長期水旱輪作在不同施肥處理對水稻及玉米田土壤微生物多樣性及功能之研究Analysis of Soil Microbial Diversity and Function in Rice and Maize Fields under Long-term Upland and Lowland Rotational System in Different Fertilization Treatments

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(1)長期水旱輪作在不同施肥處理對水稻及玉米田土壤微生物多樣性及功能之研究楊秋忠 1,*、黃欣怡 2、林詩耀 3、林毓雯 4. 摘要本研究計畫之試驗田區長期以水稻與玉米進行輪作，自 1995 年至今逾 20 年之久，田區施肥管理策略以多種處理(化肥、堆肥、綠肥、泥炭及對照組)進行逢機完全區集設計(RCBD)，在不同生長時期採集土壤分析。碳源利用測定結果顯示，堆肥加 2/3 化學氮肥處理組中慢生型微生物族群數量多於其他處理，而快生型微生物族群數量則少於其他處理，微生物活性 (AWCD) 與多樣性 (Shannon) 皆為傳統化肥處理最低。PacBio 16S rDNA 之全長定序及分析結果可觀察到，微生物之組成受到作物之影響大於處理。對照組處理的 Chao 1 值 (豐富度) 受到採樣時間點的影響較大。在玉米期時，各處理間之 Shannon 值差異較大，水稻期各處理差異較小，傳統化肥組處理之 Shannon 值隨採樣期變動最大，堆肥加 2/3 化肥組處理次之。主成分分析圖中顯示，樣品大致以作物種類分成兩大群，與親緣關係圖 UPGMA 結果相似，但玉米齊膝期時各處理微生物相之差異較大。加權後的貝塔指標顯示，對照組與堆肥添加 1/3 化肥的處理組有較高的生物多樣性。綠肥添加 1/3 化肥與泥炭添加 1/3 化肥的處理組，其生物多樣性相似度較高。細菌的種類及數量 OTU heatmap 圖顯示，栽種玉米田區的土壤樣品，其生物多樣性的相對豐度明顯高於栽種水稻的土壤。水稻及玉米產量中，對照組水稻收穫最低，化肥及堆肥加化學氮肥的處理，作物收穫有較高的趨勢且兩者產量接近；玉 * 1 2 3 4. 通訊作者：[email protected] 中央研究院院士、國立中興大學土壤環境科學系教授。台灣台中市。國立中興大學土壤環境科學系研究助理。台灣台中市。國立中興大學土壤環境科學系博士後研究員。台灣台中市。農委會農業試驗所農業化學組副研究員。台灣台中市。 1.

(2) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 米收穫情況與水稻相似。堆肥處理之土壤，在水稻及玉米產量，皆與化肥處理無顯著差異，甚至有些年度水稻產量高過化肥處理。關鍵詞：水稻、玉米、水旱輪作、微生物、固氮活性、微生物族群、生物多樣性、 PacBio。. 前言農業生態系物質循環中土壤微生物扮演重要角色，土壤微生物參與各種養分代謝以維持土壤地力外，並與農作物生產量與品質有密切相關 (楊 2007) 。傳統研究微生物多樣性方法是觀察微生物在培養基上生長菌落的多樣性，但對未能在培養基上培養生長的微生物就無法知曉，近年來由於分子生物學的技術有顯著進展，在農業生態系土壤微生物研究中，未能培養之微生物及長期不同田間施肥管理與水旱輪作系統下對微生物群落影響之研究仍甚為缺乏，實有必要建立有效之分子生物學的技術，以便建立長期生態系微生物的多樣性之基本資料及評估。土壤中可經培養的微生物僅在 1%以下 (Atlas & Bartha 1998) ，即有大量不可培養微生物，可利用次世代定序技術 (NGS) 分析建立土壤基因型圖譜之資料，同時配合土壤理化性質、土壤固氮活性、生化反應分析碳源利用率等，可建構出土壤微生物與土壤肥力及土壤生產力之網絡關係。從土壤直接萃取微生物 DNA，經 PCR 結合次世代定序技術對細菌之 16S rRNA 基因分析微生物族群結構 (Weinstock 2012)，可瞭解受到水旱輪作栽培生態系的土壤微生物多樣性，及探討不同肥料處理對農田土壤中微生物種類之影響。. 材料與方法一、長期水旱輪作之水稻及玉米生態系田區：長期水旱田輪作之農業生態系田區已在 1995 年 8 月開始建立至今，此栽培系統每年均依照所設計相同之處理方式，其土壤、作物、肥料及田間設計如下： (一)土壤：田間試驗地點於台中縣霧峰鄉行政院農委會農業試驗所之 35 號試驗田，土壤為砂頁岩非石灰性新沖積土，七塊厝系，屬壤質土壤，1995 年 8 月試驗開始時， 2.

