建構Securin蛋白質交互作用網絡

國立交通大學

生化工程研究所

碩士論文

建構

Securin 蛋白質交互作用網絡

Construction of Securin Interaction Network

研究生：楊瑤貞

指導教授：張家靖 教授

建構

Securin 蛋白質交互作用網絡

Construction of Securin Interaction Network

研究生：楊瑤貞 Student：Yao-Chen Yang

指導教授：張家靖 Advisor：Chia-Ching Chang

國立交通大學

生化工程研究所

碩士論文

A Thesis

Submitted to Department of Biochemical Engineering

College of Biological Science and Technology National Chiao Tung University

in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of

Master in

Biochemical Engineering

July 2009

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

I 建 構 Securin 蛋 白 質 交 互 作 用 脈 絡 網 學 生 ： 楊 瑤 貞 指 導 教 授 ： 張 家 靖 教 授 國 立 交 通 大 學 生 物 科 技 學 系 生 化 工 程 研 究 所 碩 士 班

摘 要

Securin 是 一 個 多 功 能 蛋 白 質，且 在 許 多 癌 症 中 有 高 量 的 表 現，但 是 對 於 securin 如 何 調 控 癌 症 細 胞 的 機 制 目 前 尚 未 完 全 解 開，所 以 希 望 能 藉 由 建 構 與 securin 蛋 白 質 作 用 的 網 絡 ， 更 進 一 步 的 了 解 securin 的 作 用 機 制 。 我 們 使 用 免 疫 沉 澱(IP)、酵 母 菌 雙 雜 交 系 統 (yeast two hybrid)及 遠 西 方 墨 點 法 (Far Western)等 方 法 篩 選 出 與 securin 結 合 的 蛋 白 質 ， 經 由 質 譜 儀

(MALDI-TOF Mass)分 析 其 序 列 後 ， 確 定 這 些 蛋 白 質 為 PCAF、 T-box3、 Histone H4、 KRT1、 BCl2A1、 Dopamine receptor D4、 及 RNA cyclase， 藉 由 這 些 與 securin 作 用 的 蛋 白 質，我 們 可 以 知 道，securin 除 了 已 知 功 能 外 ， 還 可 能 與 蛋 白 質 乙 醯 化 的 調 節 、Histone H4、Cytoskeleton 及 抗 細 胞 凋 亡 的 BCl2A1 有 關 。 另 外 我 們 使 用 兩 種 方 式 測 量 蛋 白 質 之 間 的 交 互 作 用 ： 遠 西 方 墨 點(Far Western)法 及 恆 溫 滴 定 微 卡 洛 里 計 (ITC)， 實 驗 中 以 p53 與 securin 為 代 表， 分 別 用 兩 種 方 式 測 得 其 作 用 力 大 小， 此 測 量 系 統 能 應 用 於 測 量 不 同 環 境 下 蛋 白 質 之 間 的 作 用 力 ， 以 及 不 同 修 飾 狀 態 下 的 蛋 白 質 作 用 力 大 小 ， 作 為 探 討 蛋 白 質 之 間 分 子 作 用 機 制 的 分 析 方 法 。

II

Global securin interaction network： Functional analysis of securin

Student：Yao-Chen Yang Advisor：Dr. Chia-Ching Chang

Department of National Chiao Tung University

ABSTRACT

Human securin is a multifunctional protein and highly expressed in many

types of tumor cell. The function of securin is regulating separase that control

cell division and cell cycle, and DNA repair mechinary. However, the

molec1ule mechanism of securin in cell cycle regulation remains unclear. To

understand the role of securin in cell cycle, a protein-protein interaction

network of securin was constructed try using immunoprecipitation, yeast two

hybrid and Far Western methods. We found several proteins may interact with

securin such as PCAF, T-box3, Histone H4, KRT1, BCl2A1, Dopamine

receptor D4 and RNA cyclase. From the results of the experiments, securin

may participate in protein acetylation, mofification of Histone H4 and

apoptosis. Meanwhile we measured the protein-protein interaction by using

Far Western and ITC. The two systems offered us a useful tool to analyze

protein-protein interaction in different environments and different situations

III

誌 謝

很 開 心 完 成 了 碩 士 的 學 業 ， 在 這 兩 年 期 間 學 習 到 許 多 實 驗 的 技 術 及 思 考 的 方 式 ， 這 都 要 感 謝 指 導 教 授 張 家 靖 老 師 給 予 的 建 議 及 教 導 。 謝 謝 甘 魯 生 教 授 、 袁 俊 傑 教 授 及 陳 至 信 博 士 於 百 忙 之 中 給 與 論 文 上 的 建 議 及 指 正 。 能 夠 順 利 完 成 論 文 要 特 別 感 謝 東 華 大 學 何 彥 鵬 老 師 以 及 陳 佳 貞 同 學 在 質 譜 分 析 上 給 予 的 協 助 。 在 兩 年 之 前 ， 對 於 實 驗 室 的 運 作 算 是 懵 懵 懂 懂 ， 在 兩 年 間 我 逐 漸 清 楚 做 實 驗 是 怎 麼 回 事 ， 也 深 刻 的 感 覺 的 做 研 究 的 思 考 必 須 很 靈 活 、 隨 時 補 充 新 的 知 識，雖 然 自 己 還 有 很 多 不 足 的 地 方，但 是 我 確 信 自 己 的 確 有 所 成 長， 謝 謝 曾 博 及 鄭 博 給 我 很 多 思 考 的 方 式 及 實 驗 上 的 協 助 ， 還 要 特 別 感 謝 內 心 善 良 的 朱 大 哥 ， 總 是 用 幽 默 的 方 式 給 我 很 多 建 議 及 幫 助 ， 銘 記 在 心 。 謝 謝 當 初 教 我 securin 的 昌 祐 學 長 ， 也 謝 謝 輔 宣 在 ITC 實 驗 上 給 予 的 協 助 。 謝 謝 我 的 實 驗 室 同 學 及 學 長 們 靖 淳 、 芳 馨 、 沈 筱 薇 、 子 正 、 辰 哥 、 朱 大 哥 及 簡 哥 ， 有 你 們 的 陪 伴 讓 我 覺 得 兩 年 過 得 更 快 了 一 點 ， 也 祝 福 大 家 在 未 來 能 更 順 利 ， 我 相 信 我 們 都 可 以 的 。 實 驗 之 外 ， 我 最 最 感 謝 的 是 我 的 父 母 不 論 在 經 濟 上 或 心 靈 上 總 是 支 持 我 唸 書 ， 家 人 永 遠 是 我 的 精 神 支 柱 ， 還 要 謝 謝 陪 伴 我 很 久 的 崇 豪 ， 從 大 學 畢 業 以 來 我 一 路 摸 索 自 己 的 路 ， 謝 謝 你 總 是 鼓 勵 我 去 嚐 試 ， 很 慶 幸 有 你 。 最 後 要 感 謝 我 的 好 朋 友 們 總 是 寬 容 我 懶 得 與 人 連 絡 的 天 性，謝 謝 闕、依 萍、 珮 琪 、 晏 甄 、 尼 尼 、 金 鈴 以 及 族 繁 不 及 備 載 的 朋 友 ， 謝 謝 你 們 還 願 意 跟 我 聯 絡 ， 在 此 祝 福 老 師 、 學 長 及 所 有 認 識 的 朋 友 未 來 都 能 更 順 遂 。

IV

目 錄

摘 要... I Abstract... II 誌 謝... III 目 錄... IV 圖 目 錄 ... VII 表 目 錄 ... VIII 縮 寫 表 ... IX 第 一 章 緒 論 ... 1 1-1 研 究 動 機 ... 1 1-2 系 統 生 物 學 介 紹 ： ... 1 1-3 Securin 蛋 白 質 介 紹 ： ... 1 1-3.1 Securin 結 構 ... 2 1-3.2 Securin 功 能 ... 3 1-3.3 細 胞 週 期 與 癌 症 ... 4 1-3.4 securin 的 其 他 功 能 ... 5 1-4 A549 及 U937... 5 1-4.1 securin 在 不 同 細 胞 的 表 現 量 ... 6 第 二 章 實 驗 策 略 ... 7 第 三 章 實 驗 原 理 ... 8 3-1 蛋 白 質 securin 製 備 ... 8 3-2 Far Western ... 8 3-3 免 疫 沉 澱 ( Immunoprecipitation ) ... 9

3-4 恆 溫 滴 定 微 卡 洛 里 計 (Isothermo Titration Calorimetry， ITC) ... 10

3-5 二 維 電 泳 ( Two-Dimensional Gel Electrophoresis ) ... 11

3-6 Yeast Two Hybrid ... 11

第 四 章 實 驗 材 料 及 方 法... 13

V 4-2 Securin 蛋 白 質 製 備 ... 13 4-3 西 方 墨 點 法 (Western Blot)... 14 4-4 二 維 電 泳 及 遠 西 方 墨 點 法 ... 14 4-5 免 疫 沉 澱 ... 16 4-6 MALDI-TOF Mass ... 16 第 五 章 實 驗 結 果 ... 19 5-1 Securin 基 因 及 蛋 白 質 鑑 定 ... 19

5-2 Far Western & Mass ... 22

5-3 IP & Mass ... 26

5-4 酵 母 菌 雙 雜 交 系 統 (Yeast two hybrid) ... 32

5-5 ITC ... 32

5-6 Far Western 確 認 p53 及 securin 作 用 ... 34

第 六 章 討 論 ... 36

6-1 Securin 可 信 度 及 蛋 白 質 純 度 ... 36

6-2 文 獻 搜 尋 與 Securin 作 用 的 蛋 白 質 ... 36

6-3 與 Securin 作 用 蛋 白 質 功 能 探 討 ... 37

6-3.1 P53 ... 38

6-3.2 Ribosomal S10 and HSJ2 (DnaJ)... 38

6-3.3 PTTG-binding factor (PBF) ... 39 6-3.4 Cdc28 (CDK2) ... 40 6-3.5 Cdc20 ... 41 6-3.6 Ku70/80 ... 42 6-3.7 Phosphatase 2A (PP2A) ... 43 6-3.8 Separase... 44 6-3.9 SP1 ... 44 6-3.10 MEK1 ... 44

6-4 Far Western 篩 選 與 Securin 作 用 蛋 白 之 結 果 ... 45

6-5 免 疫 沉 澱 篩 選 與 Securin 作 用 蛋 白 之 結 果 ... 46

6-5.1 Histone H4 ... 46

6-5.2 BCL2A1 ... 47

VI

6-5.4 Dopamine receptor D4 ... 48

6-5.5 RNA terminal phosphate cyclase-like 1 ... 49

6-5.6 免 疫 沉 澱 結 果 討 論 ... 49 6-6 Securin 作 用 蛋 白 質 網 絡 探 討 ... 49 6-6.1 細 胞 分 裂 ... 49 6-6.2 細 胞 凋 亡 ... 50 6-6.3 DNA 修 復 及 轉 錄 活 性 ... 50 6-6.4 、 其 他 ... 51 6-6.5 結 論 ... 51 6-7 蛋 白 質 交 互 作 用 及 作 用 力 的 大 小 ... 51 6-7.1 模 擬 細 胞 內 不 同 胞 器 的 pH 值 及 鹽 類 環 境 ... 52 6-7.2 具 有 後 修 飾 作 用 蛋 白 質 ... 52 6-7.3 建 構 測 定 蛋 白 質 結 合 力 系 統 現 況 ... 52 6-8 總 結 ... 53 第 七 章 參 考 文 獻 ... 55

VII

圖 目 錄

圖 1-1、 Securin 結 構 示 意 圖 ... 3 圖 1-2、 Securin 調 節 Separase 示 意 圖 ... 4 圖 3- 1 、 Far Western 實 驗 原 理 ... 9 圖 3- 2、 免 疫 沉 澱 原 理 示 意 圖 ... 10 圖 3- 3、 ITC 結 構 示 意 圖 ... 11

