中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/25261

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

綠豆 cDNA Library 的建構與澱粉合成酵素基因的選殖

中 華 民 國 92 年 10 月 31 日

九十一年度國科會專題計畫成果報告

計畫編號：NSC 91-2313-B-039-002

綠豆cDNA library 的建構與澱粉合成酵素基因的選殖

Construction of mung bean cDNA library and cloning of its starch synthase genes 執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日

主持人：柯源悌 中國醫藥大學 營養系 e-mail: [email protected] 中文摘要:

依據參與澱粉生合成的酵素群BE, SSS, GBSS

及SP 保守區間所設計的基因特異性引子組，對成

長中之台南五號綠豆 (Vigna radiata L. cv Tainan no. 5) 的 PolyA mRNA 進行反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (RT-PCR)的 cDNA 選殖，只有 SBE F1 及 SBE R1

引子對，成功的量化出一段794 bp 的 cDNA。其內

部序列經過與GCG Database 比對，發現和

Phaseolus vulgaris 物種的 BE I (kbe1; accession no.

AB029548; 3,360 bp) 全長序列的重疊部分有 97% 的相似度，和 Ipomoea batatas (sweet potato) 的 SBE II (AB071286; 3,123 bp) 全長序列的重疊部分 有84%的相似度，經過 PileUp 並排後，所得綠豆 cDNA 序列為靠近中間部位，已將此 cDNA 片段選 殖到pGEM T-Eazy 載體中作為株系保存，命名為 pVrbeIp。為了得到全長序列，目前由所得的 SBE cDNA 片段內部序列已設計引子在單股 cDNA library 中進行 5’與 3’RACE，3’RACE 反應較平順， 獲得之1,200 bp 定序當中。 關鍵詞：綠豆、澱粉合成酉每、基因選殖、RT-PCR Abstract

Gene-specific primer pairs designed from cDNA conserved motifs of BE, SSS, GBSS and SP, a group of enzymes involved in starch biosynthesis, were used in RT-PCR cloning on the polyA mRNA of premature mung bean (Vigna radiata L. cv Tainan no. 5). Only SBE F1 and SBE R1 pairs were successfully amplify a partial-length of cDNA (794 bp) encoding starch branching enzyme (SBEI; 2.4.1.18). The internal

sequence of the amplicon was searched in the GCG database and found to have 97% similarity with

Phaseolus vulgaris BE I (kbe1; accession no.

AB029548; 3,360 bp) and 84% similarity with

Ipomoea batatas (sweet potato) SBE II (AB071286;

3,123 bp) within the overlapped regions and thus designated VrbeIp. Besides, it was also shown to be located in the central region of the postulated

full-length cDNA by PileUp alignment and was then cloned into pGEM T-Eazy vector, designated pVrbeIp for further use. In order to pursue a full-length clone, internal primers were designed from VrbeIp sequence to conduct RACE on the first strand cDNA library. 3’-RACE was performed more smoothly than

5’-RACE and a 1,200 bp fragment were generated and currently subjected to sequencing.

Keyword: Mung bean (Vigna radiata L.), Starch synthase, Gene cloning, RT-PCR

二 二二、、緣由與目的:、 綠豆是亞熱帶栽種的作物，其澱粉為世界上單 價最高的澱粉，是中國傳統食品製作冬粉不可或缺 的原料，在化學性質方面認為綠豆澱粉的直鏈澱粉 (amylose) 含量約為 32-35%，較一般澱粉的 15-30% 為高，且 amylose 與分支澱粉 (amylopectin) 的分 子構造特別，使冬粉具有久煮不爛的韌性，不能為 其他種類的澱粉所取代；對於合成澱粉的酵素群， 在植物醣類代謝的能量儲存方面不僅具生理上的 必要性，不同種類的澱粉合成酶對澱粉的結構扮演 關鍵性的角色，然而國內外的澱粉相關研究缺乏對 於綠豆澱粉合成酶 (starch synthases) 的探討。 基 於 許 多 物 種 對 澱 粉 生 合 成 酵 素 SS 、 GBSS、SBE 與 SP 在酵素活性方面了解，但將 大分子蛋白質完全定序是花費極高的工程及所