(3) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 測定之土壤性質為：pH (1:1) 為 5.3，陽離子交換容量為 7.4 cmol kg-1，交換性鉀、鈣、鎂、鋁、鋅、錳、銅及鐵分別為 74、625、149、0.23、4.3、62、4.6 與 891 mg kg-1，Bray No. 1 法可萃取磷為 14.8 mg kg-1。 (二) 水旱田選用相同之水稻及玉米作物品系如下： 1. 水稻 (Oryza sativa L., cv. TN No.67) ：台農 67 號水稻，於每年第一期栽種。 2. 玉米 (Zea mays L., cv. TN No.1) ：台農 1 號飼料玉米，於每年第二期栽種。 (三) 肥料：每年水旱田施用相同之肥料係依「作物施肥手冊」之推薦用量，種類及施肥量如下： 1. 水稻施用三要素肥料之 N-P2O5-K2O 用量為 120-60-60 kg/ha，所使用之化學肥料分別為硫酸銨、過磷酸鈣及氯化鉀，有機資材為： (1) 豬糞堆肥、 (2) 綠肥一期水稻採用埃及三葉草、二期玉米採用田菁 (因不宜冬天生長，春作水稻只能用埃及三葉草) 及 (3) 泥炭。 2. 玉米施用三要素肥料之用量 N-P2O5-K2O 為 140-80-80 kg/ha，所使用之化學肥料有尿素、過磷酸鈣與氯化鉀，有機資材為台灣農民常用之豬糞堆肥、田菁 (Sesbania roxburghii Merr)、埃及三葉草 (Trifolium alexandrinum) 及不易分解之泥炭 (peat) 。 (四) 田間設計處理：田間處理為 7 種施肥處理 (各 4 重複) 採用 RCBD 設計，磷及鉀肥均為同量，各處理如下： 1. 對照：自然地力之對照，不施任何肥料、資材。 2. 傳統化學肥料區：以施肥手冊推薦化學肥料施用量，做為有機質肥料之相對含氮量比較。 3. 堆肥 + N0：有機質堆肥處理，只有堆肥之氮，不加化學 N。 4. 堆肥 + N1：有機質堆肥處理，即堆肥外，加化學 N 肥之 1/3 量。 5. 堆肥 + N2：有機質堆肥處理，即堆肥外，加化學 N 肥之 2/3 量。 6. 綠肥 + N1：即綠肥外 (夏季以田菁、冬季以埃及三葉草)，加 1/3 化學 N 肥。 7. 泥炭 + N1：即泥炭外，加化學 N 肥之 1/3 量。二、土壤及水稻及玉米樣品採集及處理土壤採集及分析：依水稻之分蘗期與結穗期，玉米之齊膝期與開花期各別採樣二次。每處理每重複採 5 點土樣 (表土 10 cm) 混合後裝於樣品袋中帶回實驗 3.

(4) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 室，於室溫下風乾後過篩 (2 mm 篩網) 並混合均勻，將土壤樣品放入樣品袋中保存於 4℃冰箱中待用分析 (Krsek & Wellington 1999)。三、細菌及真菌群落結構分析 (一) 菌種培養基製備與培養條件：分別製備細菌及真菌分離常見之 nutrient agar (NA, HiMedia) 及 potato dextrose agar (PDA, Difco)培養基，用以分離土樣之微生物。取樣品後利用無菌水進行 10 倍連續稀釋，並將稀釋液均勻塗抹於平板培養基上，於 30℃培養 3-7 天。 (二) 菌落挑選、基因型分析及菌種鑑定： (1) 菌落挑選：於 NA 平板培養基上，將可代表各處理樣品中之可培養細菌，針對不同處理挑選菌落型態各異之菌株，菌落型態則依顏色、形狀、邊緣、皺摺等特性予以區別。 (2) 可培養菌種鑑定：將上述可代表不同處理之細菌菌株進行菌種鑑定，以瞭解其分類地位 (Shen et al. 2005)。本研究利用 MO BIO 公司所提供的微生物染色體 DNA 萃取套組 (UltraClean™ Microbial Genomic DNA Isolation Kit, MO BIO Laboratories, Inc., USA) 進行 DNA 萃取。以 16S rRNA 基因泛用性引子 1F 與 9R，利用可控溫之熱循環機進行 PCR 增殖。PCR 所得之 DNA 產物進行定序。將定序之 DNA 序列與 GenBank 等資料庫中已知菌種序列進行比對，所得結果即為菌種鑑定之依據。 (3) 利用核酸偵測法分析細菌族群多樣性：每一重複取 50 g 土壤，同處理共 4 重複 200 g 土壤混合後，去除植物殘體、石礫等雜質，加入 70 mL 無菌水，使土壤樣品呈泥漿狀，以離心球磨式粉碎均質機 (S100, Retsch®) 進行樣品均質化，離心轉速為 250 rpm、時間為 20 min。利用 MO BIO 套組萃取微生物 DNA，進行下列實驗： a. 將抽取之土壤微生物 DNA 以 GC-4F、5R 引子進行 PCR 擴增 16S rRNA 基因片段 (產物大小介於 400–500 鹼基對)，再以變性梯度膠體電泳 (DcodeTM Universal Mutation Detcetion System, Biorad, DGGE)，使用 6 % 之聚丙烯醯胺膠片，變性梯度 45–65%，以 60℃、60 V 之反應條件進行電泳 16 h。區分不同處理間的微生物族群，電泳膠片以 ErBt 染色後 4.