圖 3- 4、 Yeast Two Hybrid- CytoTrapsystem ... 12

圖 5- 1、 pET200-Securin 基 因 圖 譜 ... 19

圖 5- 2、 securin 轉 殖 菌 株 之 基 因 確 認 ... 20

圖 5- 3、 Securin 被 IPTG 大 量 誘 導 生 產 ... 21

圖 5- 4、 Securin 蛋 白 質 確 認 ... 21

圖 5- 5、 Far Western Assay ... 24

圖 5- 6、 MALDI-TOF Mass 結 果 ... 25 圖 5- 7、 免 疫 沉 澱 結 果 ... 27 圖 5- 8、 免 疫 沉 澱 蛋 白 質 經 由 質 譜 分 析 結 果 A-1 ... 28 圖 5- 9、 免 疫 沉 澱 蛋 白 質 經 由 質 譜 分 析 結 果 A-2 ... 29 圖 5- 10、 免 疫 沉 澱 蛋 白 質 經 由 質 譜 分 析 結 果 B-1 ... 30 圖 5- 11、 免 疫 沉 澱 取 得 蛋 白 質 ， 經 由 質 譜 分 析 得 到 的 結 果 B-2 ... 31

圖 5- 12、 Yeast two hybrid ... 32

圖 5- 13、 Far Western 證 明 p53 與 securin 有 交 互 作 用 ... 35

圖 5- 14、 由 Far Western 實 驗 估 計 p53 與 securin 作 用 常 數 ... 35

圖 5- 15、 ITC p53 滴 定 securin 圖 ... 33

VIII

圖 6- 1、 細 胞 週 期 調 控 因 子 及 Check Point 示 意 圖 ... 41

圖 6- 2、 APC 對 於 Cyclin B 與 Securin 的 調 控 ... 42

圖 6- 3、 APC/Cdc20 與 APC/Cdh1 細 胞 週 期 的 活 性 分 析 圖 ... 42 圖 6- 4、 Securin 與 Ku 蛋 白 作 用 示 意 圖 ... 43 圖 6- 5、 Nucleosome 形 成 示 意 圖 ... 47 圖 6- 6、 與 Securin 作 用 蛋 白 網 絡 圖 ... 54

表 目 錄

表 4- 1、 PCR 用 量 表 ... 13 表 4- 2、 PCR 溫 度 時 間 定 表 ... 13

表 5- 1、 Far Western 中 與 securin 作 用 蛋 白 質 之 分 子 量 與 等 電 點 ... 23

表 5- 2、 免 疫 沉 澱 中 與 securin 作 用 蛋 白 質 之 分 子 量 與 等 電 點 . 27 表 6- 1、 已 知 與 securin 有 作 用 蛋 白 質 ... 37

IX

縮 寫 表

以 英 文 字 母 排 列

APC Anaphase promoting complex 細 胞 核 分 裂 後 期 促 進 錯 合 體 BCl2A1 BCl2 related protein A1 BCl 相 關 蛋 白 A1

Cdc14 Cell Division Cycle 14 細 胞 週 期 素 14 Cdc28 Cell Division Cycle 28 細 胞 週 期 素 28 Cdk1 Cyclin Dependent Kinase 1 細 胞 週 期 依 賴 激 酶 1 Cdk2 Cyclin Dependent Kinase 2 細 胞 週 期 依 賴 激 酶 2 CHO Chinese Hamster Ovary 中 國 倉 鼠 卵 巢 細 胞 CK1 Cytokeratin 1 細 胞 骨 架 蛋 白 K1 D box Destruction Box 降 解 序 列

DTT Dithiothreitol 2-4 二 硫 代 蘇 糖 醇 EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid 乙 烯 二 胺 四 乙 酸 IEF Isoelectro Focusing 等 電 膠 集 法 ITC Isothermal Titration Calorimetry 恆 溫 滴 定 熱 卡 計 MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption

Inoization

基 質 輔 助 雷 射 去 吸 附 離 子 化 PBF PTTG Binding Factor PTTG 結 合 因 子

PBS Phosphate Buffered Saline 磷 酸 鹽 緩 衝 液

PCAF p300/CBP Associated Factor P300/CBP 相 關 因 子 PCR Polymerase Chain Reaction 聚 合 酶 連 鎖 反 應 PTTG Pituitary Tumor Transforming Gene 腦 下 腺 腫 瘤 轉 型 基 因 PVDF Polyvinylidene Difluoride 聚 偏 二 氟 乙 烯 樹 脂

TBST Tris Buffered Saline with Tween 20 以 Tris 為 基 礎 含 有 Tween20 之 緩 衝 液

TCA Trichloacetic Acid 三 氯 醋 酸

1

第 一 章 緒 論

1-1 研 究 動 機

Securin 是 一 個 oncogene[1-3]，被 發 現 與 多 種 癌 症 密 切 相 關 [4-10]， 像 是 乳 癌[6]、 直 腸 癌 [11]、 肺 癌 [12]等 。 在 結 構 上 ， 學 者 們 陸 續 的 發 表 論 文 ， 認 為 securin 是 一 個 沒 有 特 定 構 型 的 蛋 白 質 。 Securin 目 前 的 研 究 顯 示，他 主 要 的 角 色 在 調 節 細 胞 週 期[13-15]及 修 復 DNA[16]，但 是 目 前 對 此 蛋 白 質 的 作 用 機 制 尚 未 有 全 面 性 的 了 解，所 以 我 們 希 望 能 將 分 子 系 統 學 的 概 念 加 入 securin 的 研 究 中，藉 由 建 立 與 securin 蛋 白 質 交 互 作 用 的 蛋 白 質 網 路 ， 使 能 更 全 面 性 的 了 解 securin 的 細 胞 分 子 調 節 機 制 ， 以 及 其 與 癌 症 之 間 的 關 聯 。

1-2 系 統 生 物 學 介 紹 ：

分 子 系 統 生 物 學 是 新 興 的 學 科，它 以 不 同 的 角 度 去 探 討 複 雜 的 生 物 體 內 分 子 作 用，傳 統 的 分 子 生 物 學 研 究 ， 都 是 觀 察 單 一 分 子 的 表 現 量 的 上 升 或 下 降 ， 即 判 定 生 理 反 應 走 向 哪 種 可 能 的 路 徑。然 而 生 物 體 中 分 子 反 應 路 徑 ， 牽 一 髮 而 動 全 身 ， 僅 藉 由 單 一 個 蛋 白 質 的 改 變 做 判 斷 ， 是 不 完 整 也 不 夠 嚴 謹 的 ，系 統 生 物 學 出 現 可 以 讓 此 問 題 豁 然 開 朗。分 子 系 統 生 物 學 將 蛋 白 質 之 間 的 作 用 系 統 化，在 大 量 的 篩 選 所 有 蛋 白 質 之 間 的 交 互 作 用 力 後[17,18]， 分 析 、 建 立 成 網 路 脈 絡 ， 藉 由 網 絡 圖 ， 我 們 可 以 更 全 面 性 的 了 解 各 個 蛋 白 質 的 角 色 。 目 前 分 子 系 統 生 物 學 多 是 地 毯 式 的 篩 選 不 同 蛋 白 質 之 間 的 作 用。有 別 於 此 ， 我 們 選 擇 securin 作 為 蛋 白 質 交 互 作 用 的 網 絡 中 心 。 Securin 蛋 白 質 在 腦 下 腺 腫 瘤[19]、 乳 癌 [6]、 直 腸 癌 [11]等 多 種 癌 症 細 胞 中 有 大 量 的 表 現。 相 較 於 傳 統 的 系 統 分 子 生 物 學 ， 選 用 一 個 具 有 標 的 性 的 蛋 白 質 做 為 網 絡 中 心 ， 可 以 更 快 速 的 探 討 這 些 重 要 蛋 白 對 生 命 體 的 角 色 ， 避 免 耗 費 大 量 的 時 間， 當 網 路 建 構 完 成 ， 我 們 便 可 以 利 用 不 同 的 交 互 作 用 體 (interactone)的 改 變 ， 去 探 討 securin 所 影 響 的 所 有 路 徑 ， 進 而 將 這 些 找 到 的 作 用 蛋 白 質 點 向 外 擴 張 ， 建 構 成 更 大 的 蛋 白 質 交 互 作 用 網 絡 。

1-3 Securin 蛋 白 質 介 紹 ：

1997 年 Pei 及 Melmed 等 人，發 現 老 鼠 的 腦 下 垂 體 細 胞 (pituitary tumor GH4 cells)中，某 個 基 因 大 量 表 現，且 將 此 基 因 轉 殖 到 裸 鼠 NIH3T3 細 胞

2

中 ， 三 個 禮 拜 內 會 誘 導 細 胞 轉 型(Transform)， 形 成 腫 瘤 ， 因 此 將 此 基 因 命 名 為 Pituitary Tumor Transforming Gene， 簡 稱 PTTG [19]。

2000 年 ， Chen 等 人 將 人 類 PTTG 的 同 源 基 因 辨 識 出 來 ， 發 現 人 類 的 PTTG 是 一 基 因 家 族[ 2 ]， 此 家 族 至 少 包 含 了 三 種 同 源 基 因 ， 分 別 是 PTTG1、 PTTG2、 PTTG3， 其 中 PTTG1 即 為 securin 。 繼 Pei 等 人 在 腦 下 垂 體 腫 瘤 發 現 其 大 量 表 現 後，Securin 不 論 是 mRNA 或 是 蛋 白 質 層 面， 都 被 發 現 在 不 同 的 腫 瘤 細 胞 或 癌 症 細 胞 有 大 量 的 表 現 ， 包 括 有 ： 卵 巢 癌 [5]、乳 癌 [6]、直 腸 癌 [11]、肺 癌 [20]等，都 被 發 現 其 securin 有 高 度 表 現 ， 且 研 究 指 出 securin 還 與 這 些 荷 爾 蒙 疾 病 的 侵 襲 力 有 關， 這 些 都 暗 示 了 securin 與 癌 症 形 成 及 細 胞 分 化 間 的 關 係 。 Securin 為 一 多 功 能 蛋 白 質 ， 在 很 多 生 理 反 應 路 徑 上 扮 演 調 節 的 功 能 ， 其 功 能 包 括 ： DNA 的 穩 定 [21]、 染 色 體 的 分 離 [22]以 及 細 胞 凋 亡 的 調 控[1]等 。 在 穩 定 DNA 的 機 制 中 ， securin 藉 由 與 Ku 蛋 白 相 互 作 用 抑 制 其 作 用 ， 但 是 在 遇 到 雙 股 DNA 斷 裂 時 候 會 將 Ku 蛋 白 釋 放 以 進 行 DNA 修 復 [23]。 securin 在 染 色 體 分 離 的 調 控 主 要 與 separase 蛋 白 質 相 關，securin 能 穩 定 separase 的 存 在，但 是 與 separase 的 結 合 卻 也 抑 制 其 活 化 ；separase 的 功 能 是 分 解 複 製 染 色 體 間 的 cohesin protein complex， 使 染 色 體 可 以 完 成 分 離 ， 由 此 可 知 securin 是 細 胞 週 期 的 把 關 者

[24-26]。 在 許 多 文 獻 中 指 出 ， 若 securin 的 基 因 被 去 除 掉 (knock out)， 細 胞 染 色 體 會 過 早 分 離 ， 導 致 染 色 體 變 異 ； 當 securin 過 度 表 現 ， 也 會 使 細 胞 的 增 生 受 到 影 響 。 Securin 於 最 近 被 認 為 是 一 個 無 特 定 構 形 的 蛋 白 質 [27]，無 特 定 構 形 的 蛋 白 質 通 常 是 多 功 能 的、扮 演 調 節 角 色 的，而 securin 如 上 面 所 敘 述 ， 的 確 參 與 了 許 多 不 同 的 調 控 機 制，本 實 驗 室 也 經 由 多 項 蛋 白 質 特 性 的 測 量 ， 確 定 了 securin 的 確 為 無 特 定 構 形 的 蛋 白 質 。 另 外 ， Securin 在 酵 母 菌 中 的 同 源 蛋 白 質 ： 出 芽 酵 母(budding yeast)中 的 Pds1、 融 合 酵 母 中 (fission yeast)的 Cut2， 已 被 認 為 與 Securin 有 相 同 的 作 用 [7]， 所 以 很 多 研 究 者 利 用 酵 母 菌 系 統 研 究 securin 的 作 用 機 制 [27,28]。

