嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

計畫編號：CNIC94-01

計畫名稱：化籹品原料之研發與應用(一)

執行期間：94 年 1 月 1 日至 94 年 12 月 31 日

■整合型計畫 □個別型計畫

計畫總主持人：陳榮秀 計畫主持人：

子計畫主持人：陳榮秀、楊朝成 洪偉章、林清宮 張妙玲、丁秀玉 蔡玫琳

中華民國95 年 2 月 28 日

嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

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計畫編號：CNIC94-01

計畫名稱：子計畫 1：植物萃取液在化粧品上之應用

執行期間：94 年 1 月 1 日至 94 年 12 月 31 日

■整合型計畫 □個別型計畫

計畫總主持人：陳榮秀 計畫主持人：

子計畫主持人：陳榮秀

中華民國 95 年 02 月 27 日

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一、摘要：

天然植物含有許多對化粧品有用之成分，本計畫評估植物萃取液 應用在美白、防曬、保濕及抗老化化粧品等之可行性，本計畫實施方 式採用不同植物萃取液，利用酪胺酸酶、紫外線吸收能力、DPPH、

TEAC 抗氧化方法等探討其活性及產品應用之效能。在產品評估方面 利用本校現有之膚質八合一 MPA580 檢測設備，評估這些原料在化粧 品使用之可行性，透過科學方法之評估，提供化粧品製造業或研發單 位在開發類似產品時之參考。

二、前言

中醫藥為中華民族五千年文化演進下的資產，擁有豐富的植物資

源與大量的醫學文獻古籍為支撐的依據。基於文化背景與語言的優

勢，則有利於進入這領域對歷史相關文獻的收尋與理解。而在研究發

展過程中，研究目標來源取得容易與否及成本支出程度，皆會影響研

究發展的過程與限制，故在研究所需的中草藥藥材取得容易下，且花

費成本在合理範圍內，則有助於研究試驗的運用。另外，分析市場的

商機與未來發展趨勢，傳統藥用植物或是民間草藥，即是中草藥植物

更是具有發展的潛力。除了使用上的安全性已歷經時代的佐證外，目

前全世界接受中草藥及其相關製品的人口數，更是持續增加中，年產

值更是可觀。而當各國爲中草藥及其製品開啟方便之門時，我們更應

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該善用老祖先所遺留的智慧，配合各項優勢，好好運用發揚光大。故，

當消費意識成為主導主流時，有效性與安全性已列為基本的要求，因 此，主流意識訴求的〝天然來源〞則將成為未來另一股的風潮趨勢。

中國大陸 Hu, G. 等人將菊花(Chrysanthemum ramat)及番紅花 (Crocus sativus L)之酒精萃取物調製成防曬乳液，並且與化學合成之防 曬成分(2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid)所調製成之 防曬乳液比較，結果發現植物萃取液之紫外線吸收能力雖然不如化學 防曬劑，但是其對於皮膚之保護能力卻與化學防曬劑相當，推論其原 因是因為植物萃取液中除含有紫外線吸收物質外，同時也含有其他能 使皮膚減輕發炎或曬傷的成分，所以能減少皮膚曬傷的機會，此結果 令中藥在防曬化粧品的應用燃起很大的希望。此外植物萃取液在頭髮 化妝品亦有很多用途，例如蘆薈、金盞花、洋甘菊、薑、金縷梅等，

詳細應用例子如下表：

植物名 學名 原料名稱 主要用途

蘆薈

A. barbadensis MilleAloe vera extract

保濕、滋養主要用於頭皮乾燥 金盞花

Calendula officinal

L.

Calendula extract 用於頭皮刺激症狀之鎮靜與舒 緩

洋甘菊

Matricaria chamomilla. L.

Chamomile fluid extract 具鎮靜作用，可維持頭皮之健 康

薑

Zingiber officinale Ginger root extract

促進血液循環，增進頭皮健康 與頭髮生長

金縷梅

Hamamelis virginiana L.

Hamaelis extract 具收斂作用，可改善頭皮及頭 髮油膩現象

迷迭香

Rosmarinus

Rosemary extract or oil 具收斂與抗氧化作用，可改善

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officinalis L.

頭皮油膩，促進頭髮生長

茶樹

Melaleuca

alternifolia Ch.

Tea tree oil 具抗菌及消炎作用，可改善頭 皮屑症狀

小麥胚芽 Triticum sp. Wheat germ oil 具抗氧化及柔膚作用，可改善 頭皮與頭髮乾澀

三、方法

1. 植物萃取液抗氧化能力分析：

※DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 測定法：

取 375ul 之待測 sample 乙醇溶液，再加入已配製好之 20mg/l DPPH 乙醇溶液 750ul，反應 30 分鐘後測 517nm 吸光值。

※ABTS free radical 測定法：

取 1.5ml 去離子水，再分別加入 ABTS(1000uM) 0.25ml、

H

2

O

2

(500uM)0.25ml、Peroxidase (44units/ml)0.25ml、置於暗室

中反應 1 小時後加入測試樣品 0.25ml，反應 10 分鐘後測 734nm 吸光值。

※Liposome system 測定法：

加入 1cc 的 Liposome(10mg/1cc 的 NaH

2

PO

4

-Na

2

HPO

4

緩衝

液)、1cc 的 FeCl

3

(400uM)、1cc 的待測樣品、1cc 的 Ascorbic

Acid(400uM) 均 勻 混 合 後 反 應 36 小 時 ， 再 加 入 0.1cc 的

TBHQ(10mg/1cc 甲醇)、2cc 的 TCA-TBA-HCL，100℃加熱 15

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分鐘，2000rpm 離心 10 分鐘後測 535nm 吸光值。

2. 植物萃取液美白活性評估：

※體外( in vitro )酪胺酸酶抑制活性測定

分別取定量中藥酒精萃取物，加入 70 units mushroom tyrosinase ，再加入 0.5 ml L-tyrosine (0.1 mg/ml)中，於 37 ℃ 放置 60 分鐘。利用分光光度計測量波長 475 nm 之吸收值，將 未加任何藥材之吸光值減去待測藥材之吸光值除以未加任何 藥材之吸光值再乘以 100 即為該藥材之酪胺酸酶體外活性抑 制百分比。比較中藥萃取物與美白成分之酪胺酸酶體外抑制活 性。

3. 植物萃取液防曬活性測定

※取 2 ml 之 0.01 % 稀釋液 (0.123 mg/ 5 ml 溶於 12.5 g methylene chloride, 37.5 g cyclohexane, 50 g isopropanol)置於

紫外線光譜儀測試管中，然後以紫外線光譜儀在 250~400 nm 之光源進行樣品紫外線吸收測定。

※防曬係數測定

第6 頁

※經過背景校正後，將含中藥產品 (2 mg/cm

²

)均勻塗抹在貼有

特製材質 (Transpore

^TM

tape) 之測試石英板上，再以 In vitro SPF 測試儀(型式 UV1000S)，任選五個區域測量 280~400 nm 之

紫外線的穿透率，由電腦計算各種坡長之紫外線的穿透率及 SPF 值，重複測定三次求取平均值。

4. 植物萃取液之抗老化效果評估：

將不同濃度之植物萃取液 extracts加入纖維母細胞培養液 中，3天後將細胞固定，再以膠原蛋白I及III型之抗體進行膠原蛋 白誘導能力之偵測驗，以評估植物萃取液之抗老化效果。

四、結果：

本計畫初步篩選出多種具有抗氧化能力之中草藥，例如五倍子、

丁香、牡丹皮等，另外也由 30 種中藥篩選出甘草(Glycyrrhiza glabra)、

桑枝(twig of Morus alba)、桑白皮(root-bark of Morus alba)、牡丹皮

(Paeonia suffruticosa ANDREWS)、木瓜(Chaenomeles speciosa)等具有

酪胺酸酶抑制活性，這些中藥以桑枝的抑制能力最強；在防曬方面則

由 30 種常用中藥篩選出甘草(Glycyrrhiza glabra L.)、陳皮(Citrus

reticulate Blanco) 、 黃 芩 (Scutellaria baricalensis GEORGI) 、 金 銀 花

(Lonicera japonica Thunb)、黃連(Coptis chinensis Franch)、丹參(Salvia

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miltiorrhiza Bge)、黃柏(Phellodendron chinense schneid)等具有紫外線吸

