行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
免疫磁性乳膠顆粒的製備與臨床應用
Preparation and clinical application of immuno-magnetic latex
計畫編號：NSC 90-2314-B-002-300
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日
主持人：林東燦 執行機構及單位名稱
一、中文摘要 在最近十年內，周邊造血幹細胞的移 植，廣泛地應用於癌症的治療。異體移植 可以用來解決不同的的血液疾病，自體移 植對於高劑量化療的病患，可以加速病患 骨髓的回復，防止感染或出血的併發症發 生。但是自體移植總有癌細胞污染之疑 慮，而異體移植亦有移植物抗宿主病的難 題。所以，選取 CD34+細胞作為移植可能 可以避免上述兩項移植的缺點而達到更好 的效果。在一般商業化選取 CD34+細胞是 利用磁場分離(magnetic cells sorting)。但是 MACS 所使用的帶有 anti-CD34 單株抗體 的免疫磁性乳膠顆粒是非常貴的。每處理 一次約需 20 萬台幣。我們嘗試利用我們自 製的免疫磁性乳膠顆粒上的 COOH 官能基 鍵結 anti-CD34 單株抗體，去做相同純化的 療程。我們相信自製的免疫磁性乳膠顆粒 會較便宜，病人也能夠負擔得起。我們希 望此技術能夠進行，而且期待可以推廣至 其他負向選取（negative selection），例如接 枝 anti-CD4 或 anti-CD8 去移除 CD4+ 細 胞或 CD8+細胞，用來治療一些自體免疫方 面的疾病。 關鍵詞： CD34+細胞，磁場分離，磁性乳膠顆粒 AbstractPeripheral blood stem cell transplantation (PBSCT) is widely used in
this decade for cancer treatment. Allogeneic setting can be used for various blood diseases and autologous setting may be benefit for solid tumors as a rescue after high-dose chemotherapy to accelerate the bone marrow recovery and prevent the infections or bleeding complications. But, possibility of tumor cells contamination is a pitfall of autologous PBSCT while increased incidence of graft vs. host disease may decrease the successful rate in allogeneic PBSCT. So, CD34+ cells selection will solve the above problems. The commonly used and commercially available method of CD34+ cells selection is magnetic cells sorting. But the beads with anti-CD34+ monoclonal antibodies are rather expensive. It needs 200,000 NT per procedure. So, We try to bind anti-CD34 to our homemade magnetic beads using –COOH bounding in order to do the same purging procedure. We do believe the homemade price will be rather cheap and can be afforded by patients themselves. We hope this technique will work and it can be expanded to other negative selection such as anti-CD34 or anti-CD8 to remove CD4+ or CD8+ cells in order to treat some antoimmune diseases.