1 - 3 . 1 S e c u r i n 結 構

3

扮 演 不 同 的 功 能 ，N 端 是 『 細 胞 核 分 裂 後 期 促 進 複 合 體 』 ( Anaphase promoting complex， 簡 稱 APC ) 辨 認 的 位 置 ， 與 Securin 分 解 的 有 重 要 關 係 ，APC 辨 認 蛋 白 後 會 將 其 以 ubiquitin 標 定 ， 使 走 向 分 解 路 徑 。 C 端 則 為 與 Separase 結 合 的 片 段，透 過 此 結 合 會 抑 制 Separase 作 用。另 外 在 Securin 接 近 C 端 (163-172)的 位 置 為 一 proline-rich 的 序 列 ， 是 SH3 的 結 合 位 置 [28]， SH3 是 常 見 的 細 胞 訊 息 傳 遞 蛋 白 質 ， 所 以 由 securin 的 一 級 結 構 可 以 知 道 securin 可 能 與 訊 息 傳 遞 有 關 。 N

Separase inhibition

_C

APC recognition

KEN

D-box

0

202

163 170

PXXP PXXP 圖 1-1、 Securin 結 構 示 意 圖 N 端 為 APC 複 合 體 辨 認 位 置 ， 包 括 D-box(序 列 為 RxxLxxxxN)及 KEN-box(序 列 為 K-E-N-x-x-x-D/N)，C 端 則 為 Separase 辨 認 位 置 。

1 - 3 . 2 S e c u r i n 功 能

Securin 最 為 人 所 知 的，就 是 其 與 細 胞 分 裂 之 間 的 關 係，它 也 是 細 胞 週 期 的 監 控 者[24]。Securin 可 藉 由 與 separase 的 結 合 抑 制 separase 活 性 [22]， 如 下 圖 所 示 ， 在 細 胞 分 裂 前 期 ，securin 是 與 separase 結 合 的 ， 此 一 複 合 體 會 防 止 細 胞 進 入 anaphase， 而 securin 的 降 解 是 由 APC/cyclosome

(APC/Cc d c 2 0)所 調 控 ， 此 複 合 體 會 辨 認 securin 上 的 D-box(序 列 為

RxxLxxxxN)，而 將 securin 以 ubiquitin 標 定，進 而 降 解。當 securin 與 separase 分 離 之 後 ，separase 會 被 去 磷 酸 化 而 成 為 活 化 態 ， 活 化 的 separase 會 將 cohensin protein 分 解，此 時 染 色 質 就 可 以 分 開，使 細 胞 進 入 Anaphase[29]。

4

Nucleus

p

separase

p

separase

phosphatase

separase

securin

C ohe ns in de gra da tion

Active

Securin degradation

圖 1-2、 Securin 調 節 Separase 示 意 圖

Securin 會 與 磷 酸 化 的 separase 結 合 ， 一 旦 secu rin 經 由 APC 複 合

體 標 定 進 而 分 解 ，separase 會 去 磷 酸 化 成 為 有 活 性 狀 態 ， 此 時 便 可

分 解 coh ensin co mp lex (圖 中 黃 色 圓 形 處 )， 使 染 色 質 得 以 分 裂 。

Securin 也 與 DNA 修 復 有 關 ， 其 與 Ku70/K80 複 合 體 會 直 接 作 用 [23]， 但 是 當 DNA 遇 到 雙 股 斷 裂 的 時 候 ， securin 會 將 此 複 合 體 釋 放 出 來 ， 進 行 DNA 修 復 的 功 能 。 除 此 之 外 ， securin 也 跟 細 胞 週 期 有 著 密 切 的 關 係 ， 在 2000 年 Francisco 等 人 的 研 究 中 發 現 [30]， securin 在 不 同 的 細 胞 週 期 phase 有 不 同 的 表 現 量 ， 由 G1/S、 S 至 G2/M， securin 的 表 現 量 是 依 序 遞 增 的 ， 這 也 顯 示 了 securin 和 細 胞 週 期 的 調 控 有 關 。 1 - 3 . 3 細 胞 週 期 與 癌 症 細 胞 週 期 與 癌 症 最 早 在 生 物 科 學 的 研 究 上 是 獨 立 的 課 題 ， 但 是 隨 著 這 兩 個 領 域 的 研 究 發 現 日 益 增 加 ， 之 間 關 係 的 重 疊 也 愈 見 明 顯 。 在 正 常 情 況 下 ， 細 胞 週 期 控 制 細 胞 以 一 定 的 速 度 增 生 ， 癌 症 則 是 由 於 細 胞 週 期 的 調 節 失 去 控 制，對 於 黏 附 細 胞(adhere cell)之 間 的 感 應 靈 敏 度 也 大 量 的 降 低 ， 使 癌 細 胞 得 以 大 量 且 密 集 的 增 生[31]。 細 胞 週 期 的 調 控 機 制 可 以 分 為 兩 大 類，一 是 利 用 一 連 串 的 磷 酸 化/去 磷 酸 化 的 反 應 達 成 目 的，其 二 是 check point 的 控 制 [31]。 第 一 部 分 的 調 控 ， 主 要 藉 由 cyclin 及 其

5 cyclin-dependent kinase(CDK)形 成 具 有 活 性 的 複 合 體 ， 來 調 控 各 種 與 細 胞 週 期 調 控 有 關 的 因 子 。 另 一 部 分 是 check point 的 調 節， 在 細 胞 週 期 的 進 行 過 程 中 ， 有 一 些 重 要 的 事 件 是 必 需 的 ， 像 是 DNA 複 製 的 完 成 ， 染 色 體 分 離 完 成 ， 才 可 使 細 胞 進 行 到 下 一 個 週 期 ， 若 細 胞 沒 有 複 製 完 成 或 是 DNA 受 到 損 害 ， 就 會 使 細 胞 週 期 延 誤 。 Securin 與 細 胞 週 期 調 控 之 間 的 關 係 可 能 同 時 透 過 這 兩 種 機 制 ， 因 為 securin 不 但 透 過 與 separase 的 結 合 來 調 節 細 胞 分 裂 ， 且 securin 蛋 白 質 本 身 也 受 到 磷 酸 化 及 去 磷 酸 化 的 調 控。在 2002 年 Ritu 及 Orna 的 研 究 發 現 ，securin 為 Cdc28(人 類 Cdk2 的 同 源 蛋 白 質 ) 的 受 質 ， 會 被 其 磷 酸 化 ， 磷 酸 化 的 Securin 與 Separase 之 間 的 作 用 具 有 較 高 的 效 力 ， 且 會 促 進 separase 的 定 位 (localization) [13]。 Securin 的 去 磷 酸 化 則 關 係 到 此 蛋 白 質 的 分 解，Cdk1 及 Cdc14 參 與 了 Securin 的 去 磷 酸 化 作 用，一 旦 securin 的 磷 酸 消 失 ， 被 ubiquitin 標 定 的 比 例 會 增 加 許 多，標 定 後 的 蛋 白 質 將 走 向 被 分 解 的 路 徑[32]。 1 - 3 . 4 s e c u r i n 的 其 他 功 能 Securin 近 年 來 也 被 發 現 與 血 管 增 生 相 關 [33]， 這 與 securin 是 oncogene 的 角 色 是 相 呼 應 的 ， 因 為 對 於 癌 細 胞 來 說 ， 血 管 增 生 是 必 須 的 ， 因 為 癌 細 胞 需 要 大 量 快 速 的 增 生 ， 所 以 必 須 要 大 量 的 新 生 血 管 ， 才 可 以 得 到 足 夠 的 養 分 ， 因 此 在 標 靶 治 療 的 研 究 中 ， 也 常 常 針 對 血 管 新 生 的 標 靶 基 因 著 手 ， 希 望 能 透 過 破 壞 血 管 新 生 的 機 制 ， 抑 制 或 破 壞 癌 細 胞 的 生 長 。

1-4 A549 及 U937

securin 不 僅 與 腫 瘤 及 癌 症 高 度 相 關 ， 在 快 速 增 生 的 細 胞 ， 如 T 細 胞 ， 也 有 大 量 的 表 現 ， 所 以 在 篩 選 與 其 有 作 用 的 蛋 白 質 時 ， 我 們 分 別 使 用 了 肺 線 癌 細 胞 A549 及 快 速 增 生 的 U937 細 胞 ， 做 為 研 究 的 主 要 材 料 。A549 全 名 為 人 類 肺 腺 癌 內 皮 細 胞 (Human lung adenocarcinoma epithelial cell line)，此 細 胞 源 自 1982 年 一 位 58 歲 的 男 性 白 種 人 的 肺 腺 癌 內 皮 細 胞[34,35]。 U937 則 屬 於 淋 巴 細 胞 (diffuse hislytic lymphoma cell)， 取 自 1974 年 一 位 37 歲 男 性 胸 膜 組 織 ， 有 明 顯 單 核 細 胞 型 態 ， 透 過 藥 物 驅 動 可 使 其 出 現 巨 噬 細 胞 特 徵[36]。

6

1 - 4 . 1 s e c u r i n 在 不 同 細 胞 的 表 現 量

Securin 會 表 現 在 正 常 成 人 的 睪 丸、結 腸、小 腸、肺 以 及 胎 兒 的 肝[ 3 ]， 但 是 在 各 種 癌 細 胞 內 其 mRNA 及 蛋 白 質 的 表 現 量 會 特 別 的 高，在 目 前 的 研 究 中 ， 以 大 腸 直 腸 癌 的 表 現 量 最 高[11]。 在 本 篇 論 文 中 ， 我 們 也 利 用 Western 辨 識 A549、CHO 及 U937 三 種 細 胞 的 securin 含 量，發 現 在 U937 中 ，securin 蛋 白 質 的 含 量 的 確 是 較 高 的 。

7

第 二 章 實 驗 策 略

本 實 驗 在 建 構 與 securin 有 作 用 的 蛋 白 質 網 絡 ， 透 過 網 絡 希 望 能 將 securin 的 功 能 及 作 用 機 制 了 解 得 更 透 徹 ， 所 以 我 們 搜 尋 文 獻 ， 將 前 人 所 、 已 知 與 securin 作 用 的 蛋 白 質 篩 選 出 來， 同 時 也 分 別 利 用 In vivo 及 In vitro 的 方 式 找 出 更 多 與 securin 作 用 的 蛋 白 質 ， 最 後 建 構 成 網 絡 ， 進 一 步 分 析 securin 功 能 及 可 能 作 用 機 制 。 PCAF PP2A PCAF securin P53 PBF Cdc20 Ku70 separase S10 HSJ2 Cdc2 Cdc14 篩 選 與 securin 有 交 互 作 用 的 蛋 白 質 文 獻 搜 尋 免 疫 沉 澱 遠 西 方 墨 點 法 酵 母 菌 雙 雜 交 系 統 建 立 與 securin 作 用 蛋 白 的 作 用 網 絡 針 對 securin 功 能 做 進 一 步 的 探 討