收能力，其中以黃連、黃芩及陳皮的效果最好。此外紫草在抗老化方 面也具有潛力。

五、結論：

中草藥應用在護膚、美容上流傳已久，古代人已將天然動植物應 用於化粧上：如用鳳仙花染指甲、指甲花染髮、無患子洗髮、動物油 脂護膚;後來隨著科技的進步，更能由天然物中取得有效成分，且將中 草藥應用於化粧品符合當今世界化粧品發展的潮流，加上國人有許多 人對於中草藥研發具有豐富經驗，因此有潛力能將天然物加以研究製 造出一系列無毒、無害、無副作用、具有營養和療效的化粧品，以提 昇產業水準，並將具我國祖先藥學智慧之化粧品推向國際舞台。

六、參考文獻

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嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

子計畫 2：利用簡易有機方法合成多酚類化合物應用於美白的功能

計畫類別：□個別型計畫 █整合型計畫 計畫編號：CNIC-94-01 子計畫(2)

執行期間：94 年 1 月 1 日至 94 年 12 月 31 日

總計畫主持人：陳榮秀 子計畫主持人：楊朝成

計畫參與人員：楊朝成、林小菁、張嘉苓、蔡哲秀

執行單位：化粧品科技研究所

中華民國 95 年 02 月 28 日

摘 要

本研究主要利用簡易有機反應方法合成一系列(多羥基苯亞甲基)-(羥基苯)

胺化合物，進一步以體外試驗進行抑制酪胺酸酵素的能力，並與維生素 C 及麴

酸比較其美白的功效。

關鍵字：(多羥基苯亞甲基)-(羥基苯)胺、酪胺酸酵素、美白。

Abstract

In this study we aim to originally synthesize a series of highly productive (polyhydroxy-benzylidene)-(hydroxy-phenyl)amines and observe their In vitro efficacy test for skin-whitening by the tyrosinase inhibition test.

Key words ： (polyhydroxy-benzylidene)-(hydroxy-phenyl)amines, skin-whitening, tyrosinase.

前 言

當今全球化粧品與美容相關市場高達 2 仟億美元，且該產業並以每年 7%速

度成長，超越世界GDP 成長率的兩倍之多。如此龐大商機主要來自(1)提高外在

吸引力是人類自古以來之基本需求；(2)化粧品廠商善用現代化媒體力量主攻廣 告與行銷策略；(3)化粧品科技的進展滿足消費者的心理期待，並轉為廠商行銷 手法之一環。

化粧品市場之成長主要來自產品功效之提昇，而整體護膚功效分析，與護膚 產品相關的基本功能有七項，依序分別為抗老、保濕、去角質、潔膚、消炎、美 白、防曬等，而在東方亞洲國家中以中國、日本、韓國與台灣對美白的訴求特別 強烈。因此，廠商及各研究機構投入大量研究人力與金錢致力於美白產品原料與 配方之開發。

從文獻報導中指出，1998 年 N.-H. Shin 從桑椹中萃取之 oxyresveratrol 對 Dopa oxidase 之抑制 IC50為1µM 比麴酸強許多，文中也指出，當苯環上羥基取代基轉 變成甲氧基或醣基取代時，其抑制效果極速下降。但Oxyresveratrol 不管從天然 萃 取 或 由 合 成 方 法 取 得 皆 不 易 。2002 年 S. Y. Kim 報 導 其 合 成 (3-methoxy-benzylidene)-(4’-methoxy-phenyl)amine 化合物對 Dopa oxidase 之抑制 效果較麴酸佳。因此，本論文將合成(polyhydroxy-benzylidene)-(hydroxy-phenyl) amines 一系列化合物，利用體外抑制酪胺酸酵素的效果，探討其對黑色素形成抑 制能力。

結果與討論

一、 合成(多羥基苯亞甲基)-(羥基苯)胺化合物：

利用羥醛(oxybenzaldehyde)與胺基苯酚(aminophenol)進行氮親核性加成脫 水反應後，經由 ¹H 及 ¹³C NMR 測試鑑定其結構，得到完全反應之亞胺(imine) 化合物(compound 1~15)，如表一所示。

O HO H

H₂N

OH

N HO

OH

Compound 1~14

+ PhH / Ethanol

Reflux, 1~2 days

N

R₁ R₂ R₃

R₄ R₅

R'₃ R'₂ R'₁

R1 R2 R3 R4 R5 R’1 R’2 R’3

1

OH H H H H H OH H

2

H H OH H H H OH H

3

H OH H H H H H OH

4

OH H H OH H H OH H

5

H OH H OH H OH H H

6

H OH H OH H H OH H

7

H OH H OH H H H OH

8

OH H OH H H H OH H

9

OH OH H H H H OH H

10

H OH OH H H H H OH

11

OH OH OH H H OH H H

12

OH OH OH H H H OH H

13

OH OH OH H H H H OH

14

OH H OH OH H OH H H

表一、製備(多羥基苯亞甲基)-(羥基苯)胺化合物：

二、體外抑制酪胺酸酵素之測試：主要參考文獻報導方法，利用酪胺酸在緩衝液 中，經由酪胺酸酵素催化反應，分別加入不同濃度的我們合成多酚酯類及醯

胺化合物與空白對照組測試，藉由分光光度計在540 nm 波長吸收值，計算

其對酪胺酸酵素之抑制效果。其詳細步驟如下：

材料：

a. 酪胺酸緩衝溶液(Tyrosine Buffer Solution) :

以磷酸緩衝溶液(PBS)配製 0.5 %酪胺酸(L-Tyrosine)。

b. 酪胺酸酶溶液(Tyrosinase Solution):

將酪胺酸酶(Tyrosinase) 溶於磷酸緩衝溶液(15 units/µl)，分裝後儲存於 -20℃冰箱。

方法：

a. 分別取不同濃度之待測樣品(S) 加入適量酪胺酸溶液及 5µl (75 unit) mushroom 酪胺酸酶（最終體積為 1 ml）及取相同濃度待測樣品(NT)但不 加入酪胺酸溶液只加入5µl (75 unit) mushroom 酪胺酸酶（最終體積為 1 ml）當扣色組，另外取 1ml 酪胺酸溶液同樣加入 5µl 酪胺酸酶當作正向 對照組(PC)以及 1ml 酪胺酸溶液當負向空白對照組(NC)，充分混合後置入 37℃的恆溫循環水浴箱(water bath)中 1 小時。

b. 每個樣品取 100µl 加至 96 well ELISA reader plate，利用 Anthos 2010 ELISA reader 波長 540 nm 偵測吸光值。

c. 酪胺酸酶活性的抑制率：

所測得的吸光值，利用下列公式計算其抑制率：

1. Tyrosinase inhibition(%)=(PC-NC)-(S-NT)/(PC-NC)*100%

三、體外抑制酪胺酸酵素之測試結果：

我們將14 種不同數量及位置之羥基取代亞胺化合物，分別配置不同濃度

之DMSO 溶液中(最終測試農度分別為 0.5、0.3、0.1、0.05 及 0.01 mg/ml) 作體外抑制酪胺酸酵素之測試，利用Anthos 2010 ELISA reader 波長 540 nm 偵測吸光值。並求出其之 IC50之濃度。其結果如下表所示：

0.1 mg/ml 抑制率(%) IC50(mg/ml) 0.1 mg/ml 抑制率(%) IC50(mg/ml)

1

73.12 0.011

9

73.87 0.031

2

68.56 0.025

10

75.33 0.062

3

92.48 0.094

11

86.13 0.056

4

47.15 0.208

12

84.19 0.047

5

67.70 0.051

13

95.48 0.035

6

23.01 0.777

14

>98 0.022

7

59.00 0.096

Vit.C

44.23 0.151

8

76.45 0.025

K.A.