獲資訊有限之下，促使尋找其編碼基因變得相對 迫切，因為在諸多研究顯示即使同種或異種之異 構酶的抗體可相互作用與辨認彼此的蛋白質，或 中和彼此的活性，然而無法回答是否異構酶之間 在蛋白質的三度空間構形或一級胺基酸有絕對 的相似性，然而一旦在核酸層面獲得序列的資 訊，得以將編碼基因推衍出其胺基酸序列、與其 他基因並排作相似度比對、酵素親源的樹譜、結 構的預測等；其基因可利用基因工程技術操作， 轉接在不同的啟動子之後、放入不同宿主表現等 作多元化分子生物學上探討。本計畫目的是選殖 澱粉合成酵素之cDNA，試驗策略是由綠豆種子

先抽 total RNA，再將 total RNA 純化為 polyA

RNA，接著利用基因特異性引子進行 RT-PCR， 之後將 RT-PCR 得到的產物作 PCR 二次放大、 純化、定序，將序列進入資料庫搜尋比對是否為 目標產物，再利用 TA-cloning 方法將目標產物 殖入質體中，期間抽質體DNA 作定序，再次進 入資料庫比對確認無誤後作株系(clone)保存。所 得的 SBE cDNA 片段內部序列再設計引子對

cDNA library 進行 5’與 3’RACE，以獲得全長的 cDNA。

三

三三、、、材材材料料料與與與方方方法法法

材料：

農業改良場台南朴子分廠提供之未成熟台南五 號綠豆種子(Vigna radiata L. cv Tainan no. 5) 設計基因特異性引子-

利用GCG SeqWeb 的 Lookup 或 StringSearch

指令搜尋出相似物種序列，利用Motif Search 找出

序列的conserved motif，由 Reading Frame 得到分

別對 N,C-端之最遠端的二個 Motif。假設最遠端為

Motif A 及 Motif B，由 motif A 找 forward primer，

由motif B 找 reverse primer、將此二段序列分別跑

Primer Selection，將找到符合條件的 Primer 再跑 Blastn (確認其專一性)，相似性愈少愈好，再和 α-amylose family conserved region 比 對 ， 排 除 α-amylose family 的 Motif。

(1) .利用 GCG SeqWeb 自行設計引子 命名 序列 SBE-F1 TGGATATTGTTCACAGTCATGC SBE-R1 CTTGGGAAATCTATCCATTCAGGATGCC SBE-R2 GGAAATCTATCCATTCAGGATGCCC SSS-F1 CTTGACAAGGGTGAGGCAGTC SSS-F2 CCTTGACAAGGGTGAGGCAGTC SSS-R1 GCAGTTATTCGGTGGGAAACTGGAACA SSS-R2 GCAGTTATTCGGTGGGAAACTGGAACAC SSI-F1 GACTGGTGGATTAGGAGATGTTTGTGG SS1-R1 CTTAGGCCCCCCGTGCTATGAACAAT SP-F1 TGGATGGTGCTAATGTGGAAATCAG SP-R1 CAGGTAAAACAAGGGTGTTCCAGG (2) .由得到之 SBE cDNA 794 bp 片段內部序列設計 引子進行RACE 命名 序列 SBE-F2 AAGATGAGGACTGGAAAATGGGCG SBE-F3 TCACGGGGTTATCATTGGATGTGGG SBE-R3 CCGTCAAACTTGTATTCATCCAGCCACC SBE-R4 TATCGCCCATTTTCCAGTCC Total RNA 之抽取 先取20 ml 抽取緩衝液(100 mM Tris-HCl [pH 7.5]、100 mM LiCl、100 mM EDTA [pH 8.0]、1% SDS、100 mM β-mercaptoethanol)預熱至 65℃，加 入 20 ml 等體積之 phenol 作平衡 pH 備用。自-80℃ 冰箱取出4 g 綠豆種子，加入液態氮以研缽研磨呈 粉末狀後，加入上述之40 ml 混合溶液並研磨均 質。將均質樣品分裝至50 ml 離心管中，於 65℃水 浴槽中加熱5 分鐘，震盪混勻，再加入 1/2 體積 Chloroform:isoamylalcohol = 24:1，震盪萃取 1 分 鐘，於4℃以 15,000 rpm 離心 20 分鐘。取出上清 液，加入等體積Phenol:Chloroform:isoamylalcohol = 25:24:1，再震盪萃取 1 分鐘，於 4℃以 15,000 rpm 離心10 分鐘。取出上清液，再加入等體積 Chloroform:isoamylalcohol = 24:1，震盪萃取 1 分 鐘，於4℃以 15,000 rpm 離心 5 分鐘去除 phenol， 此步驟重複二次，取上清液，隨後加入等體積4 M LiCl，置於-70℃冰箱 1-2 小時幫助 RNA 沈澱。於 4℃ 以15,000 rpm 離心 30 分鐘，將沈澱物溶於 10 ml 之2 M LiCl，以 15,000 rpm 離心 10 分鐘。將沈澱