8

第 三 章 實 驗 原 理

3-1 蛋 白 質 securin 製 備

近 年 來 隨 著 生 物 科 技 發 展 快 速 ， 將 特 定 基 因 送 到 為 生 物 體 內 大 量 複 製 已 是 常 見 的 方 法 ， 我 們 將 PTTG1 的 基 因 送 到 pET200 載 體 中 ， 再 送 入 大 腸 桿 菌 BL21(DE3)，培 養 至 OD 值 為 0.6 時，加 入 IPTG 誘 導 此 蛋 白 質 的 表 現 ， 大 量 產 生 securin 蛋 白 質 ， 最 後 形 成 內 涵 體 (Inclusion body)。 內 涵 體 為 錯 誤 折 疊 結 構 的 蛋 白 質 聚 集 而 成 ， 而 功 能 又 與 其 結 構 息 息 相 關 ， 我 們 使 用 本 實 驗 室 的 折 疊 方 式[39]， 得 到 純 度 高 且 自 然 態 的 蛋 白 質 。 為 了 要 讓 蛋 白 質 摺 疊 恢 復 活 性 ， 我 們 首 先 以 變 性 劑 溶 解 內 涵 體 ， 此 過 程 稱 為 「 變 性 」， 變 性 作 用 主 要 在 破 壞 蛋 白 質 的 三 級 結 構(主 要 為 疏 水 作 用 力)及 二 級 結 構 (氫 鍵 )， 此 狀 態 下 的 蛋 白 質 僅 擁 有 一 級 結 構 ， 並 無 生 物 活 性 。 在 重 新 折 疊 的 過 程 中 ， 我 們 使 用 透 析 的 方 式 ， 將 溶 於 變 性 劑 的 蛋 白 質 置 於 透 析 膜 內 ， 膜 外 則 是 大 量 的 復 性 溶 液 ， 藉 由 內 外 離 子 濃 度 的 不 同 ， 溶 液 內 離 子 會 自 由 運 動 而 達 到 平 衡 ， 進 而 達 到 使 變 性 劑 濃 度 降 低 的 目 的 。 因 透 析 的 過 程 緩 慢，本 實 驗 室 改 良 了 一 般 透 析 的 方 式，利 用 多 次 的 溶 液 置 換， 使 蛋 白 質 在 透 析 的 過 程 中 近 乎 靜 止 ， 因 此 我 們 稱 之 準 靜 態 熱 平 衡 透 析 法 [37]。

3-2 Far Western

Far Western 最 早 作 為 篩 選 蛋 白 質 表 現 的 方 法 (cite)， 但 是 近 年 來 已 被 大 量 用 在 蛋 白 質 之 間 交 互 作 用 的 確 認 ， 諾 貝 爾 獎 得 主 Roger D. Kornberg， 也 曾 用 此 方 法 證 明 許 多 轉 錄 因 子 之 間 的 交 互 作 用[38]。 此 方 法 的 優 點 可 以 充 分 的 研 究 蛋 白 質 後 修 飾 作 用 與 蛋 白 質 之 間 作 用 力。Far Western 的 原 理 與 Western 非 常 相 似 ， 不 同 的 是 ， 在 Western 中， 我 們 使 用 一 級 抗 體 去 辨 認 蛋 白 質 ， 而 在 Far Western 中 ， 我 們 使 用 的 是 可 能 與 其 有 交 互 作 用 的 蛋 白 質 (bait protein)， 再 使 用 此 蛋 白 質 (bait protein)的 一 級 抗 體 、 二 級 抗 體 使 有 作 用 的 蛋 白 質 呈 色 。

Far Western 的 標 準 流 程 ：

一 般 Far Western 多 以 Native Gel 來 進 行 實 驗 ， 希 望 能 保 持 蛋 白 質 原 有 的 結 構，確 保 蛋 白 質 之 間 的 作 用 力 仍 有 效。但 是 Native Gel 無 法 添 加 SDS 及 還 原 劑 ， 所 以 解 析 度 相 對 較 差 。 因 此 實 驗 室 將 傳 統 的 Far western 做 一 些 修 飾 ： 我 們 仍 以 一 般 SDS PAGE 的 方 式 分 離 蛋 白 質 、 將 膠 體 上 的 蛋 白 質

9

轉 到 膜 上 ， 但 是 接 著 利 用 實 驗 室 準 靜 態 透 析 法 的 方 式 ， 將 膜 上 蛋 白 質 折 疊 至 自 然 態 ， 接 著 與 蛋 白 質(bait protein)培 養 、 蛋 白 質 (bait protein)的 一 級 抗 體 、 二 級 抗 體 培 養 及 呈 色 ， 就 可 以 得 到 與 特 定 蛋 白 質 作 用 的 蛋 白 質 。 Light S S S S HRP HRP An ti -S An ti -S 圖 3- 1 、 Far Western 實 驗 原 理

3-3 免 疫 沉 澱 ( Immunoprecipitation )

免 疫 沉 澱 發 展 ： 免 疫 沉 澱 是 測 定 蛋 白 質 之 間 交 互 作 用 常 用 的 方 式 ， 實 驗 的 原 理 是 在 細 胞 裂 解 蛋 白 質(Lysis proteins)溶 液 中 加 入 目 標 蛋 白 質 (若 裂 解 蛋 白 中 已 有 目 標 蛋 白 可 不 必 額 外 添 加)， 再 依 序 加 入 目 標 蛋 白 質 的 抗 體 及 接 有 G 蛋 白 /A 蛋 白 的 Sepharose 作 培 養 ， 若 眾 多 的 裂 解 蛋 白 中 有 與 目 標 蛋 白 作 用 者 ， 便 會 與 目 標 蛋 白、其 一 級 抗 體、A/G-Sepharose 形 成 複 合 體，經 過 離 心 後 得 到 的 沉 澱 再 以 電 泳 方 式 分 離 ， 即 可 得 知 與 目 標 蛋 白 質 作 用 的 其 他 蛋 白 質 。 1 .將 膠 體 上 蛋 白 質 轉 漬 到 膜 上 2 .使 用 準 靜 態 熱 平 衡 透 析 法 將 膜 上 蛋 白 質 摺 疊 至 自 然 態 3 .將 轉 漬 模 與 待 測 蛋 白 質 搖 晃 培 養 4 .再 與 待 測 蛋 白 質 之 一 級 抗 體 、 二 級 抗 體 培 養 後 ， 使 用 HRP 受 質 使 呈 色 5 .能 與 待 測 蛋 白 質 作 用 者 ， 即 會 在 底 片 上 呈 色

10 圖 3- 2、 免 疫 沉 澱 原 理 示 意 圖 各 色 圓 圈 狀( )代 表 不 同 蛋 白 質 ， 假 設 藍 色 ( )與 綠 色 ( ) 會 與 橙 色( )作 用 ， 所 以 在 培 養 過 後 會 與 橙 色 ( )蛋 白 作 用 ， 再 加 入 呈 色 蛋 白 之 一 級 抗 體( )及 sephorse( ) 後 離 心，即 可 得 到 整 個 複 合 體 。

3-4 恆 溫 滴 定 微 卡 洛 里 計 (Isothermo Titration

Calorimetry， ITC)

恆 溫 滴 定 微 卡 洛 里 計 可 以 測 量 微 量 的 反 應 熱 ， 而 分 子 之 間 的 結 合 或 解 離 常 伴 隨 著 吸 熱 或 放 熱 ， 因 此 恆 溫 滴 定 微 卡 洛 里 計 是 測 量 分 子 之 間 作 用 很 好 的 生 物 物 理 技 術[ 3 9 ]。 此 卡 計 可 分 為 三 類 ：1.絕 熱 式 (adiabatic) 2.熱 傳 導 式 3.補 償 式 。 我 們 所 使 用 的 是 熱 傳 導 式 ： 反 應 槽 溫 度 變 化 時 ， 會 與 外 部 恆 溫 水 槽 產 生 即 時 的 熱 交 換 ， 當 熱 通 過 熱 電 偶 時 ， 會 產 生 電 位 差 ， 即 可 推 算 出 能 量 的 變 化 。 本 實 驗 所 使 用 之 恆 溫 滴 定 為 卡 洛 里 計 為 Thermometric 公 司 製 造 ， 型 號 為 2277(Thermometriv, Jarfalla, Sweden)。

11

圖 3- 3、 ITC 結 構 示 意 圖

其 中 reference cell 置 放 蛋 白 質 的 溶 劑 ， samp le cell 置 放 被 滴 定 的

蛋 白 質 溶 液，用 來 滴 定 的 另 一 蛋 白 質 溶 液 則 由 ＂Lig an d inj ectio n＂

處 伸 入 至 cell 上 方 ， 待 儀 器 平 衡 後 進 行 滴 定 。

3-5 二 維 電 泳 ( Two-Dimensional Gel Electrophoresis )

二 維 膠 體 電 泳 是 一 維 膠 體 電 泳 的 擴 增 ， 一 維 電 泳 主 要 是 靠 蛋 白 質 的 分 子 量 作 為 分 離 的 依 據 ， 二 維 電 泳 則 是 多 了 依 其 等 電 點 分 離 ( isoelectric point ) 的 步 驟 ， 此 步 驟 稱 為 等 電 聚 焦 ( isoelectric focusing )簡 稱 IEF。 當 pH 值 不 等 於 蛋 白 質 的 等 電 點 時，蛋 白 質 會 帶 有 正 或 負 的 靜 電 荷，若 靜 電 荷 是 負 的 ， 則 蛋 白 質 會 往 正 極 移 動 ， 反 之 則 往 負 極 移 動 ， 直 到 pH=pI 為 止 。 因 此 在 膠 體 上 的 蛋 白 質 會 呈 現 梯 度 pH 的 分 布 。

3-6 Yeast Two Hybrid

本 實 驗 使 用 CytoTrap Vector Kit， 此 系 統 中 使 用 cdc25H 酵 母 菌 (S.

c e re v i si a e)， 此 菌 株 中 cdc25 基 因 的 第 1328 個 胺 基 酸 受 到 突 變 ， 不 能 啟 動

Ras 訊 息 傳 遞 路 徑 ， 因 此 無 法 在 37oC 存 活 。 系 統 中 主 要 使 用 兩 種 載 體 ， 分 別 是 pSOS、 pMyr， cDNA Library 被 建 構 在 pMyr 載 體 中 ， Securin DNA 片 段 則 插 入 pSOS 載 體 中 。 若 兩 個 載 體 產 生 的 蛋 白 質 之 間 有 交 互 作 用 ， 則 hSos 會 被 帶 到 細 胞 膜 表 面 ， 活 化 Ras 訊 號 傳 遞 路 徑 ， 使 cdc25H 菌 株 能 夠 在 37oC 存 活 。

12

圖 3- 4、 Yeast Two Hybrid- CytoTrapsystem

圖 上 方 為 此 系 統 中 主 要 的 兩 種 載 體 ( v e c t o r ) ， p S o s 質 體 將 會 接 上 待 測 蛋 白 之 基 因 序 列 ( s e c u r i n ) ， c D N A 的 基 因 序 列 則 隨 機 的 接 上 p M y r 質 體 中 。 將 建 構 好 的 兩 種 載 體 轉 殖 ( t r a n s f o r m ) 到 酵 母 菌 當 中，若 有 蛋 白 質 與 待 測 蛋 白 質 ( s e c u r i n ) 作 用，則 p M y r 基 因 序 列 會 將 h S o s 蛋 白 質 帶 到 細 胞 膜 表 面 ， 進 行 R a s 路 徑 ， 使 酵 母 菌 得 以 在 3 7 o C 的 環 境 下 生 長 。 若 蛋 白 質 之 間 沒 有 交 互 作 用 ， 則 酵 母 菌 僅 能 存 活 於 2 5 o C 的 環 境 。

13

第 四 章 實 驗 材 料 及 方 法

4-1 Securin 基 因 鑑 定

(1) 實 驗 中 使 用 本 實 驗 室 建 構 之 pET200-securin 之 質 體 ， 轉 殖 到 大 腸 桿 菌 BL21(DE3)品 系 ， 基 因 序 列 及 胺 基 酸 序 列 如 附 錄 一 。