67.11 0.094

表(二) (多羥基苯亞甲基)-(羥基苯)胺化合物體外抑制酪胺酸酵素能力：

註1. 以 Vit.C(維生素 C)及麴酸(Kojic acid K.A.)為比較試品。

四、結果與討論：

實驗結果發現(多羥基苯亞甲基)-(羥基苯)胺化合物體外抑制酪胺酸酵素能

力大部分比維生素 C 或麴酸效果佳，其抑制效果與化合物羥基取代之數量及位

置有所關連，但尚未有完整之規律性，我們將進一步合成更多化合物進行比較且 將進行黑色素細胞抑制測試，可進度探討其美白之功效並能進一步探討其細胞毒 性，期待其能應用於美白產品上。

實驗部分

一 、 合 成( 多羥基苯亞甲基)-( 羥基苯) 胺化合物一般步驟：取 10 mmol 的 Oxybenzaldehyde 於圓底瓶中，加入 10 mmol 的 aminophenol，以 20 ml 之 benzene 及 20 ml 之 ethyl alcohol 當溶劑，加熱迴流 1~2 天，反應完成後，

減壓濃縮機抽去溶劑，分別利用¹H 及¹³C NMR 測試鑑定其結構。

(2- 羥 基 苯 亞 甲 基 )-(3’- 羥 基 苯 ) 胺 (2-Hydroxy-benzylidene)- (3’-hydroxyl-phenyl) amine 2 : 橘色固體，mp.176~180

^oC，¹H NMR(200 MHz, DMSO) 　H6.78~6.87(3 H, m)，6.94~6.99(2H, m) 7.25(1H, t, J = 8Hz)，7.42(1H, ddd, J = 8, 8, 1.5Hz)，7.66(1H, dd, J = 8,15Hz) ， 8.89(1H, s)，9.74(1H, brs, OH) ， 13.16(1H, brs, OH) ; ¹³C NMR(50 MHz, DMSO) 　108.18(d) ， 112.09(d)，114.14(d)，116.61(d)，119.13(d)，119.26(s)，130.23(d)，132.63(d)，

133.26(d)，149.29(s)，158.39(s)， 160.37(s)，163.25(d).

二、體外抑制酪胺酸酵素之測試：其詳細步驟如下：

材料：先配好下列材料濃度。

b. 酪胺酸緩衝溶液(Tyrosine Buffer Solution) :

以磷酸緩衝溶液(PBS)配製 0.5 %酪胺酸(L-Tyrosine)。

b. 酪胺酸酶溶液(Tyrosinase Solution):

將酪胺酸酶(Tyrosinase) 溶於磷酸緩衝溶液(15 units/µl)，分裝後儲存於 -20℃冰箱。

方法：

a. 分別取不同濃度之待測樣品(S) 加入適量酪胺酸溶液及 5µl (75 unit) mushroom 酪胺酸酶（最終體積為 1 ml 及最終濃度分別為 0.5、0.3、0.1、

0.05 及 0.01 mg/ml）及取相同濃度待測樣品(NT)但不加入酪胺酸溶液只加 入5µl (75 unit) mushroom 酪胺酸酶（最終體積為 1 ml）當扣色組，另外 取 1ml 酪胺酸溶液同樣加入 5µl 酪胺酸酶當作正向對照組(PC)以及 1ml 酪胺酸溶液當負向空白對照組(NC)，充分混合後置入 37℃的恆溫循環水 浴箱(water bath)中 1 小時。

b. 每個樣品取 100µl 加至 96 well ELISA reader plate，利用 Anthos 2010 ELISA reader 波長 540 nm 偵測吸光值。

c. 酪胺酸酶活性的抑制率：

所測得的吸光值，利用下列公式計算其抑制率：

Tyrosinase inhibition(%)=(PC-NC)-(S-NT)/(PC-NC)*100%

謝 誌

感謝嘉南藥理科技大學及教育部經費支持，另外感謝林清宮老師老師在抑制 酪胺酸酵素實驗上之協助。

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嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

計畫編號：CNIC94-01

計畫名稱：利用生物技術法製造抗氧化酵素

執行期間：94 年 1 月 1 日至 94 年 12 月 31 日

█整合型計畫 □個別型計畫

計畫總主持人：陳榮秀 計畫主持人：

子計畫主持人：洪偉章

中華民國 95 年 2 月 27 日

一、摘要：

游離自由基( free radicals)的產生是因為氧分子或氫氧化合物 上有一些不成對的電子，例如

^

O

^2-

(superoxide anion radical) 和



OH (hydroxyl radical) 等，皆會對細胞產生毒害; 另尚有一些活 化態氧化物 (ROS, reactive oxygen species) 也會影響細胞的代謝 而造成其加速老化，如 H

²

O

²

。若能將一些抗氧化酶加入化粧品之產品 中 ， 如 超 氧 歧 化 酶 (SOD, superoxide dismutase) 、 過 氧 化 氫 酶 (Catalase)、抗壞血酸過氧化酶(APX, Ascorbate peroxidase) 等，

將可有效防止自由基及過氧化物對細胞產生嚴重的傷害而導致其老 化或死亡，目前已選殖出一段 1063 bps 長度之小球藻 SOD 基因，可 轉譯出 203 個胺基酸的蛋白質，此 SOD 酵素的分子量約為 22.3 kDa，

其 DNA 和胺基酸序列都與單胞藻有最高之相似度，分別有 73.5% 及 70.5% 之相似度。

關鍵字: 游離自由基、活化態氧化物、超氧歧化酶、過氧化氫酶、

抗壞血酸過氧化酶。

二、研究計畫內容：

（一）研究計畫之背景及目的

一般如果生物體內活性氧(activated oxygen)過多時，體內的

抗氧化系統與活性氧分子就無法維持平衡(oxidative balance)，因 而產生氧化壓力(oxidative stress)，引起老化及其他病變。天然抗 氧化劑，除了維生素C、維生素E、及類胡蘿蔔素(carotenoid)之外，

還有類黃酮(flavonoid)與多酚類(polyphenol)等亦具有抗氧化的能 力。

(a)自由基定義

自由基(free radical)含有一個或多個不成對電子的原子、分子 或離子(Halliwell and Gutteridge, 1989)，化性大部分處於極不穩 定的狀態，反應性較其他分子高，會搶奪鄰近分子的電子形成電子 對，使其達到穩定的狀態，被搶奪電子的分子則會變得不穩定，若又 具有高度的活動性則會造成連鎖反應(chain reaction)，促使自由基 的產生(Halliwell et al. , 1992)。

(b)活性氧定義

氧(oxygen)以安定的三重態氧(triplet state oxygen, 3O

²

)存 在於大氣中。氧可經由電子轉移及能量轉移活化成為反應性較強的含 氧分 子稱為 活性氧 (activated oxygen)。包括 單重態氧(singlet oxygen,

¹

O

²

)、超氧陰離子(superoxide anion

,(O2-)

、氫氧自由基 (hydroxyl radical,(OH)、過氧化氫 (hydrogen peroxide, H

²

O

²

)、

烷氧自由基(alkoxyl, RO)等。

(c)自由基與活性氧產生途徑

自由基的產生是因體內的抗氧化防禦系統未能達到平衡狀態而 造成壓力，稱作氧化壓力(oxidative stress)(Sies, 1991)。在生物 體中，抗氧化物減少、活性氧產生之增加及游離態過渡金屬的增加，

都會造成氧化壓力(Chen et al. , 1998)。外在環境中的離子輻射、

空氣污染、抽煙、化學物質及藥劑的誘發，也會產生自由基。

(d)抗氧化酵素和抗氧化物

抗氧化防禦系統(包括抗氧化物或抗氧化酵素)可以減低活性 氧及自由基的產生。抗氧化物有維生素E(vit E)、維生素C(vit C)、

胡蘿蔔素(β-carotene)、尿酸(uric acid)，植物體內的抗氧化物 質，如類黃酮、多酚類等。類黃酮的解釋是植物性黃色素，不同的結 構會產生不同的物性和化性，植物體中的類黃酮需要光線照射，種植 於溫室的植物其類黃酮含量會降低。多酚類在植物體內的功能是防禦 紫外線、抑制植物體過氧化作用。抗氧化酵素包括：超氧歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) ， 麩 胱 苷 過 氧 化 酶 (glutathione peroxidase, GSH Pxs)以及過氧化氫酶(catalase)等。SOD會進行歧 化反應(dismutation reaction)( 2O