物加入5 ml 之 0.1% lauro-sarcrosyl，震盪溶解 RNA。取 2 ml 之離心管加入 1ml 之 100%酒精及 40 µl 醋酸溶液(3M、pH 4.3)，將溶解之 RNA 分裝至 離心管中，置於-70℃冰箱過夜。於 4℃以 14,000 rpm 離心15 分鐘後，去除上清液，取 80%酒精清洗沈 澱物，於4℃以 14,000 rpm 離心 15 分鐘後真空乾 燥沈澱。RNA 沈澱物溶於 200 µl 之 0.1%

lauro-sarcrosyl，測 total RNA 濃度及 A260/A280比值，

儲存於-80℃。取 5 µl 跑 RNA 甲醛洋菜膠體電泳確 認。

PolyA mRNA 之分離

利用商品化PolyATtract○R

mRNA isolation systems (Promega, Cat. No.5200 )。藉由 biotinylated oligo(dT)在高鹽溶液下(20x SSC) (dT)端先會與 mRNA 3’端的 poly(A) tail 以氫鍵鍵結，接著 biotinylated oligo(dT)的 biotin 端會和 SA-PMPs (streptavidin-paramagnetic particles)結合成連結複合

物，再利用磁板會物理性吸住SA-PMPs 後，以低

鹽溶液(0.5x 及 0.1x SSC)洗去不吸附的物質，最後

以RNase-free 水將複合物上的 polyA RNA 溶離出

來。

取 0.1-1 mg total RNA 加 DEPC 水至總體積為 500 µl，65℃下反應 10 分鐘，加 3 µl oligo(dT) probe 及13 µl 20x SSC，混合均勻(勿用 vortex)，置於室 溫 直 到 完 全 冷 卻 約 10 分 鐘 。 利 用 磁 板 抓 取 SA-PMPs 原理以 0.5 x SSC (300 µl/次) 清洗 SA-PMPs 三次。將準備好的樣品取至 SA-PMPs 中 混勻，室溫下反應 10 分鐘，過程中每 2-3 分鐘輕 輕混勻一次。以磁板吸附SA-PMPs 移除上清液(注 意不要吸到SA-PMP pellet)。以 0.1x SSC(300µl/次) 清洗SA-PMPs 四次，移除上清液。以 100 µl RNase

Free H20 溶離出 poly A RNA，再以 150 µl RNase

Free H20 溶 離 出 poly A RNA ， 測 吸 光

A260/A280≧2.0。

RT-PCR

利用 SuperScript TM One-Step RT-PCR Systems

(Invitrogen Cat. No.10928-042)。於 0.2 ml 離心管中

依序加入25 µl 2X Reaction Mix、10 pg-1 µg polyA

RNA、10 µM 的 sense 及 antisense primer 各 1 µl 及 1 µl RT/Platinum Taq Mix，最後加水至 50 µl 混合均

勻。進行 RT-PCR 反應，反應條件為：(1) cDNA

synthesis and pre-denaturation：45 30 min℃ 、94 2 ℃ min；(2) PCR amplification：94℃ 15 s (Denature)、 60℃ 30 s (Anneal)、72℃ 2 min (Extend)，重複 35 次；(3) Final extension：72℃ 10 min。取 5 µl 跑電 泳確認。

PCR

於 0.2 ml 離心管中依序加入 5 µl 10x PCR buffer、10 mM dNTP 各 1 µl、10 µM 的 sense 及 antisense primer 各 3 µl 及 0.4 µl FastStart Taq DNA Polymerase (Roche)，混合均勻後再加入 Template DNA (>500 ng/reaction)，最後加無菌水至總體積為 50 µl。進行 PCR 反應，條件為：(1) 95℃ 3 min；(2) 95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1min，重複 35 次；(3)72℃ 10 min。 取 5 µl 跑電泳確認。 PCR 產物純化

使 用 PCR-MTM Clean Up System (Viogene Cat.