(2) 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 使 用 本 實 驗 室 設 計 之 Securin 引 子 (primers)

Forward primer 5’-CATAT GGCTACTCTGATCTATGTT-3’

Reverse primer 5’-ATTTAAATATCTATGTCACAGCA-3’

(3) 將 表 4-1 所 列 樣 品 依 序 加 入 混 合 均 勻 後 ， 以 牙 籤 挑 選 菌 落 加 入 ， 再 依 照 表 4-2 設 定 進 行 反 應 ， 反 應 完 成 後 將 產 物 以 1.5% Agarose 膠 做 確 認 。

4-2 Securin 蛋 白 質 製 備

(1) 以 IPTG 誘 導 細 胞 大 量 產 生 Securin 蛋 白 質 解 凍 含 有 pET200securin 的 BL21(DE3)菌 種 ， 取 出 適 當 體 積 加 入 3 ml 的 LB(含 20ng/mL Knamycin)， 於 37oC/200rpm 震 盪 培 養 至 隔 天 使 菌 種 活 化。取 活 化 菌 種 250 μL 加 入 250 mL LB(含 20ng/mL Knamycin)，37 oC 震 盪 培 養 四 小 時 後 加 入 IPTG， 使 IPTG 最 終 濃 度 為 1mM， 持 續 震 盪 培 養 16 小 時 。 將 培 養 完 成 菌 液 以 4 oC /9000 rpm 離 心 得 到 沉 澱 的 菌 體 ， 將 菌 體 以 1mL 回 溶，放 入 破 菌 機 (constant cell disruption system)，以 30 kpsi 高 壓 使 菌 體 破 碎 。 將 破 碎 菌 液 以 11000 rpm 離 心 ， 得 到 沉 澱 物 即 為 10x Sample Buffer 5 μL 10uM dNTP 1 μL Forward primer 1 μL Reverse primer 1 μL ddH20 41 μL Pro-taq polymerase 1 μL 溫 度 時 間 循 環 數 94oC 1 分 鐘 1 94 oC 30 秒 50 oC 30 秒 72 oC 30 秒 30 72 oC 3 分 鐘 1 表 4- 2、PCR 溫 度 時 間 定 表 表 4- 1PCR 用 量 表

14 內 涵 體 (Inclusion body)， 持 續 以 二 次 去 離 子 水 回 溶 、 離 心 、 去 除 上 清 液 ， 使 內 涵 體 純 度 提 高 ， 清 洗 至 上 清 液 完 全 澄 清 。 (2) 蛋 白 質 摺 疊 本 方 法 係 由 本 實 驗 室 所 開 發[37]。 養 菌 得 到 的 蛋 白 質 位 於 內 涵 體 中 ， 此 蛋 白 質 相 互 堆 疊 且 失 去 功 能 的，所 以 需 利 用 重 新 摺 疊 方 式 將 蛋 白 質 摺 疊 至 自 然 態 。 首 先 加 入 高 濃 度 的 尿 素(4.5M urea、 pH = 11)的 變 性 溶 劑 ， 使 用 磁 石 轉 動 子 於 4oC 攪 拌 12 小 時 左 右 ， 使 蛋 白 質 充 分 變 性 溶 解 。 溶 解 完 全 的 蛋 白 質 使 用 0.2μmPVDF 膜 過 濾 後 ，裝 入 事 先 處 理 過 的 透 析 模 (將 0.1M EDTA 煮 沸 後 放 入 透 析 膜 煮 五 分 鐘 去 除 金 屬 離 子，再 以 二 次 去 離 子 水 沖 洗 透 析 模 ， 除 去 多 餘 的 EDTA。 )， 將 透 析 袋 放 入 250mL 的 R1 緩 衝 液 中 ， 於 4oC 透 析 24 小 時 後 ， 置 換 新 的 R1 緩 衝 液 透 析 24 小 ， 然 後 置 換 於 R2 緩 衝 液 透 析 12 小 時 ， 依 此 類 推 ， 依 序 透 析 至 R5， 將 變 性 劑 濃 度 降 低 ， 使 蛋 白 質 逐 漸 回 到 自 然 態 ， 詳 細 緩 衝 液 內 含 物 及 透 析 時 間 如 附 錄 一 所 示 。

4-3 西 方 墨 點 法 (Western Blot)

我 們 使 用 西 方 墨 點 法 來 確 認 大 量 生 產 的 蛋 白 質 是 否 為 Securin。首 先 使 用 15% SDS PAGE 分 離 蛋 白 質 ， 接 著 使 用 半 乾 式 轉 漬 槽 (Semi-dry transfer system)將 膠 體 上 的 蛋 白 質 轉 到 PVDF 材 質 上，將 轉 漬 膜 置 於 脫 脂 奶 溶 液 中 (蛋 白 質 含 量 5 %，容 於 TBST 緩 衝 液 )，以 降 低 之 後 抗 體 的 非 專 一 性 反 應 ； 轉 漬 膜 浸 泡 於 牛 奶 溶 液 30 分 鐘 後 ， 改 浸 泡 於 稀 釋 1/3500 的 Mouse

Anti-Securin 一 級 抗 體 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat No. SC56461)， 2 小 時 後 使 用 TBST 緩 衝 液 清 洗 四 次 ， 每 次 5 分 鐘 ， 接 著 將 轉 漬 膜 浸 泡 於 稀 釋 1/10000 的 二 級 抗 體 (goat anti-mouse IgG-HRP)培 養 1 小 時 ， 再 使 用 TBST 緩 衝 液 清 洗 四 次 ， 每 次 五 分 鐘 。 整 個 轉 漬 膜 與 抗 體 的 培 養 過 程 結 束 後 ， 添 加 HRP 受 質 (Millipore Corporation Cat No. WBKL S0500 )於 轉 漬 膜 上 ， 以 底 片 呈 色 。

4-4 二 維 電 泳 及 遠 西 方 墨 點 法

在 遠 西 方 墨 點 法 (Far Western)中 ， 我 們 使 用 二 維 電 泳 來 分 離 蛋 白 質 ， 二 維 電 泳 的 操 作 可 分 下 列 幾 項 說 明 ：

15

(1) 樣 品 製 備

細 胞 裂 解 (Cell Lysis)： 將 回 溶 於 200 μL 的 細 胞 裂 解 緩 衝 液 (Cell Lysis Buffer-附 錄 一 )， 將 細 胞 置 入 液 態 氮 30 秒 後 置 於 室 溫 水 中 ， 重 複 三 次 以 上 ， 於 4oC 離 心 10 分 鐘 。

蛋 白 質 沉 澱 ： 取 上 述 上 清 液 加 入 預 冷 之 Trichloroacetic acid (簡 稱 TCA) 置 於-20oC 冰 箱 中 1 小 時 ， 使 蛋 白 質 充 分 沉 澱 ， 樣 品 與 TCA 比 例 為 4： 1。 1 小 時 候 將 樣 品 於 4oC 離 心 10 分 鐘 ， 沉 澱 物 即 為 蛋 白 質 。

蛋 白 質 處 理 及 定 量：以 TCA 沉 澱 的 蛋 白 質 經 過 離 心 後 需 以 丙 酮 (Acetone) 清 洗 後 離 心 ， 重 複 三 次 ， 以 降 低 TCA 對 之 後 二 維 電 泳 的 影 響 。 最 後 沉 澱 的 蛋 白 質 回 溶 於 水 合 緩 衝 液(Rehydration Buffer-附 錄 一 )，以 Bradford 定 量 試 劑 定 蛋 白 質 的 濃 度 。

(2) 一 維 電 泳 (依 等 電 點 分 離 蛋 白 質 )

我 們 使 用 13 公 分 的 IEF Strip(GE Healthcare Immobilized Dry Strip ， pH=3-10 Nonlinear )， 其 所 需 添 加 的 溶 液 體 積 為 250μL。 在 這 體 積 內 添 加 DTT 使 其 最 後 濃 度 為 2.8mg/ml， 蛋 白 質 的 量 在 30-60 μg， 另 加 入 1-2 μL Bromophenol blue 做 為 指 示 劑，最 後 以 二 次 去 離 子 水 將 體 積 補 滿 250 μL， 將 溶 液 混 合 均 勻 後 吸 取 放 入 Strip Holder， 再 以 IEF Strip 覆 蓋 ， 置 於 一 維 電 泳 機 器 上 ， 機 器 設 定 如 附 錄 一 。

(3) Tricine gel

Tricine Gel 有 助 於 分 析 分 子 量 較 小 的 蛋 白 質，因 此 我 們 採 用 Tricine SDS PAGE 取 代 一 般 的 SDS PAGE。 膠 體 製 作 方 法 如 附 錄 二 ， 將 表 中 所 列 物 質 混 合 均 勻 後 抽 真 空 15 分 鐘，再 加 入 150μL APS 及 30μL TEMED， 稍 微 搖 晃 均 勻 後 注 入 0.75 mm 的 電 泳 膠 隔 板 中，液 體 加 至 離 頂 端 一 公 分 處 停 止， 加 入 二 次 去 離 子 水 壓 平 膠 體 ，得 10% Tricine Gel。Tricine 最 重 要 的 是 其 內 外 使 用 不 同 配 方 的 緩 衝 液 ， 分 別 是 Cathod Buffer 及 Anode Buffer。

(4) 二 維 電 泳 ( 依 分 子 量 大 小 分 離 蛋 白 質 )

一 維 電 泳 完 成 後 ， 首 先 將 電 泳 膠 條 放 入 含 有 50mg/5ml DTT 的 平 衡 液 震 盪 20 分 鐘 ， 使 蛋 白 質 之 間 雙 硫 鍵 結 完 全 打 開 ， 後 將 膠 條 移 至 含 有 125mg/5ml IAA 的 平 衡 液 震 盪 20 分 鐘 ， 避 免 雙 硫 鍵 重 新 形 成 。 處 理 完 膠 條 放 入 做 完 的 Tricine Gel 上 方 ， 與 Tricine Gel 相 接 觸 ， 加 入 含 有 指 示 劑(Bromophenol blue)之 Agarose 以 固 定 膠 條。將 電 泳 膠 接 上 電 源 後 ，

16

先 以 10 mA/片 跑 約 15 分 鐘 ， 當 藍 色 指 示 劑 跑 至 Tricine Gel， 將 電 流 調 快 至 20 mA/片 。

(5) Far Western

使 用 一 樣 的 條 件 跑 三 張 二 維 電 泳 的 膠 片 ， 其 中 一 張 銀 染 呈 色 ， 另 兩 張 則 轉 漬 到 PVDF 膜 上。兩 張 轉 漬 膜 分 別 做 Far Western 及 Western(對 照 組 )， 轉 漬 膜 與 溶 液 培 養 的 順 序 、 時 間 如 附 錄 三 。

4-5 免 疫 沉 澱

(1) 細 胞 裂 解 免 疫 沉 澱 的 細 胞 裂 解 步 驟 中 ， 為 避 免 清 潔 劑 干 擾 後 續 實 驗 ， 所 以 不 添 加 任 何 清 潔 劑 。 實 驗 使 用 5x107 個 u937 細 胞 ， 離 心 後 用 預 冷 的 PBS 回 溶 ， 重 複 操 作 兩 次 ， 加 入 Lysis Buffer， 用 超 音 波 破 菌 器 震 盪 2 分 鐘 後 離 心 ， 取 其 上 清 液 。 (2) 預 洗 (preclear) 加 入 3μL Sepharose-G 於 4oC 震 盪 25 分 鐘，若 蛋 白 質 本 身 與 Sepharose-G 有 直 接 作 用 ， 可 在 此 步 驟 中 預 先 剔 除 。 (3) 與 Securin 蛋 白 質 、 抗 體 培 養 將 預 洗 的 細 胞 裂 解 蛋 白 離 心 ， 取 上 清 液 加 入 Securin 蛋 白 質 ， 使 其 最 後 濃 度 為 2 μg/mL， 震 盪 培 養 50 分 鐘 ， 再 加 入 Securin 一 級 抗 體 (1/200)， 震 盪 培 養 50 分 鐘 後 ， 加 入 Sepharose 震 盪 培 養 14 小 時 。 (4) 清 洗 為 避 免 特 定 蛋 白 質 因 表 現 量 較 高 殘 留 於 Sepharose G 上，使 用 PBS 清 洗、 離 心 ， 重 複 三 次 ， 最 後 沉 澱 物 即 為 免 疫 沉 澱 產 物 。