Keywords: CD34+ cells, magnetic cells
sorting, magnetic beads
早期的周邊造血幹細胞只是合併自體 骨髓移植使用以確保病人接受足夠的幹細 胞移植而加速血球及血小板的恢復速度。 但周邊造血幹細胞合併自體移植對於病人 而言除了可以加速病人移植後的造血速度 以減少病人的住院日數外，還可以減少病 人移植後血小板或紅血球輸血的數量以減 少病人醫療費用的支出和其他的併發症發 生（如感染）。因此近年來周邊造血幹細胞 移植被廣泛的應用到臨床腫瘤治療上，目 前雖然已有相當多的資料支持周邊造血幹 細胞移植應用在惡性淋巴瘤、多發性骨髓 瘤、乳癌等病人當作高劑量化學治療的支 持療法。1 由於對周邊造血幹細胞研究的進步， 臨床上可以收集到足夠數量和功能的造血 幹細胞以應用於病人身上當作高劑量化療 後來加速病人移植後造血幹細胞植入的時 效，因此可以預期將來除了對於自體周邊 造血幹細胞移植應用的範圍會更加開展 外，異體周邊造血幹細胞的移植在可避免 捐贈者全身麻醉的危險和恐懼感及疼痛的 壓力下，恐怕在不久的將來如能有效地排 除因內含較高比率的 T 細胞淋巴球所導致 的較高比率移植物抗宿主病的問題時即有 可能取代異體骨髓移植在當今對血液惡性 腫瘤疾病治療所扮演的角色 2-4。利用對於 周邊造血幹細胞生物學研究的突破，除了 可以將病人體內 CD34+細胞分離出而在實 驗室內加以擴增培養以作為多次或重複高 劑量化學治療後救援性支持療法的使用 外，尚可以利用目前最新的基因崁入技術 發展出基因治療移植術，以改善目前有些 令人感到挫折的癌症病人的治療結果。1 諸多証據顯示愈來愈高的高劑量化學治療 並不能根除所有的惡性細胞，以造血幹細 胞移植來治療多種血液惡性疾病過程中， effect)才是降低復發率的真正重要的免疫 機制5。慢性骨髓性白血病移植後復發的病 患，再輸入大量原來捐贈者的淋巴球，藉 著移植物對抗腫瘤效應，百分之七十五的 患者會再次完全緩解，雖然百分之八十會 發生急性移植物抗宿主疾病。目前臨床幹 細胞移植應用趨向採用較緩的調理療法,先 成功植入異體造血幹細胞，作好移植物抗 宿主疾病預防措施後，再大量植入捐贈者 淋巴球，營造出有效的移植物對抗腫瘤效 應，藉此根除所有的惡性細胞，此作法除 了可望提高治癒率之外，更因採用較緩和 的調理療法可減輕臨床多種嚴重併發症的 發生，降低死亡率6。 人體移植所需要的造血幹細胞數目究要多 少方能達到成功的植入截至目前為止仍未 確定，但許多的研究證據指出造血系統的 重建速度與所輸入的造血幹細胞數量成直 接相關性，一般標準的動員人體體內的造 血幹細胞所使用方法為 G-CSF 每天每公斤 皮下注射 10-15 毫克其間視是否合併化學 治療而不同，單獨使用為 5-7 天，合併化 療則需 10-14 天，視化療的強度而不同， 至於 GM-CSF 與 G-CSF 的使用方法和效率 相當，但前者的副作用較大。至於一些新 問世的造血細胞生長因子目前的資料則顯 示似乎可以與 G-CSF 合併達到加成作用而 改善造血幹細胞收集的效率7。 自體移植總有癌細胞污染之疑慮，而異體 移植亦有移植物抗宿主病的難題。所以， 選取 CD34+細胞作為移植可能可以避免上 述兩項移植的缺點而達到更好的效果。至 於 在 眾 多 分 離 CD34+ 方 式 中 ， 只 有 Magnetic cell sorting (MACS)的所得到的純
度和產率是較高的8。
臨床上對於收取造血幹細胞的方式通常係 以較新型的連續性血液細胞分離機，如
