0.5 mM 腺苷酸。M：marker, C：uninfection。. 圖六：利用RT-PCR分析被感染GK細胞內GIV病毒早期基因TNFR(030L)表現。(A)對照組：未添加腺苷酸；(B)實驗組：添加0.5 mM 腺苷酸。M：marker, C：uninfection。. 圖八：利用RT-PCR分析被感染GK細胞內GIV病毒晚期基因MMPA(059L)表現。(A)對照組：未添加腺苷酸(B)實驗組：添加0.5 mM 腺苷酸。M：marker, C：uninfection。.

(7) 基因延遲的現象較顯著，晚期基因中又以059L 延. 伍、討論. 遲基因表現10 個小時最久。ORF 078R 和 030L 經本研究中證實了腺苷酸具有抑制GIV病毒複. cycloheximide藥物證實為病毒極早期感染表現基. 製的能力。先前的研究中指出，環境中存在高濃. 因，大約在感染後兩小時後表現，其中078R更具. 度的腺苷酸會導致細胞走向死亡途徑，本研究. 有抗細胞凋亡的能力(林, 2009)，研究顯示 GIV 感. 在GK細胞的結果也證實了如果腺苷酸濃度超過1. 染石斑魚 GK 細胞後，可藉由極早期基因 078R 的. mM時，腺苷酸會抑制GK細胞的生長，如果高於3. 表現來抑制寄主的細胞凋亡。極早期基因產物主. mM以上則有嚴重細胞毒殺的現象。本研究使用的. 要被認為作為調控病毒早期基因的表現，因此一. 腺苷酸濃度為0.5 mM，在GK細胞生長實驗分析，. 般認為早期基因表現延緩應該會連帶影響後期基. 發現並無影響GK細胞生長活性。. 因的表現，本研究結果也證實這個理論的推測，. 早於1987年即有研究報導腺苷酸類似物. 在ORF 078R 和 030L極早期基因表現受到延緩，. Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine可以抑制單. 我們也同時發現兩個晚期基因ORF 045R 和059L. 純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）DNA. 的表現同樣受到延緩，最後雖然證實新生病毒的. 合成，而達到抑制HSV的複製（North & Cohen.,. 效價也下降，但是否和基因延緩表現有直接的關. 1987）。Lamivudine是一種化學合成的核苷. 聯，例如078R基因表現延緩導致病毒感染初期. （nucleoside）類似物，本來是用來對抗HIV，. 抗細胞凋亡能力下降，細胞生理運作受到影響而. 後來研究發現可以抑制B 型肝炎病毒DNA 聚合. 導致病毒感染複製效果不佳，未來值得深入的探. 酶的活性，阻斷病毒DNA 合成，進而抑制B 型. 討。. 肝炎病毒的複製（Chang et al., 1992; Doong et al., 1991）。Acyclovir、Alaciclovir和Penciclovir. 陸、結論. 等藥物都是以類核苷酸結構為主，這類藥物進入遭受病毒感染細胞後，會藉著病毒thymidine. 在本研究結果我們證實腺苷酸確實會影響. kinase 和宿主細胞本身的kinase 磷酸化之後，. GIV病毒基因在細胞中的表現與複製，造成感染. 變成攜帶三個磷酸的型態，如此便可以被病毒. 細胞中病毒基因體的減少，同時也降低感染後的. DNA polymerase 所利用，鑲插入正在進行複製的. 新生病毒力價。安全農業是目前的趨勢，中草藥. DNA 片段中，導致DNA 延長受到阻斷而有抑制. 是天然物質，中草藥及其萃取物飼料添加劑以其. 病毒複製的活性(Khandazhinskaya et al., 2006)。. 無毒、無抗藥性、加強免疫、整體系統調節和經. 另一方面，有學者比較腺苷酸和其類似物7-deaza-. 濟實用性等優勢，成為未來飼料添加劑研發的主. adenosine，實驗結果發現7-deaza-adenosine對於. 流，它不會積累於動物體內或長期殘留於水中，. 抑制C 型肝炎病毒複製方面，具有較佳的效果. 非常適合發展成為綠色安全飼料。蛹蟲草為中國. （Olsen et al., 2004）。在本研究中發現腺苷酸會. 藥用蕈類，其所包含的化學成份麥角固醇、腺苷. 抑制GIV病毒在GK細胞複製的情形，甚至最高可. 酸及蟲草素已被證實有提升免疫藥理活性，而且. 抑制病毒基因體複製達50%以上，進一步探討其. 目前研究學者正積極利用改變發酵條件，獲得大. 抑制原因，發現可能和抑制延緩病毒相關基因的. 量腺苷酸及蟲草素。本研究證實在適量的腺苷酸. 表現有關，本研究所探討的基因表現影響分別為. 濃度下，不僅不會造成嚴重的細胞毒性，還可有. 病毒兩個極早期表現基因(ORF 078R 和 030L)和兩. 效的降低新生GIV病毒的力價，因此蛹蟲草未來. 個晚期表現基因(ORF 045R 和059L)，其中以晚期. 非常有潛力運用於我國高經濟養殖魚類飼料添加. Journal of Cardinal Tien College of Healthcare & Management No.10 October 2012. 0 2 1.