4-6 MALDI-TOF Mass

(1a) 切 下 膠 体 及 清 洗 - Coomassie blue 染

1.以 小 刀 切 下 膠 体 中 欲 分 析 的 斑 點 ， 所 切 的 大 小 約 為 1~2 mm3。 2.將 切 下 的 膠 体 置 於 1.5mL 的 eppendorf。 3.加 入 100μ L 純 水 ， 將 切 下 的 膠 体 以 純 水 清 洗 二 次 (置 於 超 音 波 震 盪 10min)。 4.離 心 後 ， 小 心 移 去 清 洗 液 並 取 出 丟 棄 。 5.加 入 50μ L 的 50mM 之 NH4HCO3/ACN 1:1(v/v)（【 註 】 將 50mM 之

17

NH4HCO3 以 ACN 配 製 1:1 溶 液 ） 振 盪 15min 後 ， 離 心 取 出 上 層 液 丟 棄 。 6.加 入 可 覆 蓋 住 膠 體 量 (約 25ul)的 ACN 收 縮 ， 之 後 取 出 ACN。

7.加 入 25μ L 之 50mM NH4HCO3， 將 其 rehydrate。 8.加 入 適 量 的 ACN 以 覆 蓋 膠 体 ， 當 膠 体 收 縮 聚 在 一 起 後 取 出 ACN。 9.以 speedvac 抽 乾 膠 体 (約 10min)。 (1b) 切 下 膠 体 及 清 洗 -銀 染 1. 用 水 洗 兩 次 gel 。 2. 以 小 刀 切 下 膠 体 中 欲 分 析 的 斑 點 ， 所 切 的 大 小 約 為 1~2 mm3。 3. 將 切 下 的 膠 体 置 於 1.5mL 的 eppendorf。 4. 加 入 50μ L 的 50mM 之 NH4HCO3/ACN 1:1(v/v)（【 註 】 將 50mM 之 NH4HCO3 以 ACN 配 製 1:1 溶 液 ） 振 盪 15min 後 ， 離 心 取 出 上 層 液 丟 棄 。 5. 加 入 200μ L silver solution ( 0.5g K3[Fe(CN)6] 、 0.8g NaS2O3 in 50mL DI 水 ) destain 10 min 後 ， 取 出 丟 棄 。

6. 用 200μ L 25mM NH4HCO3 清 洗 gel pieces， 重 複 這 步 驟 ， 直 到 gel 變 成 無 色 ， 取 出 溶 液 丟 棄 。

7. 加 入 可 覆 蓋 住 膠 體 量 (約 25ul)的 ACN， 當 膠 体 收 縮 聚 在 一 起 後 ， 取 出 ACN。

8. 以 speedvac 抽 乾 膠 体 (約 10min)。

(2) Reduction and alkylation

1. 加 入 25μ L 新 鮮 配 置 的 10mM DTT（ dithiothreitol）/25mM NH4HCO3。 【 註 】 將 乾 燥 的 DTT 以 25mM NH4HCO3 配 成 10mM

2. 於 56℃ 下 incubate 45min 後，使 之 冷 卻 到 室 溫，離 心 將 上 淸 液 取 出 丟 棄。 3. 加 入 25μ L 的 現 配 55mM iodoacetamide（ IAA） (10mg IAA/【 mL 25mM NH4HCO3】 )

4. 在 暗 室 下 反 應 30-60min， 再 將 上 清 液 取 出 丟 棄 。

5. 加 入 50mM NH4HCO3 and ACN(1:1,v/v),清 洗 15min(2 次 )。

6. 加 入 適 量 的 ACN 以 覆 蓋 膠 体 ， 當 膠 体 收 縮 聚 在 一 起 後 ， 取 出 ACN。 7. 以 speedvac 抽 乾 膠 体 (約 10min)。

18

1. 膠 体 中 加 入 25μ L 5ng/μ L (20ng/μ L) 之 trypsin 溶 液 (溶 劑 為 25mM NH4HCO3)(依 膠 體 濃 度 酌 量 加 入 )

2. 加 入 適 量 (約 15μ L， 使 其 總 量 為 40μ L)的 25mM NH4HCO3(使 膠 体 保 持 水 份)， 37℃ 下 incubate overnight。

(4) Extract peptides for analysis

1. 確 保 tube 中 仍 含 有 3μ L 溶 液 (若 不 足 ， 可 加 一 點 點 純 水 )先 以 超 音 波 震 盪 10min。 2. 將 溶 液 取 出 收 集 。 3. 在 膠 体 中 加 入 3μ L 50% ACN 含 0.1%TFA。 4. 超 音 波 振 盪 10min 後 ， 將 溶 液 取 出 收 集 。 5. 重 覆 步 驟 3 及 步 驟 4 兩 次 。 6. 收 集 溶 液 「 2」 及 溶 液 「 4」， 若 濃 度 不 夠 可 濃 縮 ， 以 MALDI 分 析 。 Ｍ Ａ Ｌ Ｄ Ｉ 分 析 1. 取 消 化 產 物 0.5 uL 混 合 0.5 uL matrix (CHCA, α

-Cycno-4-hydroxy-cinnamic acid ) (CHCA 溶 於 50 % ACN + 0.1 % TFA) 點 於 384 well 的 ground target 上 。

2. 待 乾 燥 結 晶 後 ， 推 入 MALDI-TOF-MS 分 析 。

3. 根 據 質 譜 圖，使 用 MASCOT 軟 體 線 上 搜 尋 ，根 據 其 及 格 分 數 及 cover 到 之 片 段 進 行 結 果 判 斷 。

19

第 五 章 實 驗 結 果

5-1 Securin 基 因 及 蛋 白 質 鑑 定

表 現 Securin 蛋 白 質 的 菌 株 由 本 實 驗 室 所 建 構 。 Securin 的 cDNA 由 A549 cDNA 萃 取 擴 增 放 大 而 來 ， 而 後 嵌 入 pET200 的 載 體 後 轉 殖

( transformation )至 BL21(DE3)品 系 的 大 腸 桿 菌 ， 詳 細 的 基 因 圖 譜 如 圖 5-1， 序 列 及 比 對 結 果 如 附 錄 一 、 二 。 圖 5- 1、 pET200-Securin 基 因 圖 譜 以 pET200 為 主 要 表 現 的 質 體 ， 利 用 T7 promoter 調 控 基 因 ， 以 抗-kan mycin 作 為 篩 選 的 機 制 。 為 確 認 現 在 所 使 用 的 菌 株 仍 然 含 有 securin 基 因 序 列，將 現 使 用 的 菌 株 劃 盤 後 ， 挑 選 10 顆 菌 落 ， 使 用 實 驗 室 設 計 的 引 子 進 行 PCR， DNA 膠 的 結 果 顯 示 ， 在 600-700 bp 位 置 皆 有 產 物 ， 符 合 預 期 大 小 606 bp， 如 圖 5-2 所 示 ， 顯 示 我 的 securin 基 因 的 確 還 存 在 此 菌 種 當 中 。

20

圖 5- 2、 securin 轉 殖 菌 株 之 基 因 確 認

圖 中 M 為 DNA ladd er； 1 -1 0 為 挑 選 之 菌 落 編 號 。 圖 中 可 見 1 -10

間 皆 有 預 期 的 片 段(600-700 bp)。 DNA 電 泳 使 用 1.5% Agarose gel

及 0.5x TBE buffer。 為 確 認 蛋 白 質 是 否 正 確 ， 所 以 將 有 無 加 入 IPTG 誘 導 的 菌 種 做 比 較 ， 如 圖 5-3 所 示 ， 可 以 看 到 有 誘 導 的 部 分 明 顯 的 在 26 kD 左 右 的 位 置 有 較 明 顯 的 條 紋 ， 經 由 右 圖-西 方 墨 點 法 也 再 次 確 認 了 securin 含 量 的 確 在 有 誘 導 的 菌 種 中 有 大 量 表 現 。 另 外 因 為 實 驗 室 選 擇 使 用 內 涵 體( Inclusion body ) 做 摺 疊 以 得 到 大 量 的 蛋 白 質，所 以 將 內 涵 體 及 上 清 液 的 樣 品 以 securin 的 抗 體 做 確 認 ， 如 圖 5-4， 不 論 上 清 液 或 是 內 涵 體 中 ， 都 確 認 含 有 securin 蛋 白 質 ， 且 此 蛋 白 質 的 純 度 高 達 95%以 上 ， BSA 則 做 為 負 控 制 因 子 ， 確 認 此 抗 體 的 確 不 會 辨 認 到 其 他 的 蛋 白 質 。

21

圖 5- 3、 Securin 被 IPTG 大 量 誘 導 生 產

15% SDS PAGE 顯 示 ， 經 IPTG 誘 導 的 大 腸 桿 菌 (+)， 的 確 獲 得 純 度

高 的 Securin 蛋 白 質 (箭 頭 標 示 處 )， 右 圖 進 一 步 使 用 西 方 墨 點 法

(Western)證 實 大 量 被 誘 導 的 的 確 為 secu rin 蛋 白 質 (箭 頭 標 示 處 )。N

為 BSA 蛋 白 質 ， 作 為 負 對 照 組 。

圖 5- 4、 Securin 蛋 白 質 確 認

左 圖 為 15% SDS PAGE 顯 示，經 由 IPTG 誘 導 及 破 菌 的 方 式，的 確 獲 得 純 度 高 的 Securin

蛋 白 質(I)，右 圖 進 一 步 使 用 西 方 墨 點 法 (Western )證 實 不 論 上 清 液 (S)或 是 內 涵 體 (I)的 確

22

5-2 Far Western & Mass

圖 5-5 為 Far Western 的 實 驗 結 果。Far Western 的 實 驗 中 共 回 得 到 三 張 結 果 圖 ， 一 張 是 以 15% Tricine Gel 分 離 A549 細 胞 裂 解 蛋 白 質 的 結 果 (圖 A)， 另 外 兩 張 使 用 相 同 條 件 下 的 膠 體 ， 將 其 蛋 白 質 轉 漬 到 PVDF 膜 上 ， 轉 漬 膜 經 由 緩 衝 液 的 置 換 摺 疊 回 近 乎 自 然 態 。 其 一 與 Securin 培 養 1.5hr， 接 著 兩 張 膜 再 同 時 培 養 於 securin 之 一 級 抗 體 、 二 級 抗 體 ， 使 用 HRP 受 質 始 呈 色 。 由 圖 B 中 可 知 ， 有 與 securin 培 養 過 的 膜 上 有 許 多 呈 色 點 ， 這 些 都 是 可 能 與 securin 作 用 的 蛋 白 質 ； 圖 C 因 為 沒 有 與 securin 蛋 白 質 震 盪 培 養 過，所 以 有 可 能 呈 色 的 蛋 白 質 只 有 securin 本 身，其 他 蛋 白 質 都 不 會 呈 色 ， 圖 C 中 符 合 預 期 的 沒 有 任 何 其 他 的 蛋 白 質 呈 色 ， 而 Securin 沒 有 呈 色 的 原 因 可 能 是 細 胞 內 的 Securin 含 量 太 低，所 以 在 這 次 的 抗 體 濃 度 下 無 法 顯 示 。 在 圖 5-5-B 中 的 各 個 呈 色 點 雖 然 都 是 可 能 與 securin 作 用 的 蛋 白 質，但 是 與 膠 體 對 照 的 結 果 ， 僅 三 個 點 能 在 膠 體 得 到 相 對 應 的 結 果 ， 將 這 三 點 編 號 為 1、2、3，其 分 子 量 分 別 為 54kD、54kD、34kD，等 電 點 (pI)則 約 為 5.0、 5.0、 4.5， 如 表 5-1。 實 驗 中 僅 三 個 點 (編 號 1、 2、 3 點 )可 分 析 出 結 果 的 原 因 ， 可 能 是 每 個 蛋 白 質 與 Securin 結 合 的 能 力 不 同 ， 有 些 蛋 白 質 濃 度 雖 低 但 與 securin 鍵 結 的 強 度 較 強，所 以 有 差 不 多 強 度 的 呈 色，但 實 際 上 濃 度 過 低 而 無 法 經 由 銀 染 呈 現 ， 因 此 無 法 取 出 辨 認 為 何 種 蛋 白 質 。