(5) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 以影像擷取系統拍照並以軟體 (Kodak 1D 3.5, Kodak, USA) 分析不可培養之細菌族群多樣性。 b. 土壤微生物族群高通量序列分析：本研究利用 MO BIO 公司所提供的土壤微生物染色體 DNA 萃取套組 (UltraClean™ PowerSoil DNA Isolation Kit, MO BIO Laboratories, Inc., USA) 進行採樣土壤 DNA 萃取。委託業者進行第三代定序 PacBio (Pacific Bioscience) 技術之高通量序列分析，分析序列區間為高變異區 V1-V9，序列長度約為 1500 bps，採用技術為目前坊間定序分析序列中最長的分析技術，可提供更準確的比對結果。序列資料經由 SMRTLink 整理，再用 Mothur 軟體去除嵌合體 DNA，相似度 97 % 以上的序列歸納為一個 OTUs (Operational Taxonomic Units) 並視為同一物種，再將各 OTUs 與 GreenGenes 菌種資料庫比對獲得各樣品的物種組成資料，另以 OTUs 的數量與種類等資料進行 Alpha diversity 及 Beta diversity 等樣品間的多樣性分析。四、土壤固氮活性及碳源利用分析 (一) 游離固氮活性測定：採用土柱管垂直插入試驗田區，採集土柱高度約 5 cm，以矽膠塞塞住土柱管底部，血清塞塞住頂部，以針筒吸取 5 mL 管內氣體，再置換入 5 mL 乙炔氣體，反應 24 h 後經氣相層析儀測定管內乙烯濃度，以乙炔還原活性代表試驗田區中土壤之游離固氮活性(Koch & Evans 1996；Hardy 1973)。 (二) 土壤碳源利用測定：每一重複取 50 g 土壤，同處理共 4 重複 200 g 土壤混合後，去除植物殘體、石礫等雜質，以均質機均質土樣，將土壤懸浮液接種至 Biolog MicroPlates 96 微孔盤後置於 30℃培養箱中培養 3 d，將反應所得之平均呈色結果以主成分分析 (principle components analysis, PCA) 軟體進行比對，將反應所得之平均呈色結果 (average well color development, AWCD) 以主成分分析 (principle components analysis, PCA) 軟體進行比對，可由碳源利用圖譜的差異性反應出微生物群落之差異。研究採樣期間使用市售套組 Biolog EcoPlate™ 系統分析田區內微生物對不同碳源的利用狀況，建立微生物群落對碳源利用之基本資料 (Harch et al. 1997)。此系統中已涵蓋 3 5.