^2-

+ 2H

⁺

→ H

²

O

²

+ O

²

)，反應 中所產生的H2O

²

會被GSH Pxs 及catalase 代謝成H

²

O。SOD 是一種金 屬酵素(metalloenzymes)，大致可分三類：銅/鋅型、鐵型及錳型SOD。

GSH Pxs 在生物體內負責清除H

²

O

²

，其將H

²

O

²

或ROOH 還原成H

²

O 或 ROH(2GSH + H

²

O

²

→ GSSG + 2H

²

O 或2GSH +ROOH→ GSSG + ROH)。

catalase 利用H

²

O

²

做雙分子的歧化作用(2H

²

O

²

→ O

²

+ 2H

²

O)。

本研究目的為選殖具有抗氧化功能的基因，進而利用生物

技術方法，大量表現與製造其抗氧化活性蛋白質，且開發應用於

化粧品產業中。

（二）研究方法、進行步驟

1.訊息 RNA (mRNA) 之萃取：

將 培 養 的 綠 藻 細 胞 加 入 含 有 4 M Guanidine isothiocyanate , 10 mM Na

²

EDTA , 50 mM Tris-HCl （pH 7.5），和 8 % β-mercaptoethanol 的裂解緩衝液（lysis buffer）中均質化，以 11,000x g 離心 15 分鐘，去除不溶的 物質，總 RNA (total RNA)以 4 M LiCl 在 4℃下過夜沈澱下 來，經過 3 M LiCl 清洗後，最後的 RNA 沈澱再以 RNA 可溶緩 衝液（0.1 % SDS , 10 mM Tris-HCl , pH 7.5 , 1 mM EDTA）

回溶，回溶的 RNA 以 phenol 和 chloroform 各萃取一次，最 後用 isopropanol 沈澱 RNA。接著將 poly（A）

⁺

RNA 以 oligo

（dT）-cellulose 管柱（Gibco BRL）層析分離下來。

2.反轉錄酶-聚合酶連鎖反應 ( RT-PCR) ：

將由上述步驟所獲得的訊息 RNA，於混合試劑中含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、75 mM KCl、3 mM MgCl

²

、20 mM DTT、

500 µM dNTPs、0.1 　g/µl BSA、100 ng/µl primer、1 U/ µl

RNase inhibitor、2.5 U/µl MMLV 逆轉錄酶，經由 MMLV 逆

轉錄酶合成第一股 cDNA，將合成之第一股 cDNA 直接當作模

版(templates)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)快速複製目標基 因之 DNA 片段，此聚合酶連鎖反應的混合試劑中含有 1X reaction buffer 、 合 成 之 第 一 股 cDNA 、 5 mM 5'- &

3'-primers、200 µM dNTPs、2.5 U Taq DNA polymerase；

其反應的條件為 94℃ 5 min, 1 cycle、94℃ 1 min , 50℃

1 min, 72℃ 2 min, 35 cycles、 72℃ 10min, 1 cycle，

經 PCR 放大之 DNA 片段以 1.5% agarose gel 進行電泳分析並 觀察實驗結果。

3 . 快速複製 5'-cDNA 端系統 ( 5'-RACE ) (Rapid Amplification of cDNA Ends kit, GIBCO BRL)

第一股 cDNA 合成是將 total RNA (1-5 µg)、FeSOD 基因特定 引子(2.5 pmoles, 5'-TCT TGC TCT CAA GGT TAC TG-3') and DEPC-處理水混合均勻後，在 70℃ 反應 10 分鐘後放在冰上 1 分鐘，然後加入下列成分混合，在 42 ℃進行反應 1 分鐘: 1×PCR

reaction buffer、25 mM MgCl

²

、10 mM dNTP mix 和 0.1M DTT，

再加 1µl (200U) SuperScript II reverse transcriptase 在 42℃ 反應 50 分鐘。經純化管柱純化後再以 70% 酒精沉澱，最 後加 50 µl 在 65℃預熱過的無菌水，以 13,000×g 離心沖提 cDNA，

取 10 µl cDNA 以 2 mM dCTP、1×tailing buffer 在 94℃反

應 3 分 鐘 ， 放 在 冰 上 1 分 鐘 再 加 1 µl terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 在 37℃反應 10 分鐘，

所得 tailed cDNA 當作以後大量複製 DNA 反應之模板。

4. 快速複製 3'-cDNA 端系統(3'-RACE system)

第一股 cDNA 合成完後，取 5 µl 第一股 cDNA 與 3 µl 之 2.5 mM dNTP、 5 µl 之 10×PCR reaction buffer、2 µl 之 10 µM

oligo-d(T)

¹⁸

primer、2µl 之 10 µM FeSOD specific primer (5'-CTG GTG GAG GAG AGC AAG AC-3') 與 0.5 µl of Taq DNA polymerase (TaKaRa)，加無菌水最後體積到達 50 µl ， PCR 反應的條件為變性溫度 94℃反應 1 分鐘 、 粘合溫度 45℃

反應 1 分鐘、延伸溫度 72℃反應 2 分鐘，共 35 個循環週期。

三、完成之成果

已選殖出一段 1063 bps 長度之小球藻 SOD 基因(見圖一)，可轉 譯出 203 個胺基酸的蛋白質，此 SOD 酵素的分子量約為 22.3 kDa，

其 DNA 和胺基酸序列都與單胞藻 Fe-SOD 有最高之相似度，分別有 73.5

% 及 70.5 % 之相似度(見圖二、三)，因此其屬於鐵型 SOD 形式。另

外，在表一可觀察到此 SOD 基因與雙子葉植物，如阿拉伯芥和菸草亦

分別有 62.6 % 與 62 % 之相似度；與單子葉植物，如稻米有 57 % 之 相似度；與細菌，如 Cyanobacteria 有 59 % 之相似度；與昆蟲，

如 Babesia bovis 有 56.5 % 之相似度；與真菌類則有 53.5 % 之 相似度。

此 SOD 基因與錳型 SOD 也有 55 % 之相似度，可見鐵型與錳型 SOD 基因有一半以上之序列相同存在，在生物之基因演化上有很高關連 性。除此之外，從以往之研究得知其重要之酵素催化區即鐵離子結合 區位於 His27、 His79、 Asp163 與 His167 等四個胺基酸上。

圖一、 The full length of cDNA sequence of FeSOD gene from C. pyrenoidosa.

Accession number is DQ183067.

The two codons in block represent the start and stop position of the open reading frame, respectively. The codons underlined are 5' and 3'-untranslated regions, and boldface of amino acid letters are the predictive positions for iron binding sites at the enzyme active center. ←, a specific primer of 5'-RACE system ; → , a specific primer of 3'-RACE system.

TCAAACGTCTGCATCGTACTTGTCACAGGTGAAAGCTCCTTGGAACAGATCCTTGTAGACTCTTCCTTT CTTCTTGCACCATG CCA TTC CAG CTG CCC CCT CTT CCG TAT GCT ATA AAT GCT TTG

M P F Q L P P L P Y A I N A L GAG CCC CAC ATG TCT CAG AAG TCG CTG GAG TTT CAT TAT GGC AAG CAC CAT CAG E P H M S Q K S L E F H Y G K H H Q ACA TAC TTG GAT AAT ATG AAC AAG CGG ATT GCT GGC AGT AAC CTT GAG AGC AAG T Y L D N M N K R I A G S N L E S K ACC CTT GAG GAG GTT ATC AAG GAG AGT TGG AAC AAT GGC AGC CCT ACA GCA GTG T L E E V I K E S W N N G S P T A V TTC AAC AAT GCT GCT CAG GTC TGG AAC CAC ACA TTC TTT TGG GAG AGC ATG AAA F N N A A Q V W N H T F F W E S M K CCC AAT GGT GGT GGT GCA CCC AGC GGC AAA CTA GCA GAG GCC ATC AAT GCA GCT P N G G G A P S G K L A E A I N A A

TCT GGC AGT CTG GAT GAC TTT AAG GCA CAG TTC AAG AAT GCA GGT GCT ACT CAG S G S L D D F K A Q F K N A G A T Q TTT GGC TCT GGC TGG GCA TGG CTT GTG ACT GAC AAG TCT GGC AAG TTG TCT ATT F G S G W A W L V T D K S G K L S I GAG AAG ACC CCC AAT GCC GTG ACA CCC CTG GTG GAG GAG AGC AAG ACA CCC ATT E K T P N A V T P L V E E S K T P I CTG ACG ATG GAT GTC TGG GAG CAT GCA TAC TAC CTG GAT GTG CAG AAC AGG AGG L T M D V W E

H

A Y Y L D V Q N R R CCT GAC TAC ATG ACG ACA TTT GTT GAC AGC CTC ATT GAC TGG GAC AAC GTG GGC P D Y M T T F V D S L I D W D N V G AAG CGC TAT GAG GCT GCA ACT GCC TGA GGCCTCAGGCAACCTAAGTTGCAACGGGGGCCTTG K R Y E A A T A ∗

TCAAGCGCTGGTGTCAGTAGCTCGGCATGCTTGAAAGCTGCTGAATATTCAGCATATTAATATGTTCAT GATGCAGTTTTGGCACCATCAATCGGTAATGCGTCAAAGGAGACAATTGAGTATAATGTGCATGCATAT GGCCCCTTGGTGGCATGTATGAGAAACATGTTTCTGTACTGCTGTCAGTACCATCATGGTCGGACAGTT GCTGCTGTCTAGGCATGGACATTACTCTGCCAGTTGCAGAGCCTACAGCCCCATGCACAGCTGCGACGT ATGATGAATCTGAGACGCACTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

圖二、A comparison of FeSOD cDNA sequences of C. pyrenoidosa (Cp-nt) with that of Chlamydomonas reinhardtii (Cr-nt). 73.5% identity in 596 nt overlap.