將 此 三 點 蛋 白 質 經 過 Trypsin 消 化 後 ， 跑 MALDI-TOF Mass 得 到 光 譜 後，使 用 MASCOT 軟 體 線 上 搜 尋。結 果 顯 示 編 號 1、2 的 蛋 白 質 分 別 是 PCAF 的 次 單 元 及 Tbx3(圖 5-6)， 其 分 子 量 依 序 為 54.7kD 及 55kD， 與 二 維 電 泳 的 結 果 是 相 符 合 的 。 另 一 蛋 白 質 可 能 因 濃 度 過 低 ， 質 譜 分 析 的 圖 譜 無 法 在 資 料 庫 比 對 出 理 想 的 結 果 。

23 編 號 分 子 量(約 略 值 ) 等 電 點(約 略 值 ) 1 54 kDa 5.0 2 54 kDa 5.0 3 34 kDa 4.5 4 110 kDa 4.3 5 53 kDa 5.5 6 40 kDa 5.0 7 39 kDa 3.6 8 37 kDa 3.4 9 40 kDa 4.0 10 39 kDa 3.8 11 30 kDa 5.2 12 32 kDa 5.0 13 31 kDa 4.3 14 30 kDa 4.2 15 30 kDa 3.4 16 24 kDa 4.5 17 20 kDa 5.0 18 21 kDa 4.4 19 24 kDa 3.2 20 22 kDa 4.5 21 22 kDa 3.8 22 20 kDa 3.4 23 18 kDa 3.4 24 12 kDa 4.0 25 10 kDa 3.8 26 15 kDa 10.0 27 14 kDa 9.5 28 12 kDa 10.0

表 5- 1、 Far Western 中 與 securin 作 用 蛋 白 質 之 分 子 量 與 等 電 點

其 中 僅 1 - 3 所 對 應 的 膠 體 位 置 ， 蛋 白 質 含 量 足 以 在 質 譜 儀 中 分 析 出 來 ， 其 餘 蛋 白 質 無 法 得 到 分 析 結 果 。

24

1 2

3

圖 5- 5、 Far Western Assay

A 圖 為 A549 細 胞 裂 解 蛋 白 質 跑 二 維 膠 體 電 泳 的 結 果 ； B 圖 為 Far Western 結 果，呈 色 點 表 示 可 能 與 secu rin 作 用 的 蛋 白 質；C 圖 為 對

照 組 ， 因 沒 有 與 securin 培 養 過 ， 所 以 除 了 secu rin 本 身 外 ， 其 他 蛋

白 質 無 法 與 secu rin 之 一 級 抗 體 、 二 級 抗 體 接 合 ， 所 以 沒 有 呈 色 ，

而 secu rin 本 身 沒 有 呈 色 在 兩 張 膜 上，是 因 為 在 細 胞 中 secu rin 的 濃

度 相 較 於 其 他 蛋 白 質 是 較 低 的 ， 所 以 在 一 抗 稀 釋 1 /10 00 的 實 驗 狀 況 下 無 法 呈 色 。 A 1 2 3 B C 4 5 6 7 8 9 1 0 11 1 2 1 8 1 4 1 5 1 6 1 7 1 3 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 11

25

圖 5- 6、 MALDI-TOF Mass 結 果

圖 A-B 為 Far Western 中 得 到 的 蛋 白 質 ， 經 由 MALDI-TOF-MS 得

到 圖 譜 ， 在 使 用 MASCOT 軟 體 分 析 得 到 的 結 果 。 A 圖 的 結 果 為

【TAF6-like RNA polymerase II, p3 00 /CBP-asso ciated facto r

(PCAF)-associated factor, 65kDa, isoform CR A_c】， B 圖 結 果 為

【T-box 3 (u ln ar ma mmary syndrome), isoform CRA_b [Homo

sapiens]】

A、 PCAF

26

5-3 IP & Mass

在 免 疫 沉 澱 的 實 驗 中 ， 分 別 做 了 額 外 添 加 (圖 5-7 之 IP1-1)及 沒 有 額 外 添 加(圖 5-7 之 IP1-2) securin 的 實 驗，圖 5-7 中 A、B 為 不 同 批 次 免 疫 沉 澱 的 結 果 ， 因 為 分 別 將 A、 B 的 膠 體 做 過 遠 西 方 墨 點 法 後 發 現 ， 其 上 有 幾 個 點 的 確 與 securin 有 反 應 (附 錄 十 )， 所 以 將 這 些 點 取 出 ， 跑 MALDI-TOF 確 認 為 何 種 蛋 白 質 ， 取 了 A1-A10 以 及 B1-B5 共 15 個 點 ， A1-A10 分 子 量 依 序 約 為 ：11kD、 15kD、 17kD、 23kD、 25kD、 30kD、 35kD、 40kD、 43kD、 50kD。另 外 B1 至 B5 的 分 子 量 依 序 為 這 十 五 個 點 的 分 子 量 依 序 為：11kD、 15kD、 17kD、 23kD、 30kD， 如 表 5-2。 將 這 十 五 個 點 取 下 跑 質 譜 儀 的 結 果 如 圖 5-8~圖 5-11， 其 中 我 們 取 其 資 料 比 對 分 數 較 高 者 ， 且 根 據 securin 有 關 的 蛋 白 質 皆 與 細 胞 週 期 調 控 有 關 係，篩 選 出 三 個 最 有 可 能 與 securin 作 用 的 蛋 白 質，這 三 個 蛋 白 質 分 別 是 A1/B1-Histone H4(分 子 量 為 11.3kD，與 電 泳 實 驗 的 預 估 值 11 kD 接 近 )、 B4-Bcl2A1(分 子 量 為 20kD， 與 電 泳 實 驗 之 預 估 值 23 kD 接 近 )、 B5-cytoskeleton K1(分 子 量 為 67 kD， 與 電 泳 實 驗 預 估 值 30 kD 有 落 差 ， 所 以 此 蛋 白 質 在 質 譜 分 析 的 過 程 有 受 到 汙 染 的 可 能 ) (圖 5-8)。在 其 餘 蛋 白 質 中，A2、A3 分 析 的 結 果 為 免 疫 球 蛋 白 IG heavy chain 片 段，但 IG heavy chain 分 子 量 為 55 kD，且 其 質 譜 分 析 的 結 果 分 數 都 偏 低， 所 以 可 信 度 較 低 ；A4 為 DJ1 蛋 白 質 ， 是 DnaJ 的 同 源 蛋 白 ， 在 文 獻 中 以 證 明 能 與 securin 有 交 互 作 用 ； A5 則 為 已 申 請 專 利 但 尚 未 命 名 ， 且 未 知 功 能 之 蛋 白 質 ；B2 及 B3 分 別 為 Dapamine receptor D 片 段 、 RNA

terminalphosphate cyclase-like1 片 段 ， 雖 然 分 數 較 低 ， 我 們 仍 針 對 其 可 能 調 控 機 制 作 探 討(第 六 章 )， 其 餘 蛋 白 質 則 因 濃 度 不 足 ， 無 法 得 到 有 效 的 分 析 結 果 。

27 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 圖 5- 7、 免 疫 沉 澱 結 果 圖 A 及 圖 B 為 不 同 批 次 免 疫 沉 澱 的 結 果 ， M： marker， Securin：

實 驗 室 製 備 重 組 securin 蛋 白，IP-1：添 加 重 組 Securin 做 免 疫 沉 澱

的 結 果 ，IP1-2： 無 添 加 重 組 securin 蛋 白 做 免 疫 沉 澱 的 結 果 。 紅 色 方 框 選 取 的 蛋 白 質 皆 被 取 出 ， 以 MALDI-TOF Mass 測 定 為 何 種 蛋 白 質 ， 分 析 時 特 別 著 重 在 兩 次 免 疫 沉 澱 皆 有 出 現 的 蛋 白 質 。 編 號 分 子 量(約 略 值 ) A1 11 k D a A2 1 5 k D a A3 1 7 k D a A4 23 kDa A5 25 kDa A6 3 0 k D a A7 35 kDa A8 40 kDa A9 43 kDa A10 50 kDa B1 11 k D a B2 1 5 k D a B3 1 7 k D a B4 20 kDa B5 3 0 k D a 表 5- 2、 免 疫 沉 澱 中 與 securin 作 用 蛋 白 質 之 分 子 量 與 等 電 點 B1 B2 B3 B4 B5 A 、 S D S - PA G E C o o m a s s i e b l u e s t a i n B 、 S D S - PA G E S i l v e r s t a i n

28

圖 5- 8、 免 疫 沉 澱 蛋 白 質 經 由 質 譜 分 析 結 果 A-1

此 為 蛋 白 質 經 由 MALDI-TOF-MS 得 到 圖 譜 ， 再 使 用 MASCOT 軟

體 分 析 得 到 的 結 果 。A1 為 【 Histone H4 [v alid ated] – human】， A2

及 A3 為 【 IG Heavy Ch ain (Fragment)-Human】。

A1 及 B1： Histone H4

A2： IG Heavy Chain (Fragment)

29

圖 5- 9、 免 疫 沉 澱 蛋 白 質 經 由 質 譜 分 析 結 果 A-2

此 為 蛋 白 質 經 由 MALDI-TOF-MS 得 到 圖 譜 ， 再 使 用 MASCOT 軟

體 分 析 得 到 的 結 果 。A4 為 【 DJ-1 protein – human】， A7 為

【 Sequ ence 149 fro m Patent W O03 04 8202-Human】。

A4： DJ-1 protein

30

圖 5- 10、 免 疫 沉 澱 蛋 白 質 經 由 質 譜 分 析 結 果 B-1

此 為 蛋 白 質 經 由 MALDI-TOF-MS 得 到 圖 譜 ， 再 使 用 MASCOT 軟

體 分 析 得 到 的 結 果 。B1 為 【 Histone H4 [v alid ated] – human】， B2

為【Dopami ne recepto r D4 (Fragme n t)-Human】，B3 為【 RNA termin al

phosph ate cyclase-like 1 (Fragment)-Human】。

B1： Histone H4

B2： AY671463/Dopamine receptor D4 (Fragment)

31

圖 5- 11、 免 疫 沉 澱 取 得 蛋 白 質 ， 經 由 質 譜 分 析 得 到 的 結 果 B-2

此 為 蛋 白 質 經 由 MALDI-TOF-MS 得 到 圖 譜 ， 再 使 用 MASCOT 軟

體 分 析 得 到 的 結 果。B4 為【 Bcl-2 related – human】，B5 為【 Keratin ,

type II cytoskeletal 1 (Cytokeratin-1) (CK-1) (Keratin-1) (K1) (67 kDa cytokeratin ) (Hair alpha protein)-Human】。

B4： BCL2A1

32

5-4 酵 母 菌 雙 雜 交 系 統 (Yeast two hybrid)