(6) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 重複之設計，共包括 31 種碳源可供測試，並可將反應結果作為碳源利用之指紋圖譜。Gomez 等人在 2006 年的文獻中指出 Biolog EcoPlateTM 可以靈敏分析出短期內不同農地管理策略對 community level physiological profiles (CLPPs)的變化，而 average well-color development (AWCD) 為其討論的指標之一，其計算方式為 ΣODi/31 ， ODi 意旨套組 Biolog EcoPlate™中每個槽位的吸光值，此指標反映出土壤微生物在 Biolog EcoPlateTM 中對不同碳源的氧化能力，數值也可當作為微生物活性的指標；若以豐富度 R 值 (richness) 比較不同施肥處理田區中微生物碳源利用的數量，則可瞭解該施肥處理中微生物族群能利用作為養分來源的碳源數量；Shannon-Weaver index (H) 則是以土壤微生物對於碳源的可利用數量來評估該環境中土壤微生物的多樣性，計算公式表示為 –Σpi (lnPi) 。 (三) 資料整理及分析：本研究將於作物不同生育階段建立不同施肥處理下之土壤固氮活性及碳源利用資料，了解土壤固氮活性在時間及空間上之變異特性，此外以碳源利用圖譜所獲得之資訊掌握土壤微生物受到施肥處理之影響，期能藉由土壤生態功能之分析評估較佳之施肥處理方式。. 結果與討論本研究計畫之試驗田區長期以水稻與玉米進行輪作，自 1995 年至今逾 20 年之久，田區施肥管理策略以多種處理 (化肥、堆肥、綠肥、泥炭及對照組) 進行逢機完全區集設計(RCBD)，自玉米齊膝期 (MT)、開花期 (MF)、水稻分蘗期 (RT) 及水稻結穗期 (RF) 進行土壤採集分析。本計畫執行期間設計於玉米齊膝期、玉米開花期、水稻分蘗期及水稻結穗期進行土壤採樣，分析試驗田區土壤基本性質的變化，包括：pH、EC 值、有機質及有效性磷、鉀、鈣、鎂、銅、鋅等元素含量；測定田區微生物之游離固氮活性、不同種類之碳源利用情形，並進行根圈微生物之篩選、培養及純化。田區內游離固氮活性之測定結果如表 1 所示：經比較水稻作物其根圈於 2016 年分蘗期 (灌水) 與結穗期之固氮活性後發現，化肥施用情況下快速提供作物氮 6.

(7) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 表 1. 長期水旱田輪作之土壤乙炔還原活性 (2001-2017) Date 2001 Jan.31 Mar.21 May.1 June.27 Nov.1 Dec.12 2002 Jan.28 Mar.30 Apr.29 July.1 Nov.4 2003 Jan.28 Apr.7 July.7 Oct.20 2004 Feb.2 Mar.29 June.23 2005 Feb. 16 Nov.. 7 2006 Feb. 7 Mar. 30 Jul.3 Nov.6 2007 Jan..31 Apr.10 June,28 Nov. 2008 Feb. Jul. Nov. 2009 Feb.10 Apr.16 July.2 Oct.22 2010 Jan.13 Mar. 24 Jan. 28 Oct. 27 2011 July Oct.19 Nov.2 2012 Jan.16 Apr.23 Jun.8 Nov.12 2013 Jan.16 Mar.1 Jun.27 Oct.29 Dec.12 2014 Apr.14 May.28 Nov.06 Dec.18 2015 Apr.14 Jun.09 Nov.25 2016 Apr.20 Jun.14 Dec. 01 2017 Jan.09 May.04 Jun.13 Nov 16 Dec 28 2018 Apr 19. Crop. Stage. CK†. CF. Acetylene reduction activity (nmole C2H4 g-1 soil 24hrs-1) Comp Comp+1/3 N Comp+2/3 N GM+1/3 N. Peat+1/3 N. Maize Rice Rice Rice Maize Maize. harvested 27 days after planting 68 days after planting harvested 28days after planting 68 days after planting. 1.56a 1.30a 3.95abc 5.30a 0.91a 1.02ab. 1.28a 1.32a 2.03bc 1.75ab 0.86a 0.97b. 1.70a 1.32a 5.45ab 3.82ab 1.24a 1.13ab. 1.39a 1.38a 5.97ab 4.53ab 0.98a 0.99b. 1.35a 2.04a 2.33bc 1.64ab 0.88a 1.05ab. 1.60a 1.38a 1.20c 1.04b 0.84a 1.00b. Maize Rice Rice Rice Maize. harvested 30 days after planting 60 days after planting harvested 34 days after planting. 2.58a 1.04a 9.94a 4.30a 0.42a. 2.01ab 1.73a 2.69a 0.68b 0.33a. 2.45ab 1.04a 8.15a 4.32a 0.65a. 2.20ab 1.13a 23.60a 2.69ab 0.57a. 2.17ab 1.25a 3.00a 0.75b 0.42a. 2.40ab 1.06a 4.82a 0.67b 0.32a. Maize Rice Rice Maize. harvested 34 days after planting harvested 33 days after planting. 0.90a 0.45a 2.26a 1.95a. 0.68ab 0.45a 1.01c 1.16a. 0.80ab 0.62a 2.49ab 1.65a. 0.76ab 0.63a 1.47bc 1.91a. 0.74ab 1.26a 1.73bc 1.23a. 0.57b 0.75a 1.48bc 1.15a. 0.61ab 0.46a 3.54a 1.27a. Maize Rice Rice. harvested 32days after planting harvested. 1.97a 0.55a 1.33a. 1.07b 0.80a 0.60a. 1.30ab 1.54a 2.17a. 0.91b 1.08a 0.63a. 0.79b 0.69a 0.68a. 0.70b 0.88a 0.78a. 1.33ab 1.23a 0.79a. Maize Maize. harvested 34 days after planting. 