No.PF1001)

(1) 以 Modified TAE buffer (40 mM Tris-acetate、

pH8.0，0.1 mM Na-EDTA)製膠。取適量樣品跑膠

後，以UV 確認後，切下條紋 (<100 µl at 100mg) 放

入column，離心 5000 x g 10 分鐘，收集 Vial 中液

體，測吸光值。

(2) 取 10-100 µl PCR 產物和 0.5 ml Px buffer 混合均

勻 ， 取 至 column (Millipore Ultrafree-DA, Cat.

No.4260)中(每次勿超過 0.7ml)離心 1,3000 rpm 60 秒，加入0.5 ml WF buffer，離心 1,3000 rpm 60 秒 後丟棄流出液。加入0.7 ml WS buffer，離心 1,3000 rpm 4 分鐘後，換新的 1.5 ml 離心管。加入 30 µl 的滅菌水，放置1-2 分鐘，離心 13000 rpm 2 分鐘， 此步驟重複二次，測吸光值。 T-A cloning 使用材料有：

pGEM-T Easy Vector Systems (Promega Cat.A1380)

Competent cells:DH5α 及 JM110

Gel extraction kit (Viogene Cat.GF1001) 抽 plasmid DNA kit (Viogene Cat.EG1001) LB 固 體 培 養 基 ： LB Broth ＋ Agar ＋ ampicillin/IPTG/X-Gal LB 液體培養基：LB Broth＋ampicillin(100 µg/ml) 限制酶：EcoRI 【方法】 (1) 純化：將 SBE 二次放大後的產物跑 1%電泳 分析確認後，切下約800 bp 的片段，利用 Gel

extraction kit (Viogene)將切下的膠片純化，再 次跑膠確認。

(2) Ligation：取 3µl 的樣品依序加入試劑後，加

滅菌水至總體機為 10 µl，室溫下培養 1 小時

後，4℃隔夜反應。

(3) Transformation：分別取 5 µl ligation reactions

加入50 µl 之 Competent cells (DH5α 及 JM110) 混合均勻後，置於冰浴中 20 分鐘後，42℃加 熱40-45 秒(heat shock)，冰浴 2 分鐘。加入 950 µl LB 液體培養基，於 37℃、150 rpm 震盪培 養1.5 小時，取 1ml 塗抹於 LB/Amp/IPTG/X-Gal 固體培養基，37℃隔夜培養。

(4) 篩選 clone：將 plate 上之 positive clone 培養

於2 ml 的 LB 液體培養基中，37℃隔夜培養。

以小量抽取 plasmid DNA 套組(Viogene)得到

的質體 DNA，再以限制酶(EcoRI)作用，將接 入載體上之 DNA 切出，確認大小後，進行定 序。 (5) 菌液培養：將剩餘菌液取 20 µl 加 2ml LB 液 體培養基，於37℃、150 rpm 震盪隔夜培養。 取800 µl 加 200 µl 80% glycerol 保存於-80℃。 抽質體 DNA

使 用 抽 plasmid DNA kit (Viogene

Cat.EG1001)，取 1.5 ml 菌液離心 2 分鐘，除去 上清液，加250 µl MX1 buffer 將 pellet 完全溶解 後，加250 µl MX2 buffer 混勻，室溫下反應 1-5 分鐘，加入350 µl MX3 buffer 混勻後，離心 5-10 分鐘。將上清液取至column 中，離心 60 秒丟棄 流出液，加0.5 ml WF buffer，離心 60 秒丟棄流 出液，再加0.7 ml WS buffer，離心 60 秒丟棄流 出液，空轉 3 分鐘。將 column 取至一新的離心 管中，加100 µl 的滅菌水，靜置 1-2 分鐘後，離 心2 分鐘。所有的離心轉速為 13,000-14,000 rpm。

RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)

使用 Smart TM RACE cDNA Amplification Kit

(Clontech Cat.K1811-1)