行白血球分離術，一般施行原則大約在 3-4 小時內分離病人或捐贈者 10-20 公升血液 即可得到所要的細胞數。血球分離過程當 中病人或捐贈者僅會一些輕微的不適症狀 如低血鈣、低血壓、以及冷顫感等。 在上述的最佳分離方式中所需的材料為包 覆磁性材料之免疫乳膠顆粒，初步先合成 磁性乳膠顆粒，再利用 E.D.C.活化磁性乳 膠顆粒上 COOH 官能基，再和免疫球蛋白 （例如 anti-CD34 antibody）上 NH2鍵結， 再利用 MACS 分離技術，分離出 CD34+細 胞。有鑑於國外所可買到免疫磁性乳膠顆 粒極為昂貴（每處理一次約需 20 萬台幣）， 故亟思自製自產之免疫磁性乳膠顆粒以便 宜價錢供應國內病患使用，以造福癌症病 患。 三、實驗方法 (一) 製備磁性乳膠顆粒 以共沈法來合成 Fe3O4的磁性流體。取
FeCl3•6H2O，FeCl2•4H2O，氨水攪拌反應 6
分鐘，放在加熱板上加速沈澱，吸掉上層 澄清液，再加入月桂酸，以 90℃反應 4 分 鐘，加二次水至 1L。 第一步：以甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate, MMA），磁性流體，以無乳化 劑乳化聚合合成包覆磁性粒子的種子。 第二步：以第一步反應的乳膠顆粒為 種子，再加入不同比例的親水性甲基丙烯 酸（Methyl acrylic acid, MAA）與拒水性甲 基丙烯酸甲酯的單體，已無乳化劑種子乳 化聚合，合成表面具官能基（COOH）的 磁性高分子乳膠顆粒。 將第二步聚合完之磁性乳膠顆粒，以 （分子量 8000-10000）透析袋透析一星 期，並天換水，以除去未反應單體。 將透析完之磁性乳膠顆粒烘乾，並利 用超導量子干涉磁量儀(SQUID)測量磁性 乳膠顆粒之磁滯曲線。 將透析完之磁性乳膠顆粒烘乾，並利 用 BET 測量磁性乳膠顆粒之表面積。 將透析完之磁性乳膠顆粒，利用導電 度 滴 定 方 式 ， 測 量 磁 性 乳 膠 顆 粒 表 面 (COOH)官能基的含量。 (二) 接枝 streptavidin 透析過的磁性乳膠顆粒，取定量磁性 乳 膠 顆 粒 固 含 量 10% 、 偶 合 劑 E.D.C 10mg/mL、NHS 100nM，溶於 MES buffer 50 mM，反應 30min 進行羧酸基 COOH 的活 化。 將活化完的磁性乳膠顆粒，離心，倒 掉上層澄清液，以 pH=6.1 之 MES buffer 50mM 再懸浮，再離心，倒掉上層澄清液。 將活化完的磁性乳膠顆粒，再懸浮於 50mM MES buffer ， 並 加 入 streptavidin 100g/mL，反應 1 hr。 將反應完之磁性乳膠顆粒，離心，並 倒掉上層澄清液，以 pH=6.1 之 MES buffer 50mM 再懸浮，再離心，重複上述步驟， 再懸浮於 PBS，再滴入 0.02%的 NaN3，保 存於 4℃環境下。 (三) 檢測接枝情形 鍵 結 streptavidin 的 磁性乳膠顆粒以 light scattering 測量接枝前後粒徑的差異。 鍵 結 streptavidin 的 磁性乳膠顆粒以 Zeta potential 測量接枝前後，磁性乳膠顆粒 所帶的表面電位。 (四) 臨床病理之應用 取適量的經白血球分離術之檢體，加 入 biotin-antiCD34 抗體反應 1 小時，將我 們所製備的表面鍵 結 streptavidin 的磁性 乳膠顆粒先利用 AB 型血清 blocking 再加 入 ， 利 用 MACS column positive 選 取 CD34+細胞，利用流式細胞儀分析。
經過固定後，利用掃瞄式電子顯微鏡 觀察細胞表面接上乳膠顆粒的情形。
(一) 製備磁性乳膠顆粒 本實驗所合成的磁性乳膠顆粒，採兩 步驟無乳化劑乳化聚合反應所得。其穿透 式電子顯微鏡，如圖一。由圖一可知磁性 乳膠顆粒粒徑約 100nm，而且內部包覆 Fe3O4磁性粒子(在圖一中，黑色部分)。 實驗中因為需要藉由磁場分離，而且 當磁場消失時，磁性乳膠顆粒必須沒有磁 性，才易於取出，所以所合成之磁性乳膠 顆粒必須沒有磁滯現象，如圖二。當外加 磁場為零時，殘留磁化量也是零。 本實驗所製備之磁性乳膠顆粒之表面 積以及表面-COOH 官能基，如表一所示。 本實驗表面積是由 BET 所測量。磁性乳膠 顆粒之表面-COOH 官能基，是由電導度計 以 0.1 N NaOH 滴定測量，得一轉折點，此 轉則點為當量點。