在 本 實 驗 使 用 的 Yeast Two Hybrid 系 統 ， Securin 被 嵌 入 至 pSOS 載 體 ，cDNA library 則 嵌 入 pMyr 載 體 ， 若 兩 載 體 上 的 基 因 轉 錄 後 的 蛋 白 質 會 有 交 互 作 用，則 菌 落 得 以 在 37oC 的 SD-2(-UL) galatose plate 上 生 長。圖 5-9 為 兩 個 符 合 此 條 件 的 菌 落，我 們 利 用 系 統 中 所 附 的 pSOS 載 體 引 子 進 行 PCR，可 以 看 到 兩 菌 落 皆 含 有 Securin 的 DNA 片 段 在 800 bp 左 右 的 位 置 。 另 外 以 系 統 所 附 的 pMyr 載 體 引 子 進 行 PCR， 發 現 此 兩 蛋 白 質 的 基 因 片 段 約 在 700 bp 及 900 bp，我 們 將 這 兩 株 菌 送 定 序 的 結 果 分 別 為 Homo sapiens selenoprotein W、 ribosomal protein S3A， 但 都 有 Frame Shift 的 現 象 ， 所 以 這 兩 株 菌 是 偽 陽 性 的 結 果 ， 定 序 結 果 如 附 錄 六-九 。

pSos- securin ≒ 800b.p. pMyr – unknown gene 1 pMyr – unknown gene 2

圖 5- 12、 Yeast two hybrid

本 圖 為 雙 雜 交 系 統 篩 選 的 結 果。將 培 養 盤 上 長 出 的 兩 顆 菌 株 分 別 使 用 不 同 載 體 之 引 子( primer )進 行 聚 合 酶 連 鎖 反 應 ( PCR )， 確 認 菌 株 中 含 有 secu rin，也 得 知 此 兩 個 未 知 基 因 片 段 大 小 約 為 70 0 及 90 0 b p。

5-5 ITC

實 驗 中 我 們 利 用 物 理 的 方 式-恆 溫 滴 定 微 卡 洛 里 計，來 確 認 蛋 白 質 之 間 的 作 用。實 驗 中 我 們 將 p53 滴 定 到 securin 中，共 20 滴，在 滴 定 終 點 時 p53 莫 耳 數 約 為 securin 的 兩 倍。滴 定 熱 量 圖 如 圖 5-11，可 以 看 到 從 第 一 滴 p53 反 應 熱 就 非 常 大，在 五 滴 之 內 即 達 到 作 用 力 飽 和 的 狀 態，所 以 p53 與 securin

33

之 間 的 結 合 力 是 非 常 大 的，經 過 計 算 得 到 平 衡 常 數 K 值 為：3.11x1011 M- 2。 由 實 驗 飽 和 的 情 況 也 可 計 算 出 n = 0.5， 意 即 p53 與 securin 之 間 的 鍵 結 個 數 比 為 p53:securin = 1:2， Δ G=-14.7 kcal/mol， Δ S=1.5 kcal/Kmol， 由 各 常 數 都 可 看 出 這 兩 個 蛋 白 質 之 間 的 自 發 反 應 能 力 非 常 大 ， 作 用 力 也 很 大 。 圖 5- 13、 ITC p53 滴 定 securin 圖 圖 5- 14、 ITC 之 p53-securin 作 用 力 分 析 圖 Kd = 3.1x1011 M- 2 ΔH = 410.47 kcal/mol 50 100 150 200 250 300 350 -10 0 10 20 30 40 μ W Time (min) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 -400 -300 -200 -100 0 100 p53 to securin

[L]/[M]

Δ

H (kcal/mole)

34

5-6 Far Western 確 認 p53 及 securin 作 用

在 先 前 的 研 究 中 以 phage play 篩 選 出 p53 與 securin 之 間 有 交 互 作 用， 且 進 一 步 使 用 免 疫 沉 澱 及 pull down assay 證 實 p53 與 securin 有 交 互 作 用 [40]， 我 們 利 用 實 驗 室 遠 西 方 墨 點 法 同 樣 的 也 證 實 兩 個 蛋 白 質 之 間 有 交 互 作 用。在 圖 5-13 中，我 們 使 用 securin 作 為 正 控 制 組，BSA 作 為 負 對 照 組 ， 可 以 清 楚 的 看 到 ， 在 Far Western 實 驗 中 ， 與 securin 培 養 過 後 ， 僅 securin 及 p53 有 呈 色 。 我 們 進 一 步 利 用 遠 西 方 墨 點 法 來 計 算 兩 個 蛋 白 質 之 間 作 用 力 大 小 。 圖 5-14 為 p53 由 右 至 左 作 序 列 稀 釋 (120 μg、 60 μg、 30 μg… … 依 此 類 推 )， 與 securin 作 遠 西 方 墨 點 法 的 結 果 ， 因 為 不 同 量 的 p53 與 securin 結 合 的 程 度 不 同 ， 經 由 securin 一 級 抗 體 、 二 級 抗 體 -HRP 呈 色 後 ， 可 以 看 到 強 度 也 有 所 不 同 ， 將 p53 濃 度 與 呈 色 強 度 作 圖 後 ， 縱 軸 為 呈 色 強 度 ， 相 當 於 p53-securin 的 量 ， 橫 軸 為 p53 量 ， securin 濃 度 絕 大 於 p53， 因 此 可 由 Y 軸 飽 和 強 度 1/2 處 得 到 X 為 2.2x10- 1 2， 可 得 到 平 衡 常 數 Km = Kd = 2.2x10- 1 2 M2。 [p53] + 2[securin] [p53-2securin] k1 k- 1 Km + [p53] [P53-2securin] = [securin] 2_[p53] k1 k- 1 Km = = Kd

35

圖 5- 15、 Far Western 證 明 p53 與 securin 有 交 互 作 用

M：marker，Se：securin，BSA 作 為 負 對 照 組。A 圖 為 15 %SDS PAGE，B 圖 為 Far western

結 果 ， 顯 示 p5 3 的 確 有 與 securin 作 用 ， 所 以 在 p5 3 的 位 置 上 ， 能 被 secu rin 一 抗 辨

認 進 而 呈 色 。C 圖 作 為 對 照 組 ， 因 轉 漬 膜 沒 有 與 secu rin 培 養 所 以 在 p5 3 的 位 置 上

沒 有 呈 色 。 另 外 A 圖 中 secu rin 看 不 到 的 原 因 是 ， 在 secu rin 一 抗 為 1 /10 00 的 條 件

下，securin 本 身 濃 度 要 低 於 0 .0 4μg 左 右，才 能 在 西 方 墨 點 法 中 不 會 有 過 曝 的 現 象 。 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 Data: Data1_J Model: ExpGro1 Equation: y = A1*exp(x/t1) + y0 Weighting: y No weighting Chi^2/DoF = 0.29791 R^2 = 0.99798 y0 22.2473 ±0.44619 A1 -28.17559 ±0.82065 t1 -16.82704 ±1.21256 Relat ive Inte nsi ty (a rb.uni t) p53 (pmole)

圖 5- 16、 由 Far Western 實 驗 估 計 p53 與 securin 作 用 常 數

圖 為 西 方 墨 點 法 結 果，將 p 53 由 右 到 左 作 序 列 稀 釋，以 SDS PAGE 分 離 後 轉 漬 到 PVDF

膜 上 ， 再 依 序 與 securin、 securin 一 抗 (mouse)、 IgG-anti-mouse 培 養 後 呈 色 結 果 。

43

55

36

第 六 章 討 論

6-1 Securin 可 信 度 及 蛋 白 質 純 度

透 過 聚 合 酶 連 鎖 反 應(PCR)的 確 認 ， 我 們 所 轉 殖 的 大 腸 桿 菌 中 ， 的 確 含 有 securin 的 基 因 片 段，且 經 由 IPTG 誘 導，菌 株 也 能 大 量 製 造 Securin。 從 上 清 液 及 內 涵 體 的 電 泳 膠 我 們 也 可 看 出 ， 內 涵 體 的 純 度 非 常 高 ， 將 此 內 涵 體 經 由 實 驗 室 的 準 靜 態 熱 透 析 平 衡 法 摺 疊 後，成 為 自 然 態 的 securin 蛋 白 質 。

6-2 文 獻 搜 尋 與 Securin 作 用 的 蛋 白 質

在 文 獻 搜 尋 中 ， 共 找 到 十 一 個 與 Securin 作 用 的 蛋 白 質 ， 大 多 是 利 用 免 疫 沉 澱 以 及 酵 母 菌 雙 雜 交 系 統 得 到 的 結 果 ， 少 數 是 利 用 電 子 顯 微 鏡 或 晶 片 實 驗 得 到 的 結 果 ， 將 其 名 稱 、 分 子 量 以 及 篩 選 出 來 的 實 驗 方 式 列 出 如 表 6-1。在 這 些 蛋 白 質 當 中，HSJ2(DnaJ)的 細 胞 質 同 源 蛋 白 也 在 我 們 的 免 疫 沉 澱 的 結 果 當 中(圖 5-7 及 圖 5-9 的 A4 蛋 白 質 )，其 他 有 許 多 蛋 白 質 的 分 子 量 與 免 疫 沉 澱 中 得 到 的 蛋 白 質 是 非 常 相 近 的，像 是 ribosomal S10 蛋 白 質 與 免 疫 沉 澱 中 的 A3 分 子 量 皆 為 19 kDa 左 右，Separase 與 A4 蛋 白 質 皆 為 23 kDa 左 右，Cdk2 與 A5 蛋 白 質 分 子 量 在 左 右，還 有 p53 與 A10 蛋 白 質 都 在 50 kDa 左 右 大 小 ， 沒 有 在 免 疫 沉 澱 實 驗 中 分 離 、 分 析 出 這 些 蛋 白 質 的 原 因 ， 可 能 是 因 為 不 同 蛋 白 質 的 分 子 量 太 過 接 近 且 濃 度 低 於 我 們 這 次 索 取 的 蛋 白 質 ， 所 以 無 法 分 離 出 來 。

37

6-3 與 Securin 作 用 蛋 白 質 功 能 探 討

文 獻 搜 尋 的 結 果 顯 示 ， 目 前 與 Securin 有 確 定 交 互 作 用 的 蛋 白 質 ， 都 與 細 胞 週 期 調 控 有 關 ， 依 這 些 蛋 白 質 的 角 色 ， 可 分 為 三 部 分 討 論 ： 染 色 體 的 分 離 、 細 胞 凋 亡 、DNA 修 復 及 轉 錄 ， 參 與 細 胞 染 色 體 分 離 的 蛋 白 質 有 Separase、 Cdc2228、 Cdc20、 PP2A； 與 細 胞 凋 亡 有 表 6- 1、 已 知 與 securin 有 作 用 蛋 白 質 蛋 白 質 分 子 量 實 驗 方 式 參 考 資 料 P53 53 kD 1. Pull-down Assay [40] PBF = PTTG binding factor 20 kD 1. Pull-down Assay 2. Immunoprecipitation 3. Yeast two hybrid

[41,42]

Cdk2/Cdc28 25.9 kD 1. Immunoprecipitation [13]

Cdc20 54.7 kD

1. Yeast two hybrid 2. Pull-down assay 3. Immunoprecipitaton [43] Ku 70/80 heterodimer Ku70:69.8 kD Ku (p70/p80) =82.7KD

1.Two hybrid system 2. Immunoprecipitation

[23]

PP2A 56 kD 1. Immunoprecipitation

2. Yeast two hybrid

[45]

separase 23.3 kD 1. Immunoprecipitation 2. EM

[45]

Ribosomal S10 18.9 kD 1. Pull-down Assay 2. Immunoprecipitation

[47]

HSJ2 (DnaJ) 26.9 kD 1. Pull-down Assay 2. Immunoprecipitation [47] SP1 9.6 kD 1. Immunoprecipitation 2. ChIP [48] MEK1 43.4 kD 1. Immunoprecipitation [49]