1.23a 1.32a. 0.14b 2.12a. 0.60ab 2.77a. ---. ---. ---. ---. Maize Rice Rice Maize. harvested 49 days after planting harvested 36 days after planting. 4.00 1.11a 4.24 3.20. 2.00 0.99a 0.20 0.74. 1.58 1.2a 3.30 2.48. Maize Rice Rice Maize. harvested 49 days after planting harvested plating. 0.34 0.25 0.34 0.96a. 0.29 0.25 0.43 0.03b. 0.53 0.22 0.35 1.14a. ----------. ----------. ----------. ----------. Maize Rice Maize. harvested harvested planting. 1.63a 2.56 0.91a. 0.04b 1.75 0.67a. 0.88ab 3.68 0.89a. ----. ----. ----. ----. Maize Rice Rice Maize. harvested tillering harvested planting. 1.22a 1.63a 1.94a 0.05a. 0.24b 0.22b 0.43b 0.09a. 0.26b 1.35a 2.78abc 0.06a. --1.35a 0.05a. --0.31bc 0.07a. --1.05ab 0.06a. --0.36bc 0.05a. Maize Rice Rice Maize. harvested tillering harvested 27 days after planting. 0.30a 0.52b 0.28ab 0.60b. 0.03b 0.73b 0.14b 0.61b. 0.12a 1.6ab 0.4ab 0.79a. 0.07ab 2.53a 0.63a 0.75a. 0.05b 2.16a 0.93a 0.77a. 0.05ab 0.91bc 0.16b 0.61b. 0.12ab 1.01b 0.3ab 0.70a. Rice Maize Maize. harvested 27 days after planting 41days after planting. 0.9a 0.23ab 0.236a. 0.93a 0.1475b 0.216a. 1.15a 0.275a 0.282a. 0.82a 0.195ab 0.283a. 0.97a 0.185ab 0.155a. 1.00a 0.265a 0.241a. 1.17a 0.2025ab 0.299a. Maize Rice Rice Maize. harvested 64 days after planting harvested 46 days after planting. 0.59a 3.47a 0.17a 0.42a. 0.22b 0.64b 0.09b 0.42a. 0.20b 2.09ab 0.09b 0.44a. 0.18b 2.03ab 0.08b 0.47a. 0.22b 1.01ab 0.07b 0.42a. 0.19b 0.91ab 0.04b 0.49a. 0.16b 3.18ab 0.07b 0.43a. Maize Rice Rice Maize Maize. harvested 45 days after planting harvested 37 days after planting 81 days after planting. 5.98a 2.01a 1.65a 0.27a 0.17a. 0.95b 1.47a 1.11a 0.15abc 0.08b. 1.48b 1.85a 1.64a 0.10c 0.10ab. 0.88b 2.07a 1.76a 0.12abc 0.11ab. 1.20b 1.23a 0.98a 0.04c 0.12ab. 0.44b 1.28a 1.1a 0.25ab 0.09ab. 0.79b 1.8a 1.45a 0.11bc 0.08b. Rice Rice Maize Maize. 43 days after planting 87 days after planting 44 days after planting 85 days after planting. 0.42c 4.1a 0.07a 0.23a. 0.44bc 0.15b 0.02b 0.25a. 0.48bc 3.27a 0.06ab 0.17a. 0.69a 0.51b 0.06ab 0.12a. 0.53abc 0.39b 0.03ab 0.1a. 0.54abc 0.2b 0.05ab 0.1a. 0.62ab 3.05a 0.05ab 0.05a. Rice Rice Maize. 44 days after planting 100 days after planting 55 days after planting. 0.93a 0.78a 0.15a. 0.42a 0.07b 0.19a. 0.95a 0.73ab 0.17a. 0.9a 0.05b 0.21a. 1.32a 0.25ab 0.17a. 0.58a 0.05b 0.19a. 1.5a 0.34ab 0.20a. Rice Rice Maize. 40 days after planting 94 days after planting 45 days after planting. 1.01 a 0.73 a 0.36 a. 0.44 b 0.89 a 0.06 b. 0.52ab 0.78 a 0.11 b. 0.51 ab 0.38 a 0.04 b. 0.48 b 0.58 a 0.08 b. 0.51 ab 0.46 a 0.07 b. 0.58 a 0.24 a 0.08 b. Maize Rice Rice Maize Maize. 84 days after planting 42 days after planting 82 days after planting 48 days after planting 90 days after planting. 0.37 a 0.97a 1.22a 1.03a 0.27a. 0.19 a 1.17a 0.97a 0.51a 0.13a. 0.26 a 0.98a 1.14a 0.67a 0.20a. 0.25 a 0.84a 1.01a 0.45a 0.17a. 0.24 a 1.05a 1.08a 0.41a 0.30a. 0.20 a 1.10a 1.20a 0.38a 0.17a. 0.20 a 0.71a 1.15a 0.68a 0.18a. Rice. 37 days after planting. 0.56. 0.89. 0.86. 0.56. 0.46. 0.53. 0.55. 7. 1.43a 1.48a 6.75a 1.75ab 0.89a 1.19a 1.80b 0.95a 21.90a 2.90a 0.53a.