如果 COOH 官能基在第 二步聚合反應時被包埋在裡面時，會造成 表面官能基滴定的誤差。 (二) 檢測接枝情形 接枝 streptavidin 前、後之磁性乳膠顆 粒，其 light scattering 分析如圖三和圖四。 在接枝前，所測得的磁性乳膠顆粒，其粒 徑約 193nm 比電子顯微鏡下分析的還要 大，原因是因為 light scattering 所測量的為 磁性乳膠顆粒澎潤時的粒徑；穿透式電子 顯微鏡所測量的為乾燥時的粒徑。當接枝 streptavidin 後之免疫磁性乳膠顆粒，其粒 徑分佈變得比較寬廣。 接接 streptavidin 前、後之磁性乳膠顆 粒，其 zeta potential 分析如圖五。由圖五 可以知道未接枝 streptavidin 之磁性乳膠顆 粒，其表面電位皆為負值，因為 COOH 官 能基所造成的影響。接枝 streptavidin 之磁 性乳膠顆粒，其表面電位在低於 pH =3 呈 正 值 ， 因 為 streptavidin 其 等 電 位 點 (isoelectric point pI~5)，所以造成低 pH 值 時，表面電位為正，也間接證明 streptavidin 有鍵結至磁性乳膠顆粒表面。 (三) 臨床病理檢驗 檢體經過 磁性免疫乳膠顆粒的處理 前、後之流式細胞儀分析圖如圖六和圖 七。由圖六和圖七比較可知檢體經磁性免 疫乳膠顆粒的處理，可以提高 CD34+ 細胞 的濃度。但是還不是很理想，其原因可能 為我們分離細胞所用的抗體和流式細胞儀 分析時所使用抗體為同一株(Qbend10)，部 分細胞中表面抗原，可能被分離細胞所用 的抗體佔據，造成數值降低。 檢體經過磁性免 疫乳膠顆粒的處理 前、後之掃瞄式電子顯微鏡圖如圖八和圖 九。由圖九，可以觀察到磁性免疫乳膠顆 粒鍵結在細胞表面，且粒徑約 100nm。 五、計畫成果自評 本計畫所合成表面鍵結 streptavidin 之 磁性乳膠顆粒，只要改變 biotin-抗體，可 以應用到其它的細胞分離。 本計畫要以便宜的價格應用於臨床醫 療，需自行製備抗體。 我 們 其 以 融 合 瘤 技 術 製 備 大 量 anti-CD34 抗體，以增加鍵結，來提高分離 細胞之產率。 六、參考文獻
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圖一 磁性乳膠顆粒之穿透式電子顯微鏡 圖
Applied magnetic field (Gauss)
-15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 M a g n e ti z a ti o n (e m u /g ) -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 圖二 磁性乳膠顆粒之磁滯曲線 表一不同比例之磁性乳膠顆粒表面官能基 磁性乳膠 顆粒 Surface Area (m2/g) 表面官能基 (mole/g) 表面官能基 (mole/m2) CS55 29.0214 8.36*10-5 2.88*10-06 CS73 34.5178 4.00*10-5 1.16*10-06 0.5CS55 21.3440 5.44*10-5 2.55*10-06 0.5CS73 28.2603 2.62*10-5 9.27*10-07
圖三 磁性乳膠顆粒經 light scattering 分析 圖 圖四 鍵結 streptavidin 之磁性乳膠顆粒以 light scattering 分析圖 pH 2 4 6 8 10 zeta po te ntial ( m V ) -60 -40 -20 0 20 40 60 磁性乳膠顆粒 鍵結streptavidin之磁性乳膠顆粒 圖五鍵結 streptavidin 前、後之磁性 乳膠顆粒經 zeta potential 分析圖 圖六檢體未經免疫乳膠顆粒處理之流式細 胞分析儀圖譜 圖七檢體經免疫磁性乳膠顆粒處理之流式 細胞分析儀圖譜
圖八檢體未經免疫乳膠顆粒處理之掃瞄式 電子顯微鏡圖
圖九檢體經免疫乳膠顆粒處理之掃瞄式電 子顯微鏡圖