(一) First-Strand cDNA Synthesis：

(1) 取 50 ng-1 µg 的 polyA mRNA，分別進行

3’-及5’-RACE Ready cDNA 的合成。

(2) 3’-RACE-Ready cDNA

於 70℃加熱 2 分鐘後置於冰浴 2 分鐘，加入 Mix reaction (2 µl 5X first-strand buffer、1 µl 20 mM DTT 、 1 µl 10 mM dNTP Mix 、 1 µl PowerScript reverse transcriptase)，總體積為 10 µl。離心混合均勻，42℃下反應 1.5 小時，以 100-250 µl Tricine-EDTA buffer 稀釋，於 72℃ 反應7 分鐘後。測吸光值，保存於-20℃。 (3) 5’-RACE-Ready cDNA 取 1-3 µl polyA mRN 加 1 µl 5’-CDS primer 及 Smart II A oligo，加滅菌水至 5 µl。於 70℃加 熱2 分鐘後置於冰浴 2 分鐘，加入 Mix reaction (2 µl 5X first-strand buffer、1 µl 20mM DTT、1 µl 10 mM dNTP Mix、1 µl PowerScript reverse transcriptase)，總體積為 10 µl。離心混合均勻， 42℃下反應 1.5 小時，以 100-250 µl Tricine -EDTA buffer 稀釋，於 72℃反應 7 分鐘後。測 吸光值，保存於-20℃。

(二) 3’ RACE：利用自行設計之基因特異性

forward primer (SBEF1) 和 套 組 提 供 之 UPM (Universal Primer A Mix) 進行 RACE，再將第一

次量化之產物以TE buffer 稀釋 50-100 倍。由已

得到的 SBE cDNA 片段再往內設計 forward

primer (SBEF2 及 SBEF3)和套組提供之 NUP (Nested Universal Primer A)，以稀釋過的產物為 template 再次進行 RACE，得到一段約 1200 bp 的片段，目前進行定序中。

reverse primer (SBER1) 和 套 組 提 供 之 UPM (Universal Primer A Mix) 進行 RACE，再將第一

次量化之產物以TE buffer 稀釋 50-100 倍。由已

得 到 的 SBE cDNA 片段再往內設計 reverse

primer (SBER3 及 SBER4) 和套組提供之 NUP (Nested Universal Primer A)，以稀釋過的產物為 template 再次進行 RACE，目前尚未得到較確定 的片段。

四、、結果與討論: 、

Total RNA 之抽取:

由4 g 綠豆種子抽得之 total RNA 總量約 1.18 mg。

在RNA gel 上看出抽得之 total RNA 主要有二條明

顯的條紋分別為28 S 及 18 S，其中分子量較低的 條紋可能為已裂解之RNA，因此接著純化 polyA RNA 獲得 6 µg。 RT-PCR 產物經 PCR 二次放大 將polyA RNA 以四種酵素基因特異性引子進行 RT-PCR，只有 SBE-F1 與 SBE-R1 成功得到一條約 800 bp 的產物(結果未示)，但因條紋不明顯，產量 不足以進行定序，因此，將800 bp 產物切出、純化 作為模板，以SBE-F1 與 SBE-R1 為引子進行二次 PCR 放大。結果得到三條明顯的條紋，其中分子量 最大的800 bp 條紋大小和原 RT-PCR 所得的 800 bp 產物相同，因此將其切下、純化、定序、隨後確認 為BEI 的部分序列、命名為 VrbeIp。 VrbeIp cDNA 序列比對 1401 1450 AB029548 tgtacacagt cattcatcaa ataatacatt ggatgggcta aacatgtttg SBE-SBEF TTT TTAGTGTCCT CGATTCTTTG AGATGGCTAG CATAGCTTTG Consensus ---T ---TC-- --A-T---T- -GATGG---- -A-A--TTTG

1451 1500 AB029548 atggaactga tggtcattac ttccatcctg ggtcacgagg ttatcattgg SBE-SBEF ATGGAACTGA TAGTCATTAC TTCCATCCTG GGTCACGGGG TTATCATTGG Consensus ATGGAACTGA T-GTCATTAC TTCCATCCTG GGTCACG-GG TTATCATTGG

1501 1550 AB029548 atgtgggatt ctcgcctttt caattatgga agctgggaag tattaaggta SBE-SBEF ATGTGGGATT CTCGTCTTTT CAATTATGGA AGCTGGGAAG TACTAAGGTA Consensus ATGTGGGATT CTCG-CTTTT CAATTATGGA AGCTGGGAAG TA-TAAGGTA

1551 1600 AB029548 tctactttca aatgcgagat ggtggctgga tgaatacaag tttgacggat SBE-SBEF TCTACTTTCA AATGCAAGAT GGTGGCTGGA TGAATACAAG TTTGACGGAT Consensus TCTACTTTCA AATGC-AGAT GGTGGCTGGA TGAATACAAG TTTGACGGAT