20 30 40 50 60 70 Cp-nt AGCTGCCCCCTCTTCCGTATGCTATAAATGCTTTGGAGCCCCACATGTCTCAGAAGTCGC ::::: ::: :: :: ::: : ::::: :::::::::::::: :: :: : : Cr-nt AGCTGAAGTCTCCCCCCTACGCTCTGGATGCTCTGGAGCCCCACATGAGCAAGCAGACCC 110 120 130 140 150 160

80 90 100 110 120 130 Cp-nt TGGAGTTTCATTATGGCAAGCACCATCAGACATACTTGGATAATATGAACAAGCGGATTG ::::::: :: : ::::::::::: : : ::: ::::::: :::::::::: : : : Cr-nt TGGAGTTCCACTGGGGCAAGCACCACCGCGCCTACGTGGATAACATGAACAAGCAGGTCG 170 180 190 200 210 220

140 150 160 170 180 190 Cp-nt CTGGCAGTAACCTTGAGAGCAAGACCCTTGAGGAGGTTATCAAGGAGAGTTGGAACAATG :::::: : ::: :: ::::: : :: :::::: : :: :: :: ::::::::::

Cr-nt CTGGCACTCCCCTGGACGGCAAGTCGCTGGAGGAGATCGTCCTGGCCAGCTGGAACAATG

230 240 250 260 270 280

200 210 220 230 240 250 Cp-nt GCAGCCCTACAGCAGTGTTCAACAATGCTGCTCAGGTCTGGAACCACACATTCTTTTGGG :: :: :: : ::::::::::: :: :::::::::::::::::::: ::::: ::::

Cr-nt GCCAGCCCACCCCGGTGTTCAACAACGCCGCTCAGGTCTGGAACCACACTTTCTTCTGGG 290 300 310 320 330 340

260 270 280 290 300 Cp-nt AGAGCATGAAACCCAATGGTGGTGGTGCACCCAGCGGCAAACTAGCAGAGGCCATCAAT- :::::::::: ::::: ::::: ::::: :::: :::: :: :: ::::::::::

Cr-nt AGAGCATGAAGCCCAACGGTGGCGGTGCCCCCACCGGCGCGCTGGCTGAGGCCATCACCC 350 360 370 380 390 400

310 320 330 340 350 360 Cp-nt GCAGCTTCTGGCAGTCTGGATGACTTTAAGGCACAGTTCAAGAATGCAGGTGCTACTCAG :: :::: ::::: ::::: : :: :::: :::::::: : :: :: :: :::

Cr-nt GCGACTTC-GGCAGCCTGGACAAGTTCAAGGAGGAGTTCAAGCAGGCTGGCATGACCCAG 410 420 430 440 450 460

370 380 390 400 410 420 Cp-nt TTTGGCTCTGGCTGGGCATGGCTTGTGACTGACAAGTCTGGCAAGTTGTCTATTGAGAAG :: :::::::::::::: ::::: : :::::: : :::::: :::: :: :::

Cr-nt TTCGGCTCTGGCTGGGCCTGGCTGAACGCCGACAAGACCGGCAAGCTGTCGATCAGCAAG 470 480 490 500 510 520

430 440 450 460 470 480 Cp-nt ACCCCCAATGCCGTGACACCCCTGGTGGAGGAGAGCAAGACACCCATTCTGACGATGGAT : ::::: ::::::: ::: ::::::::: ::::::: ::::: ::::: : :::

Cr-nt TCGCCCAACGCCGTGAACCCCGTGGTGGAGG---GCAAGACCCCCATCCTGACTGTCGAT 530 540 550 560 570 580

490 500 510 520 530 540 Cp-nt GTCTGGGAGCATGCATACTACCTGGATGTGCAGAACAGGAGGCCTGACTACATGACGACA :: :::::::: :: :::::: : :: ::::::::: : : :: :::::::: :: ::

Cr-nt GTGTGGGAGCACGCCTACTACATTGACGTGCAGAACCGCCGCCCCGACTACATCACCACC 590 600 610 620 630 640

550 560 570 580 590 600 Cp-nt TTTGTTGACAGCCTCATTGACTGGGACAACGTGGGCAAGCGCTATGAGGCTGCAAC :: : :: : :: :: :::::::: ::: : ::::::: : ::: ::

Cr-nt TTCATGGAGAAGCTGATCAACTGGGACGCCGTTGCTCAGCGCTACGCCCGTGCCAC 650 660 670 680 690

圖三、A comparison of FeSOD amino acid sequences of C. pyrenoidosa (Cp-aa) with that of Chlamydomonas reinhardtii (Cr-aa). 70.5% identity in 200 aa overlap.

40 50 60 70 80 90 Cr-aa LELKSPPYALDALEPHMSKQTLEFHWGKHHRAYVDNMNKQVAGTPLDGKSLEEIVLASWN ..: X::..:::::::...::::.::::..:.:::::..::. :..:.:::.. :::

Cp-aa FQLPPLPYAINALEPHMSQKSLEFHYGKHHQTYLDNMNKRIAGSNLESKTLEEVIKESWN 10 20 30 40 50 60

100 110 120 130 140 150 Cr-aa NGQPTPVFNNAAQVWNHTFFWESMKPNGGGAPTGALAEAITRDFGSLDKFKEEFKQAGMT ::.:: ::::::::::::::::::::::::::.: :::::. :::: :: .::.:: : Cp-aa NGSPTAVFNNAAQVWNHTFFWESMKPNGGGAPSGKLAEAINAASGSLDDFKAQFKNAGAT 70 80 90 100 110 120

160 170 180 190 200 210 Cr-aa QFGSGWAWLNADKTGKLSISKSPNAVNPVV-EGKTPILTVDVWEHAYYIDVQNRRPDYIT ::::::::: .::.::::: :.::::.:.:v^.::::::.::::::::.:::::::::.:

Cp-aa QFGSGWAWLVTDKSGKLSIEKTPNAVTPLVEESKTPILTMDVWEHAYYLDVQNRRPDYMT 130 140 150 160 170 180

220 230 Cr-aa TFMEKLINWDAVAQRYARAT ::...::.:: :..:: ::

Cp-aa TFVDSLIDWDNVGKRYEAAT 190 200

表一、 A comparison of FeSOD sequence of Chlorella pyrenoidosa with those of other species.

Species FeSOD cDNA length

(bps)

Identity (%)

Accession No (NCBI)

Chlorophyceae

Chlorella pyrenoidosa Chlamydomonas reinhardtii

Dicotyledon

Arabidopsis thaliana (type I) Arabidopsis thaliana (type III)

Nicotiana plumbaginifolia (curled-leaved tobacco )

Cinnamomum camphora (camphor tree)

Bacteria

Thermosynechococcus elongatus Nostoc commune (Cyanobacteria)

Legionella pneumophila Synechocystis sp. PCC 6803 (Cyanobacteria)

Bacteroides fragilis

Propionibacterium shermanii Sulfolobus solfataricus

Monocotyledon

Oryza sativa

Insect

Babesia bovis Plasmodium ovale

Fungi

Rhodotorula glutinis

1063 705

915 786 1035

564

603 603 579 600

834 567 636

1353

600 594

732

73.5

62.6 62.3 62

56.4

62.1 60.3 60.1 59

56.4 54.3 53

57

56.5 55.4

53.5

DQ183067 U22416

M55910 AF061852 A09032

AF084831

NP_682309 AF177945 BAA02306 NC_000911

M96560 Y09012 AAK40652

AB014056

U70131 AF139526

AF434197

四、參考文獻:

Chen, H. Y. and Yen, G. C. 1998. Free Radicals, Antioxidant Defenses and Human Health. Nutrition Sciences Jourmal. 23:105-121.

Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C., and Cross, C. E. 1992. Free radicals, antioxidants, and human disease: Where are we now? The journal of laboratory and clinical

Medicine. 119: 598-620.

Halliwell, B. and Gutteridge, J. M. C. 1989. Free Radicals in Biology and Medical.

Oxford University Press.

Mittler, R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci.

7: 405-410.

Sies, H. 1991. Natürliche und syntetische antioxidanten. Atemw Lunngenkrkh 17 Suppl 1: 16.

Wojtaszek, P. (1997) Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection.

Biochem. J. 322: 681-692.

附錄圖一、(a) Interrelationships between molecular oxygen and ROS generated in reactions likely to occur in living plant cells and (b) chemical equations depicting major reactions determining the fate and possible interconversions of reactive oxygen species in plants. (Wojtaszek, 1997)

附錄圖二

附錄圖三

嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

計畫編號：CNIC94-01

計畫名稱：子計畫 4：天然抗氧化化粧品原料的開發

執行期間：94 年 1 月 1 日至 94 年 12 月 31 日

■整合型計畫 □個別型計畫

計畫總主持人：陳榮秀 計畫主持人：

子計畫主持人：林清宮

中華民國 95 年 02 月 27 日

- 1 -

一、摘要：

天然物中具有黃酮素或類黃酮的成分，這些成分具有很好之 抗氧化能力，為了能將類似成分應用於抗老化化粧品，本計畫擬 針對中草藥粗萃液進行各項抗氧化方法之評估，方法包含 DPPH、

TEAC、NO 清除及 SOD 活性等。利用本計畫之研究不但能快速

尋找有用的抗老化成分，同時期待能將中草藥應用在於抗老化化 粧品之開發。

二、前言

近幾年，中草藥植物的開發與運用，已成為世界性的發展趨

勢。主要為發展先進的萃取技術與分析技術，搭配科學性的評估

與研究，探討中草藥植物的生物活性與藥理作用等。 而 世 界

各國在疾病的治療中，植物原料仍是很重要的資源。植物原料經

由生藥學的研究，可以發展出新的治療藥劑。其中，中草藥溫和

作用的特性常被運用在對抗微生物、抗濾過性病毒及抗氧化方

面。不同臨床應用的報導顯示，中草藥中的成分如：chlorogenic

acid、flavonoids、pentacyclic、triterpenes…等，有抗腫瘤和抗突變

等作用。

⁽¹²⁾

除此之外，植物的藥用功效還包括增加心臟血管的健

康、微血管的承受力、組織的健全、美化皮膚的外觀與增強免疫

系統機能、減少動脈硬化、癌症、關節炎和腸胃疾病等風險。當

- 2 -

然以研究的方向而言，涵蓋各領域，包括：自由基清除能力的探 討、抗發炎作用的研究、抑制微生物的能力、抗腫瘤、癌症的治 療、提升免疫能力、抗胃潰瘍作用、糖尿病的治療、抗憂鬱等各 種身體出現的疾病。故，研究的結果常被應用在醫藥、食品、化 妝品、保健維護等領域。而最終目的則在預防與處理各種疾病、

提升生活品質。在 2004 年 Renu Khanna-Chopra 等人，提出由植物 產生的抗氧化酵素與其代謝產物，運用在清除及防禦活性氧的傷 害與改善氧化壓力方面，具有很好的發展空間。而在植物中蘊含 三種型態的 SOD，依金屬輔因子的不同有所區別。其中在葉綠體、

細胞質液、過氧化體與乙醛酸小體中可發現 Cu/Zn SOD；而 Fe SOD 主要發現在葉綠體中；Mn SOD 則發現存在粒線體與過氧化體 中。同年 Y. Z. Zhu 等人，更具體提出中草藥萃取液，具有清除氧 自由基的論點，清除作用類似 SOD，其中川芎〈Rhizoma ligustici〉

具有類似 SOD 活性為每克 2000 units、益母草〈Herba leomuri〉類 似 SOD 的活性則為每克 1800 units。因此，天然產物在提高生物 體抗氧化作用及經由非酵素型中和活性氧途徑方面，扮演很重要 的角色。

除此之外，根據文獻資料顯示，許多中草藥針對不同屬性的

自由基，分別有不同強弱的清除能力。如：貫葉連翹〈Hypericum

- 3 -

perforatum L.〉萃取液可有效清除 DPPH 自由基與超氧陰離子，抑

制小鼠肝臟微粒體的脂質過氧化。蓮花葉〈Nelumbo nucifera Gertn.〉甲醇萃取液可清除氫氧自由基及降低金屬離子鍵結的能 力，進而達到保護細胞的作用。枸杞〈Lycium barbarum〉萃取液 則對超氧陰離子有很強的清除作用，可預防脂質過氧化。黃芩

〈Scutellaria baicalensis〉萃取液可直接清除過氧化氫、氫氧自由 基 及 超 氧 陰 離 子 。 而 用 80 % 的 甲 醇 萃 黃 牛 木 〈 Cratoxylum cochinchinense〉，經 TEAC 等試驗結果顯示，相對於 Trolox 其具 有很強的抗氧化能力，且針對超氧陰離子也有清除的作用。白花 蛇舌草〈Hedyotis diffusa〉與繖花龍吐珠〈Hedyotis corymbosa〉萃 取 液 發 現 具 有 清 除 超 氧 陰 離 子 的 能 力 ， 而 粟 米 草 〈 Mollugo

pentaphylla〉則有清除氫氧自由基的作用，若針對抗脂質過氧化

能 力 的 評 估 ， 則 白 花 蛇 舌 草 > 繖 花 龍 吐 珠 > 粟 米 草 。 欖 仁 樹

〈Terminalia catappa〉萃取液在抗氧化方面試驗結果，顯示可預防 老鼠肝臟脂質過氧化，並具有類似 SOD 的活性每克有 2.57×10

⁵

unit。 另外，台灣金線連〈Anoectochilus formosanus〉萃取液在

體內、體外的試驗，顯示能清除超氧陰離子與氫氧自由基及抑制 低密度脂蛋白的氧化作用。 而運用甲醇為溶劑萃取大根老鸛草

〈Geranium macrorrhizum〉及金露梅〈Potentilla fruticosa〉的萃取

- 4 -

液，在 DPPH 與 TEAC 的分析中，也顯示很強的清除 DPPH 自由 基及 ABTS

⁺

自由基的能力。其他種類的中草藥萃取液如：山楂

〈 Crataegus pinnatifida 〉、 兔 絲 子 〈 Cuscuta chinensis 〉、 鎖 陽

〈Cynomorium songaricum〉 、箭葉淫羊藿〈Epimedium sagittatum〉 ， 覆盆子〈Rubus chingii〉等，在抗氧化方面試驗，其抗氧化能力皆 比 Vitamin E 強。植物組織中蘊含豐富不同具有抗氧化作用的成 分，包括：多酚類成分〈flavonoids、phenolic acid〉、氮類成分