(8) 物，其中的蟲草素不僅可以提高免疫力，腺苷酸. Collection of Czechoslovak Chemical. 更可以降低病毒感染複製力，提升我國水產養殖. Communications. 71: 1107-1121, 2006. Lai YS, Chiou PP, Chen WJ, Chen YC, Chen CW,. 的競爭力。. Chiu IS, Chen SD, Cheng YH, Chang CY.. 參考文獻. Characterization of apoptosis induced by grouper iridovirus in two newly established cell lines. Chang CN, Skalski V, Zhou JH, and Cheng YC. Biochemical pharmacology of (+)- and (-)-2＇, 3＇ -dideoxy-3＇-thiacytidine as anti- hepatitis B virus agent. Journal of Biological Chemistry. 267: 22414-22420, 1992. Chou HY, Chang SJ, Chen LM. Investigation on the viral diseases of cultured grouper (Epinephelus sp.) and red sea bream (Pagrus major). Reports. on Fish Disease Research (XIV), COA Fisheries Series 46 : 41-49, 1994. C h o u H Y, H s u C C , P e n g T Y. I s o l a t i o n a n d characterization of a pathogenic iridovirus from cultured grouper (Epinephelus sp.) in Taiwan.. Fish Pathology 33: 201-206, 1998. Doong SL, Tsai CH, Schinazi RF, Liotta DC, and Cheng YC. Inhibition of the replication of hepatitis B virus in vitro by 2＇, 3＇ -dideoxy3＇-thiacytidine and related analogues. Proc Natl. Acad Sci USA. 88: 8495-8499, 1991. Essbauer S, Ahne W. Viruses of lower vertebrates.. Journal of Veterinary Medicine B 48: 403-475, 2001. Jakob NJ, Müller K, Bahr U, Darai G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology 286: 182–196, 2001. Khandazhinskaya AL, Shirokova EA, Shipitsin AV, Karpenko IL, Belanov EF, Kukhanova MK, Yasko MV. Adenosine N1-Oxide Analogues as Inhibitors of Orthopox Virus Replication.. from barramundi, Lates calcarifer (Bloch).. Journal of Fish Diseases 31: 825-834, 2008. Leão-Ferreira LR, Paes-De-Carvalho R, De Mello FG, Moussatché N. Inhibition of vaccinia virus replication by adenosine in BSC-40 cells: involvement of A2 receptor-mediated PKA activation. Archives of Virology 147: 1407-1423, 2002. Lin PW, Huang YJ, John JAC, Chang YN, Yuan CH, Chen WY, Yeh CH, Shen ST, Lin FP, Tsui WH, Chang CY. Iridovirus Bcl-2 protein inhibits apoptosis in the early stage of viral infection.. Apoptosis 13 (1), 165-176, 2008. North TW, Cohen SS. Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine as a specific inhibitor of herpes simplex virus replication in the presence and absence of adenosine analogues. Proc Natl Acad Sci USA.. 75 : 4684-4688, 1978. Olsen DB, Eldrup AB, Bartholomew L, Bhat B, Bosserman MR, Ceccacci A, Colwell LF, Fay JF, Flores OA, Getty KL, Grobler JA, LaFemina RL, Markel EJ, Migliaccio G, Prhavc M, Stahlhut MW, Tomassini JE, MacCoss M, Hazuda DJ, Carroll SS. A 7-deaza-adenosine analog is a potent and selective inhibitor of hepatitis C virus replication with excellent pharmacokinetic properties. Antimicrobial Agents and. Chemotherapy 48: 3944-3953, 2004. Schnitzlein WM, Reichmann ME. Inhibition of vesicular stomatitis virus replication by adenosine. Virology 103: 123-137, 1980..

(9) Sipka S, Nagy K, Szegedi G. Adenosine induced delay of expression of AIDS virus, HIV, in H9T cells. Acta Biochimica Et Biophysica Hungarica. 23: 75-82, 1988. Tsai CT, Ting JW, Wu MH, Wu MF, Guo IC, Chang CY. Complete genome sequence of the grouper iridovirus and comparison of genomic organization with those of other iridoviruses.. Journal of Virology 79 (4): 2010-2023, 2005. Williams T. The iridoviruses. Advances in Virus. Research 46: 345–412, 1996. 2003趙嘉本•台灣養殖魚類感染虹彩病毒之病理. 學及基因研究。未出版博士論文•國立中山大學生物科學系研究所 2009林姵妏•石斑魚虹彩病毒極早期基因 078R 和. 030L 之功能分析。未出版博士論文•國立台灣海洋大學海洋生物研究所. 0 2 3. Journal of Cardinal Tien College of Healthcare & Management No.10 October 2012.

(10) A study of adenosine-mediated inhibition the replication of iridovirus in grouper kidney cells Associate Professor, Department of Nursing, Cardinal Tien College of Healthcare & Management ◎Sui-Wen Lin Student, Department of Biotechnology and Animal Science, National I-Lan University ◎Jian-Jhih Huang Associate Professor, Department of Biotechnology and Animal Science, National I-Lan Universit ◎Yu-Shen Lai. ABSTRACT Adenosine is a purine nucleoside comprising a molecule of adenine attached to a ribose sugar molecule (ribofuranose) moiety via a β-N9-glycosidic bond. It has been previously demonstrated that adenosine can inhibit the replication of vaccinia virus in the monkey kidney BSC-40 cells. In this study, we investigated whether adenosine can interfere with the replication of grouper iridovirus (GIV) in grouper kidney (GK) cells. Our datas showed that the replication of GIV was inhibited by adenosine in GK cells. In RT-PCR assay, we found that the pre-treatment with adenosine resulted in a delayed expression of the early and late genes of GIV in the GK cells.. Keywords: adenosine, iridovirus.

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