1601 1650 AB029548 ttcgatttga tggtgttaca tcaatgatgt acactcatca tggattgcag SBE-SBEF TTCGATTTGA TGGTGTTACA TCAATGATGT ACACTCATCA TGGGTTGCAG Consensus TTCGATTTGA TGGTGTTACA TCAATGATGT ACACTCATCA TGG-TTGCAG

1651 1700 AB029548 gtagcattca ctggaaatta cagtgagtac tttggtttgg caactgatgt SBE-SBEF GTAGCATTCA CTGGAAATTA CAGTGAGTAC TTTGGTATGG CAACTGATGT Consensus GTAGCATTCA CTGGAAATTA CAGTGAGTAC TTTGGT-TGG CAACTGATGT

1701 1750 AB029548 tgatgctgtg gtttacctga tgctggctaa tgatctcatt catggactct SBE-SBEF TGATGCTGTG GTTTACCTGA TGCTGGCTAA TGATCTCATT CATGGGCTCT Consensus TGATGCTGTG GTTTACCTGA TGCTGGCTAA TGATCTCATT CATGG-CTCT

1751 1800 AB029548 tccctgaggc agttaccatt ggtgaagatg tgagtggaat gccaacattc SBE-SBEF TCCCCGAGGC TGTTACCATT GGTGAAGATG TGAGTGGAAT GCCAACATTC Consensus TCCC-GAGGC -GTTACCATT GGTGAAGATG TGAGTGGAAT GCCAACATTC

1801 1850 AB029548 tgccttccta cacaagatgg tggggttggt tttgattatc gcctgcaaat SBE-SBEF TGCCTTCCTA CACAAGATGG TGGTGTTGGT TTTGATTATC GCCTGCAAAT Consensus TGCCTTCCTA CACAAGATGG TGG-GTTGGT TTTGATTATC GCCTGCAAAT

1851 1900 AB029548 ggccattgca gacaagtgga ttgagattct caagaagcaa gatgaggact SBE-SBEF GGCCATTGCA GACAAGTGGA TTGAGATTCT CAAGAAGCAA GATGAGGACT Consensus GGCCATTGCA GACAAGTGGA TTGAGATTCT CAAGAAGCAA GATGAGGACT

1901 1950 AB029548 ggaaaatggg tgatattgtg cacacactaa caaacagaag gtggctggaa SBE-SBEF GGAAAATGGG CGATATTGTC CACACACTAA CAAACAGAAG ATGGCTGGAA Consensus GGAAAATGGG -GATATTGT- CACACACTAA CAAACAGAAG -TGGCTGGAA

1951 2000 AB029548 aaatgtgtag cttatgctga gagtcatgac caggccttgg ttggtgacaa SBE-SBEF AAATGTGTAG CTTATGCTGA GAGTCATGAT CAGGCCTTGG TTGGTGACAA Consensus AAATGTGTAG CTTATGCTGA GAGTCATGA- CAGGCCTTGG TTGGTGACAA Fig. 1 綠豆的 Total RNA

Lane 1 是 DNA ladder marker; Lane 2 和 3 是同一批抽到之 total RNA，樣品量分別為 220 ng 與 370ng。

Fig. 2 以 SBE-F1 與 SBE-R1 為引子的RT-PCR 經二次 PCR 放大的產物

Lane 1 是 DNA ladder marker 樣品量600 ng ;Lane2 是 PCR 二次放大產物。

2001 2050 AB029548 gacaattgca ttttggttga tggacaagga tatgtatgac ttcatgtctt SBE-SBEF GACAATTGCA TTTTGGTTGA TGGACAAGGA TATGTATGAC TTCATGGCGT Consensus GACAATTGCA TTTTGGTTGA TGGACAAGGA TATGTATGAC TTCATG-C-T

2051 2100 AB029548 tagacaggcc agctacacct cgtatagatc gtggtatagc attacacaaa SBE-SBEF TAGACAGGCC ATCTACACCT CGTATAGATC GTGGTATAGC ATTACACAAA Consensus TAGACAGGCC A-CTACACCT CGTATAGATC GTGGTATAGC ATTACACAAA