(8) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 肥，導致化肥處理組別的固氮活性偏低，而其他處理組別亦低於不經施肥的對照組；隨著作物生長期增長，固氮活性些微提昇，推測由於水稻作物對於銨態氮利用率高於硝酸態氮，當水田處於厭氧狀態下導致脫氮作用，促進根圈固氮活性作用。綠肥與泥炭處理由於氮素缺乏，根圈微生物處於厭氧、好氧交錯環境不利於固氮酵素的作用，導致固氮活性降低。玉米作物於齊膝期與開花期之固氮活性變化，除對照組之外均有所提昇。玉米齊膝期之乙炔還原活性範圍為 0.04-0.36 nmole C2H4 g-1 soil 24 hrs-1，玉米開花期為 0.19-0.37 nmole C2H4 g-1 soil 24 hrs-1，傳統化肥組之游離固氮活性皆較其他處理低，而對照組之活性皆為最高且在齊膝期與其他處理有顯著差異，而其他處理之間並無差異，但水稻分蘗期中，傳統化肥組之固氮活性為最高，顯示此組之變動較其他處理大。土壤之理化分析結果如表 2 所示，化肥組之土壤 pH 介於 4.67-4.80 之間，為所有施肥處理中最低，而在玉米齊膝期之堆肥處理，其 pH 測值 5.94 為所有處理最高，玉米開花期則以堆肥加 1/3 化學氮肥的 5.85 為最高；土壤電導度 (EC) 以對照組之 204 及 175 μs cm -1 為最低，玉米齊膝期以化肥組的 592 μs cm -1 最高，玉米開花期則是泥炭土加 1/3 化學氮肥的 558 μs cm -1 最高。各施肥處理的田區土壤經元素分析，結果顯示添加堆肥的三個處理，而銅含量則顯著偏低，泥炭土添加 1/3 化學氮肥處理的鈣、鎂含量為所有處理中最高，但資材分析泥炭土的鈣鎂含量並無明顯高於其他資材，推測應是有機質造成的影響。堆肥組的三個處理及泥炭 +1/3 化肥組之土壤全氮含量顯著高於其他處理，與有機質含量成正相關。在碳源利用測定方面，表 3、表 4、表 5、表 6、表 7、表 8 及表 9 為不同施肥處理田區土壤樣品在不同孵育時間所測得及計算的 R 值、 AWCD 值及 Shannon-Weaver index：玉米作物於齊膝期中，各處理的 R 值在 72 小時並無差異，但堆肥加 1/3 化學氮肥處理的 R 值在 48 小時比其他處理略低，此處理中快生型微生物族群數量可能較少，而微生物活性及多樣性均以傳統化肥組最高，但在玉米開花期中，傳統化肥組的微生物活性與多樣性皆為最低，顯示傳統化肥組的微生物族群相對不穩定。水稻分蘗期的田間處於淹水狀態，R 值比前兩次採樣低，其中堆肥加 2/3 化學氮肥處理在 48 小時的 R 值最低，但在 72 小時的 R 值最高，顯示其慢生型微生物族群數量多於其他處理，而快生型微生物族群數量則少於其他處理，微生物活性與多樣性皆為傳統化肥處理最低，綠肥加 1/3 化學氮肥處理也偏低，其餘處理差異不大。泥炭+1/3 化學氮肥組初期偏低，活性至 72 小時增長至最高，增長快速。 8.