〈alkaloids、chlorophyll derivatives、amino acids、amines〉、類胡

蘿蔔素、木質素、松稀油等，根據文獻報告指出這些成分有抗氧 化作用及抑制鏈鎖反應的開始或擴散。

三、方法

一、中草藥萃取：

1. 將確認過之中草藥切細。

2. 分別稱100 克加入2000 ml 純乙醇或適當溶劑，浸泡3 小時 3. 加熱refluxing 萃取三次、過濾

4. 真空濃縮

5. 乾燥，稱重備用

二、 中草藥 extracts 抗氧化能力分析：

※DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 測定法：

- 5 -

取 375ul 之待測 sample 乙醇溶液，再加入已配製好之 20mg/l DPPH 乙醇溶液 750ul，反應 30 分鐘後測 517nm 吸光 值。

※ABTS free radical 測定法：

取 1.5ml 去離子水，再分別加入 ABTS(1000uM) 0.25ml、

H

2

O

2

(500uM)0.25ml、Peroxidase (44units/ml)0.25ml、置於暗室

中反應 1 小時後加入測試樣品 0.25ml，反應 10 分鐘後測 734nm 吸光值。

※Liposome system 測定法：

加入 1cc 的 Liposome(10mg/1cc 的 NaH

2

PO

4

-Na

2

HPO

4

緩衝 液)、1cc 的 FeCl

3

(400uM)、1cc 的待測樣品、1cc 的 Ascorbic Acid(400uM) 均 勻 混 合 後 反 應 36 小 時 ， 再 加 入 0.1cc 的 TBHQ(10mg/1cc 甲醇)、2cc 的 TCA-TBA-HCL，100℃加熱 15 分鐘，2000rpm 離心 10 分鐘後測 535nm 吸光值。

四、結果

中草藥萃取液抗氧化試驗結果 TCE 萃取液在抗氧化試驗方 面有不錯的自由基清除反應，其清除 ABTS 陽離子自由基能力 SC

50

為 0.92 mg/ml、清除 DPPH 自由基的 SC

50

為 0.96 mg/ml、

清除 Nitric oxide 自由基的 SC

50

為 0.78 mg/ml、清除氫氧自由基

- 6 -

的 SC

50

為 0.55 mg/ml。因此，進一步探討 TCE 萃取液清除超氧 陰離子的能力，即為類似 SOD 的活性，經由實驗結果顯示，

TCE 萃取液中含有類似 SOD 的活性為 5385.04 U/mg。另外，

GCE 萃取液雖只在清除氫氧自由基的反應上有 SC

50

為 0.57 mg/ml 的能力，但是其在類似 SOD 的活性試驗方面卻高達 15885.42 U/mg 的活性含量(data not shown)。至於 PME 萃取液 則是在清除 Nitric oxide 自由基與氫氧自由基的能力表現較突 出，其 SC

50

分別為 0.60 mg/ml 與 0.69 mg/ml。而 CFE 萃取液則 是在氫氧自由基方面有 SC

50

為 0.64 mg/ml 的清除能力。

Comparison of SC

50

values. ( mg / mL )

Scavenging activity of assay methods

ABTS DPPH Nitric oxide Hydroxyl Radical

Samples ( ABTS

⁺

) ( DPPH

^‧

) ( NO ) ( HO

^‧

)

Sample1 1.07 1.09 0.60 0.69

Sample2 0.92 0.96 0.78 0.55

Sample3 1.84 1.20 1.65 0.64

Sample4 1.50 1.06 1.61 0.57

Trolox 1.24 ND ND ND

Vitamin E ND 1.06 ND ND

Vitamin C ND ND ND 0.56

ND, not done

- 7 -

五、結論

近年來化粧品市場流行天然植物風潮，許多國際大廠紛紛推 出以植物萃取為主的化粧品，消費者的反應也相當良好，因此若 國內廠商能鎖定中草藥化粧品推出具地方或民族特色的化粧品，

相信此特色能使國內廠商在國際舞台佔有一席之地。

以藥品開發研究而言，需投入很長的時間、大量的人力及龐 大的資金，所以經濟部技術處中草藥推動辦公室提出，建議廠商 在經營策略的規劃方向中，應將計畫分為短程及長程的考量。以 短程研發成果，厚植長程實力。而短程方面以進入消費者市場、

加速新產品開發、取得現金流量三項為目標。從中藥健康食品、

中藥藥貼布、中藥化妝品、中藥藥酒等具潛力且易開發的產品切

入市場，不失為一個可行的方向。其中，含中藥的化妝品將成為

新一代天然化妝品配方的趨勢。因中草藥萃取液蘊含豐富的活性

成分，有益皮膚的協調作用，而外用含有中草藥萃取液的化粧

品，則可增加肌膚的保護作用，對抗內、外因性的傷害，如：人

蔘萃取液據研究報告顯示可促進血液循環、激勵細胞再生，使皮

膚的新陳代謝正常化、及增加皮膚的保水能力和柔軟度、減緩皺

紋現象與提高膚色的白皙度等。而人蔘成份中的人蔘皂素更可清

除自由基與抑制脂質的過氧化，進而達到抗老的功效。

- 8 -

六、參考文獻

1. W. L.Li , et al.〝Natural medicines used ih the traditional Chinese medical system for therapy of diabetes mellitus〞, Journal of Ethnopharmacology 92 , 1-21 , 2004.

2. Yeong-Deug Yi , et al.〝An Overview of Traditional Chinese Herbal Formulae and a Proposal of a New Code System for Expressing the Formula Titles〞, Advance Access Publication 4 , 125-132 , 2004.

3. Andrew P. Winterstein , et al. 〝 Herbal Supplements : Considerations for the Athletic Trainer〞, Journal of Athletic Training 36 (4) , 425-432 , 2001.

4. Nobutaka Suzuki , et al.〝Complementary and Alternative Medicine : a Japanese Perspective 〞 , Advance Access Publication 21 , 113-118 , 2004.

5. Talal Aburjai , et al. 〝 Plants Used in Cosmetics〞,Phytotherapy research 17 , 987-1000 , 2003.

6. Hu Fenglin , et al.〝Free radical scavenging activity of extract prepared from fresh leaves of selected Chinese medicinal plants〞, Fitoterapia 75 , 14-23 , 2004.

7. Rachel W. Li , et al.〝Anti-inflammatory activity of Chinese

- 9 -

medicinal vine plants〞,Journal of Ethnopharmacology 85 , 61-67 , 2003.

8. Pavel Dra sar , et al.〝Recent advances in analysis of Chinese

medical plants and traditional medicines 〞 ,Journal of

Chromatography B 812 , 3-21 , 2004.

嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

計畫編號：CNIC94-01(子計畫 5)

計畫名稱：探討不同化粧品基劑對果酸化粧品安定性的影響

執行期間：94 年 1 月 1 日至 94 年 12 月 31 日

□整合型計畫 □個別型計畫

計畫總主持人：陳榮秀 計畫主持人：

子計畫主持人：張妙玲

一、中文摘要

本研究主要探討果酸 Alpha Hydroxy Acids(AHAs)乳化護膚產品中，其配 方之組成成份的改變對果酸乳化產品的流變性(rheology)、黏度(viscosity)、

酸鹼度值(pH)、導電度(electrical conducitivity)、粒徑(particle size)等 物性隨著時間變化的安定性影響。

經過實驗結果顯示，在 Steareth 2/Steareth 21，GMS／Amphisol K，

Span/Tween 及 Covacream 的界面活性劑中，以 Steareth 2/Steareth 21 可以得 到較佳穩定的果酸乳液，且在產品中最佳含量為 5%( Steareth 2/Steareth 21 的比例用量為 3/2)。攪拌速度則以 600rpm 較 300rpm 佳，而速度愈快，產品的 粒徑愈小。另外，脂質的種頪及含量也大大的影響產品的安定性，例如，Finsolv TN 添加到此界面活性劑系統時，都使產品的安定性大大的降低，然而 Stearic acid 及 Cetyl alcohol 的混合使用，則大大的提高安定性。而乳化時，組成成 份的添加順序，則以油相成份先與界面活性劑混合均勻後，再慢慢添加進水相中 的乳化程序，可以得到最穩定的結果。當果酸濃度增加時，產品的不穩定會提高。

綜合以上結果，所得最佳果酸配方為: Steareth-72 3，Steareth-721 2，CCT 2 Stearic acid 1Cetyl alcohol 1 Squalane 3 Mineral oil 5 Propylene Glycol 5 Veegum 0.3 Glycolic acid 5 Tricthanolamine 5 Germaben 0.8 Pure Water 66.9。