2101 2150 AB029548 atgattaggc ttattaccat gggacttggt ggtgaaggat atttaaattt SBE-SBEF ATGATTAGGC TTATTACCAT GGGACTTGGT GGTGAAGGGT ATTTGAATTT Consensus ATGATTAGGC TTATTACCAT GGGACTTGGT GGTGAAGG-T ATTT-AATTT

2151 2200 AB029548 tatggggaat gagtttggtc atcctgagtg gattgatttc ccaaggggtg SBE-SBEF TATGGGGAAT GAGTTTGGCC TCCTTGATGG GAAGAATTCC CCAAGAAAAA Consensus TATGGGGAAT GAGTTTGG-C --C-TGA--G GA---ATT-C CCAAG---

Fig. 3 綠豆 VrbeIp 與 Phaseolus vulgaris 物種的 BE I (kbe1; accession no. AB029548; 3360 bp) cDNA 的並排序 列與相同核酸區域比對

得到之SBE 片段 (794 bp) 經 GCG Database 比對

和 Phaseolus vulgaris 物 種 的 BEI (kbe1; accession no. AB029548; 3,360 bp) 序 列 bp 1408-2201 之 間 有 97% 的 相 似 度 。 此 外 和

Ipomoea batatas (sweet potato) 的 SBE II

(AB071286; 3,123 bp) 全長序列的重疊部分有 84%的相似度(比對序列未示)，因此確認找到綠

豆的BEI 部分序列、命名為 VrbeIp。

pVrbeIp 株系的保存

Fig. 4 轉形(transform)入宿主的 pVrbeIp 正株系確認 Lane M 是 marker；Lane 1-6 是 DH5α 1-6株係抽得之 intact

plasmid DNA；Lane 7，8 是 JM110 3-4株系抽得之intact plasmid

DNA；Lane 9-14 是 DH5α 1-6株係抽得之plasmid DNA 以限制

酶EcoRI 作用；Lane 15，16 是 JM110 3-4株係抽得之plasmid

DNA 以限制酶 EcoRI 作用。

以 T-A cloning 將 VrbeIp 保存於 pGEM-T Easy

vector 中轉形入 DH5α 與 JM110 得到 6 個與 2 個 white colonies。將這 8 個 clones 抽質體 DNA, 以

EcoRI 切, 由 Lane10 可知 DH5α 2 得到的片段較

小，非目標基因; Lane 3、11 可知 DH5α 3 是

False-positive clone；其餘 6 株皆是成功獲得的 pVrbeIp clones。

3’ RACE：

3’ RACE 產物獲得是先利用 forward primer (SBEF1)

和套組提供之UPM (Universal Primer A Mix) 對 1st

strand cDNA 進行 RACE 反應後，將第一次量化之

產物以TE buffer 稀釋 50-100 倍。再利用已得到的

VrbeIp cDNA 片 段 往 內 設 計 之 forward primer (SBEF3) 和 套 組 提 供 之 NUP (Nested Universal Primer A)，以上述稀釋過的產物為 template 再次進

行 RACE，接著將第二次 RACE 量化之產物以 TE

buffer 稀釋 50-100 倍，以 SBE F2 和套組提供之 NUP

再次進行 RACE，結果得到三條紋，其中第一條

band 約 1,200 bp、第二條 band 約 800 bp。已將此

二band 切下、純化、目前正在定序中。

五、、計畫成果自評: 、

本計畫執行方向大致與原計畫相符合，但是沒

有建立綠豆的cDNA Library 於 phage vector 而是以

1st strand cDNA 保存於溶液當中伺機利用 PCR 作

選擇性的量化，也因為目前研究以RACE 技術獲得

Fig. 5 3’ RACE 產物

Lane1:marker; Lane2: 3’RACE 產物

full length cDNA 的研究報告很多，因而我們得以順

利的選殖出partial cDNA 的 clone, 可用作

hybridization probe。本計畫在補助一年期間內, 讓 本實驗室建立了分子生物實驗的基礎, 與指導目前 碩士班二年級研究生石韻琦共同完成, 目前正進入 狀況，因此希望未來可繼續獲得經費支助，得以進 行後續將澱粉生合成酵素當作功能性基因之具有 實用價值的探討。 六、、參考文獻: 、

1. Abel,G.J.W.; Springer,F.; Willmitzer,L.; Kossmann,J. Cloning and functional analysis of a cDNA encoding a novel 139 kDa starch synthase from potato (Solanum tuberosum L.). The Plant Journal 1996, 10, 981-991.