(9) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 表 2. 土壤分析結果 (a) 2016/12/01 玉米齊膝期土壤分析 treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. pH. EC (μs cm - 1 ). OM (%). 5.54bc 4.69e 5.94a 5.67ab 5.34cd 5.07d 5.13d. 204b 592a 383ab 383ab 526a 438a 471a. 2.1 2.9 3.9 3.7 4.0 3.5 8.0. N (mg g - 1 ) 1.77 1.67 1.93 2.14 2.14 1.75 2.37. P 2.08a 2.16a 1.33b 1.43b 1.37b 2.02a 0.88v. Mehlich No.3 (mg Kg -1 ) K Ca Mg 85.97c 1123.64c 187.27b 127.65b 919.22c 127.83d 174.31a 1681.78b 169.88b 147.75ab 1601.69b 167.91b 140.33b 1581.67b 163.87bc 152.53ab 1061.66c 141.68cd 150.78ab 2148.71a 219.35a. P 1.73a 1.73a 0.76c 0.76c 0.73c 1.39b 0.2d. Mehlich No.3 (mg Kg -1 ) K Ca Mg 71.38c 914.64c 200.86b 101.46bc 738.56d 137.86d 198.84a 1465.22b 179.17bc 141.80b 1313.78b 172.64bc 126.99b 1290.41b 198.9c 121.81b 816.91cd 140.63d 126.53b 2093.45a 240.32a. Cu 2.16a 2.19a 1.19b 1.32b 1.16b 2.14a 0.52c. Zn 5.31b 6.24b 8.84a 9.50a 9.03a 5.72b 5.48b. (b) 2017/01/09 玉米開花期土壤分析 treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. pH. EC (μs cm - 1 ). OM (%). N (mg g - 1 ). 5.62ab 4.67e 5.76a 5.85a 5.41bc 5.08d 5.21cd. 175b 385ab 379b 281ab 451ab 313ab 558a. 2.7 2.9 3.4 3.4 3.9 2.9 9.5. 1.30 1.35 1.84 1.84 1.86 1.61 2.45. Cu 1.64a 1.67a 0.51c 0.49c 0.45c 1.26b 0d. Zn 5.3b 6.4b 9.51a 9.51a 8.96a 5.49b 5.24b. (c) 2017/05/04 水稻齊膝期土壤分析 treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. pH. EC (μs cm - 1 ). OM (%). N (mg g - 1 ). 5.15bc 4.80d 5.40ab 5.50a 5.40b 4.91bcd 5.35ab. 403b 464ab 564a 536ab 576a 483ab 523ab. 2.7 3.3 3.9 3.9 4.2 3.5 8.7. 1.40d 1.47cd 1.65c 1.90b 1.90b 1.53cd 2.21a. Mehlich No.3 (mg Kg -1 ) P K Ca Mg 21.25b 68.81b 927.07c 174.20bc 32.75ab 130.89a 782.75c 141.98d 48.15a 111.06ab 1304.44b 170.84bc 43.84a 106.54ab 1411.98b 177.65b 47.29a 102.99ab 1394.79b 183.48b 33.20ab 97.47ab 864.76c 147.38cd 23.18b 91.83ab 2176.34a 241.45a. Cu 2.55a 6.23a 1.98b 1.56b 1.47b 2.24ab 0.40b. Zn 6.17c 6.66c 9.04b 10.70a 9.31b 7.11c 7.30c. (d) 2017/06/13 水稻結穗期土壤分析 treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. pH 5.08b 4.76c 5.31a 5.27ab 5.06b 4.83c 5.13ab. EC (μs cm - 1 ) 275b 258b 320b 318b 374b 483a 523a. OM (%) 3.2 2.9 3.2 4.3 4.1 3.0 9.3. N (mg g - 1 ) 1.43c 1.40c 1.78b 1.89b 1.75b 1.43c 2.24a. P 13.03c 27.14b 45.95a 46.05a 41.60a 24.61b 26.34b. Mehlich No.3 (mg Kg -1 ) K Ca Mg 54.60d 919.39c 179.24bc 59.53cd 742.14c 150.32d 82.76a 1301.53b 176.05bc 81.10a 1349.37b 176.66bc 72.69abc 1387.28b 187.48b 63.50bcd 799.47c 156.88cd 75.79ab 2333.34a 247.40a. * Values indicated with the same letter within a row are not significantly different (p<0.05) by duncan. 9. Cu 2.12a 2.21a 1.14b 1.11b 1.04b 2.17a 0.21c. Zn 7.83d 8.88cd 12.82b 14.79a 13.16b 9.36c 7.99cd.