二、緣由與目的

果酸是化妝品常用的原料，許多不同的果酸(Alpha-hydroxy acids,簡稱 AHA) 如甘醇酸(glycolic acid) ，乳酸(lactic acid) ，檸檬酸(citric acid)及酒石酸(tartaric acid)等[1]，由於它們具有角質剝除(desquamation)作用，降低皮膚的無感蒸泄 (transepidermal water loss，簡稱 TEWL)與促進皮膚的美白作用[2-5]，所以常被用 來處理角質問題與光老化傷害(photoaging)之皮膚[6-8]。這些問題皮膚所呈現的 症狀包括角質粗糙(Rough)，皺紋(Wrinkles)，斑點（Spots or freckles），色素沈澱 (pigmentation)[9~11]等。因而他們常被添加在不同的化妝品劑型配方中像乳液 (lotion)，乳霜(cream)，凝膠(gel)和精華液(essense)[12]等，以因應臨床治療及市 場的需求。然而果酸的酸鹼值常使產品產生不穩定的現象，而使產品降低經濟價 值與有效性，因此如何產製高穩定性的果酸產品是重要。眾所皆知,化妝品的不 穩定性包含沉澱、懸浮、變色、異味、粘稠度減稀或增加等現象［13］，這些現 象的產生可能源自於界面活性劑的選用不當、乳化球粒徑分佈、乳化條件不佳、

有效成份的分解或乳化基劑之間的基質效應之干擾等等［14-16］。雖然己有一些

特定系統之穩定的果酸製品被研發且發表［17-18］。但其結果畢竟未能涵蓋或代

表其他不同界面活性劑系統及化妝品基劑之諸多產品的穩定性，且從市售化妝品 製品之分析中，我們發現粒徑的分佈及大小並不是惟一使乳化安定的條件。為進 一步了解乳化粒徑如何影響化妝品產品的穩定性，本計劃將選定不同的界面活性 劑並潻加其各種基劑進行乳化，再將乳化製品以雷射粒徑分佈儀分析及配合加速 老化的方法，有系統的建立一糸列乳化粒分佈與乳化穩定性之相關性，以做為化

妝品配方設計之參考。

三.結果與討論

3-1 界面活性劑種類的選擇：

改變界面活性劑種類，以添加 5% Glycolic acid 果酸成份為基礎調製表 3-1 之果酸配方產品，結果發現以 Steareth-2/ Steareth-21 是最具安定性,故為最 佳的界面活性劑。

表 3-1 界面活性劑的比較 Comparison of Surfactants

Materials(g/100g) Formulation (systems，600rpm) (A)倒入(B+5%甘醇酸)後加(C) 1 2 3 4 5 6 (A)油相

Brij 72 (Steareth-2) 3g 3g 2g - - - Brij 721 (Steareth-21) 2g 2g 2g - - - GMS - - - 1g - - Amphisol k - - - 0.5g - - Tween 40 - - - - 2.5g - Span 60 - - - - 2.5g -

Covacream(冷製) - - - - - 5g Arlamol E - - - - - 2g Dimethicon - - - - - 5g Caprylic/Capric Triglyceride 5g 2g 2g 5g - 7g Stearic acid 2g 1g 1g 0.5g - - Cetyl alcohol 2g 1g 1g 0.5g - - Squalane 7g 3g 3g - 7g 8g Mineral 6g 5g 5g - 8g 2g Germaben II 0.8g 0.8g 0.8g 0.8g 0.8g 0.8g (B)水相(Water to 100g)

Propylene Glycol (PG) 5g 5g 5g 5g 5g 5g Veegum 0.3g 0.3g 0.3g - 0.6g - Hydroxyethylcellulose (HEC) - - - 0.6g - - (C) 酸鹼度調節劑

Triethanolamine (TEA) 5g 5g 5g 5g 5g 5g

※經 45℃加速老化穩定天數 45 天 40 天 35 天 0 天 0 天 0 天

3-2 油相成份與果酸濃度對產品穩定性之影響：

3-2-1 Finsolv TN 與果酸濃度高低之影響:

L 由表 3-2-1 的結果可知，Finsolv TN 油脂存在此系統中時，引起產品

極大的不穩定，而隨著果酸濃度的增加，產品的不穩定也增加，以 5%的果酸含 量可得到較佳的安定。

表 3-2-1 選擇 Brij 其基劑 Finsolv TN 成分影響穩定天數的效應 配方 A B C D Steareth-2 (Brij72) 3g 3g 3g 3g Steareth-21(Brij721) 2g 2g 2g 2g

Fi nsolv TN 0g 5g 5g 5g

Squalane 7g 7g 7g 7g Mineral oil 8g 8g 8g 8g Propylene Glycol 5g 5g 5g 5g Veegum 0.6g 0.6g 0.6g 0.6g

Glycolic Acid 5% 2% 5% 10%

Triethanolamine (TEA) 5g 5g 5g 5g

穩定天數(加速老化 45℃) 45 天 1 天 1 天 1 天

3-2-2 Stearic acid 及 Cetyl alcohol 與果酸影響:

表 3-2-2 是 Stearic acid 及 Cetyl alcohol 成分對產品的影響，結 果以 1%及 2%的可得較好的安定性，但由於 2%添加的產品有較秥滯性的 觸感，故選擇 1%為產品之添加量。

表 3-2-2 Stearic acid 及 Cetyl alcohol 成分對產品穩定性之影響 配方 A B C D E

Steareth-2 (Brij72) 3g 3g 3g 3g 3g

Steareth-21(Brij721) 2g 2g 2g 2g 2g C.C.T. 2g 2g 2g 2g 2g

Germaben II 0.8g 0.8g 0.8g 0.8g 0.8g

Stearic acid 0g 0.1g 0.5g 1g 2g

Cetyl alcohol 0g 0.1g 0.5g 1g 2g

Squalane 3g 3g 3g 3g 3g Mineral oil 5g 5g 5g 5g 5g

Propylene Glycol 5g 5g 5g 5g 5g Veegum 0.3g 0.3g 0.3g 0.3g 0.3g Glycolic Acid 5% 5% 5% 5% 5%

Triethanolamine 5g 5g 5g 5g 5g 穩定天數(加速老化 45℃) 1 天 2 天 4 天 40 天 42 天

3-3 攪拌速度及油水相添加順序對產品穩定性之影響：

3-3-1 攪拌速度之影響:

表 3-3-1 是攪拌速度對產品之安定性影響，以 600rpm 以上的攪拌速度可 得較小的粒徑及較佳的穩定天數。

表 3-3-1 乳化條件攪拌速度的影響

配方 A(5%AHAs) B(10%AHAs) C(15%AHAs)

Steareth-2 (Brij72) 2g 2g 2g Steareth-21(Brij721) 2g 2g 2g C.C.T. 2g 2g 2g Germaben II 0.8g 0.8g 0.8g Stearic acid 1g 1g 1g Cetyl alcohol 1g 1g 1g

Squalane 3g 3g 3g Mineral oil 5g 5g 5g Propylene Glycol 5g 5g 5g Veegum 0.3g 0.3g 0.3g

Glycolic Acid 2.5% 5% 7.5%

Lactate 2.5% 5% 7.5%

↙ ↘ ↙ ↘ ↙ ↘

攪拌速度(rpm ) 300 600 300 600 300 600

PH 值 3.62 3.62 3.59 3.62 3.58 3.59

粒徑(d0.5)室溫 18.225 15.413 16.75 10.639 15.688 7.45 穩定天數(加速老化 45℃)20 天 25 天 7 天 10 天 5 天 7 天

3-3-2 油水相添加順序之影響:

圖３－１顯示當乳化之添加順序改變時，產品之穩定性差異，其中以（c）

之乳化順序，即油相成份先與界面活性劑混合均勻後，再慢慢加進水相中的乳 化程乳化程序，可以得到最穩定的結果。

圖 3-1 利用相分離凝乳(creaming)來判定油水相添加順序不同經之影響

3-4 最佳穩定性的配方：

綜合以上結果，所得最佳果酸配方為: Steareth-72 3，Steareth-721 2，

CCT 2 Stearic acid 1Cetyl alcohol 1 Squalane 3 Mineral oil 5 Propylene Glycol 5 Veegum 0.3 Glycolic acid 5 Tricthanolamine 5 Germaben 0.8 Pure Water 66.9。此產品之酸鹼值及導電度與粒徑的變化均在很小，且在 45 C 加速 老化的條件下，可穩定 40 天以上。

四.參考文獻:

1.Shinomiya,Tatsuroh; Hikima, Toshio; Sakamaki, Taekishi. FRAGRANED JOURNAL(1997), 25(9), 49-55.

0 2 4 6 8 10 12 14

10 20 25 30 35 40

time/days

% water resolved

a b c d e f h