2. Baba,T.; Nishihara,M.; Mizuno,K.; Kawasaki,T.; Shimada,H.; Kobayashi,E.; Ohnishi,S.; Tanaka,K.; Arai,Y. Identification, cDNA cloning, and gene expression of soluble starch synthase in rice (Oryza sativa L.) immature seeds. Plant Physiology 1993, 103, 565-573. 3. Baga,M.; Nair,R.B.; Repellin,A.; Scoles,G.J.; Chibbar,R.N. Isolation of a cDNA encoding a granule-bound 152-kilodalton starch- branching enzyme in wheat. Plant Physiol 2000, 124, 253-263.

4. Clark,J.R.; Robertson,M.; Alnsworth,C.C. Nucleotide sequence of a wheat (Triticum asetivum) cDNA clone encoding the waxy protein. Plant Molecular Biology 1991, 16, 1109-1101.

5. Dry,I.; Smith,A.; Edwards,A.; Bhattacharyya,M.; Dunn,P.; Martin,C. Characterization of cDNAs encoding two isoforms of granule-bound starch synthase which show differential expression in developing storage organs of pea and potato. The Plant Journal 1992, 2, 193-202. 6. Fisher,D.K.; Kim,K.N.; Gao,M.; Boyer,C.D.; Guiltinan,M.J. A cDNA encoding starch branching enzyme I from maize endosperm. Plant Physiol 1995, 108, 1313-1314.

7. Gao,M.; Fisher,D.K.; Kim,K.N.; Shannon,J.C.; Guiltinan,M.J. Independent genetic control of maize starch-branching enzymes IIa and IIb. Isolation and characterization of a Sbe2a cDNA. Plant Physiol 1997, 114, 69-78.

8. Gao,M.; Chibbar,R.N. Isolation, characterization, and expression analysis of starch synthase IIa cDNA from wheat (Triticum aestivum L.). Genome 2000, 43, 768-775.

9. Harn,C.; Knight,M.; Ramakrishnan,A.; Guan,H.; Keeling,P.L.; Wasserman,B.P. Isolation and charaterization of the zSSIIa and zSSIIb starch synthase cDNA clones from maize endosperm. Plant Molecular Biology 1998, 37, 639-649.

10. Kossmann,J.; Abel,G.J.W.; Springer,F.; Lloyd,J.R.; Willmitzer,L. Cloning and functional analysis of a cDNA encoding a starch synthase from potato (solanum tuberosum L.) that is predominantly expressed in Ieaf tissue. Planta 1999, 208, 503-511.

11. Lycett.G.W.; Delauney,A.J.; Zhao,X.C.; Gatehouse,J.A.;

Croy,R.R.D.; Boulter,D. Two cDNA clones coding for the legumin protein of Pisum sativum L., sequence repeats. Plant Mol.Biol. 1984, 3, 91-96.

12. Nair,R.B.; Baga,M.; Scoles,G.J.; Kartha,K.K.; Chibbar,R.N. Isolation, characterization and expression analysis of a starch branching enzyme IIcDNA from wheat. Plant Science (Limerick) 1997, 122, 153-163.

13. Nakamura,Y.; Yamanouchi,H. Nucleotide sequence of a cDNA encoding starch-branching enzyme,or Q-enzyme I, from rice endosperm. Plant Physiol. 1992, 199, 1265-1266.

14. Poulsen,P.; Kreiberg,J.D. Starch branching enzyme cDNA from Solanum tuberosum. Plant Physiol 1993, 102, 1053-1054. 15. Rosa A.P.B.D.L; Estrella A.H; Utsumi S; Lopez O.P Molecular characterization, cloning and structural analysis of a cDNA encoding an amaranth globulin. Plant Physiol. 1996, 149, 527-532.

16. Salehuzzaman,S.N.I.M.; Jacobsen,E.; Visser,R.G.F. Cloning, partial sequencing and expression of a cDNA coding for branching enzyme in cassava. Plant Molecular Biology 1992, 20, 809-819.

17. Salehuzzaman,S.N.I.M.; Jacobsen,E.; Visser,R.G.F. Isolation and characterization of a cDNA encoding granule-bound starch synthase in cassava (Manihot esculenta Crantz) and its antisense expression in potato. Plant Molecular Biology 1993, 23, 947-962.