(10) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 表 2. 土壤分析結果 (續) (e) 2017/11/16 玉米齊膝期土壤分析 treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. pH. EC (μs cm - 1 ). 5.47b 4.48e 5.82a 5.31bc 5.18cd 4.62e 5.01d. 185c 716ab 317bc 801ab 788ab 580abc 869a. N (mg g - 1 ) 1.47 1.59 1.93 2.04 2.25 1.62 2.47. Mehlich No.3 K Ca 73c 1040c 95bc 951c 133ab 1697b 164a 1955b 133ab 1896b 106bc 983c 114b 2747a. P 17e 35d 69bc 94a 85ab 37d 64c. (mg Kg -1 ) Mg 191b 149c 188b 188b 189b 144c 253a. Cu 1.60a 1.72a 0.60b 0.62b 0.50b 1.80a 0.19b. Zn 7.13b 8.07b 11.58b 25.79a 11.88b 7.90b 6.75b. (f) 2017/12/28 玉米開花期土壤分析 N Mehlich No.3 (mg Kg -1 ) EC (μs cm - 1 ) (mg g - 1 ) P K Ca Mg Cu Control 5.48ab 258c 1.27 44c 85c 1156d 184bc 1.32ab Chemical 4.66c 552abc 1.54 66ab 92c 953d 137d 1.57a Compost 5.63a 691ab 1.89 127a 149ab 1842bc 185bc 0.69cd Compost+1/3N 5.18ab 680ab 2.02 110ab 165a 1544cd 171bcd 0.97bc Compost+2/3N 5.23ab 910a 2.20 111ab 116bc 2234ab 205ab 0.46cd GM+1/3N 4.96bc 309bc 1.53 47c 80c 893d 150cd 1.82a Peat+1/3N 5.41b 655abc 2.39 78bc 113bc 2629a 247a 0.27d * Values indicated with the same letter within a row are not significantly different (p<0.05) by duncan treatment. pH. Zn 7.56d 8.17c 11.60b 11.41a 9.61cd 7.13b 7.86a. 表 3. 2016/12/01 玉米齊膝期土壤微生物經培養後的 R72 值、AWCD72 值及 Shannon-Weaver index (a) R72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 26 28 29. CF 27 29 30. Compost 27 29 30. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 23 26 28 29 30 30. GM+1/3N 26 29 30. Peat+1/3N 28 29 30. Control 0.6313 0.7611 0.8389. CF 0.6834 0.8840 0.9822. Compost 0.6804 0.8751 0.9777. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 0.6160 0.6527 0.7444 0.8278 0.8607 0.9268. GM+1/3N 0.5950 0.7567 0.8852. Peat+1/3N 0.5799 0.7578 0.8764. CF 3.256 3.363 3.406. Compost 3.230 3.320 3.393. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 3.189 3.250 3.328 3.341 3.382 3.390. GM+1/3N 3.245 3.340 3.386. Peat+1/3N 3.276 3.346 3.399. (b) AWCD72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. (c) Shannon-Weaver index 孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 3.229 3.329 3.329. 10.

(11) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 表 4. 2017/01/09 玉米開花期土壤微生物經培養後的 R72 值、AWCD72 值及 Shannon-Weaver index (a) R72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 26 28 30. CF 25 29 30. Compost 27 29 30. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 28 28 29 29 30 30. GM+1/3N 28 29 30. Peat+1/3N 27 29 30. Control 0.6613 0.7394 0.8243. CF 0.6139 0.7122 0.7465. Compost 0.7554 0.8918 0.9726. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 0.7954 0.6714 0.8616 0.7711 0.9891 0.7817. GM+1/3N 0.6874 0.7564 0.9142. Peat+1/3N 0.6155 0.7094 0.7900. CF 3.237 3.343 3.386. Compost 3.259 3.342 3.397. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 3.280 3.286 3.352 3.358 3.406 3.408. GM+1/3N 3.274 3.356 3.399. Peat+1/3N 3.289 3.353 3.404. (b) AWCD72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. (c) Shannon-Weaver index 孵育時間 (hr). Control 3.203 3.306 3.392. 48 60 72. 表 5. 2017/05/04 水稻分蘗期土壤微生物經培養後的 R72 值、AWCD72 值及 Shannon-Weaver index (a) R72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 13 18 21. CF 14 17 21. Compost 14 21 23. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 15 11 18 23 23 26. GM+1/3N 16 20 21. Peat+1/3N 15 18 24. CF 0.2130 0.3659 0.4754. Compost 0.2676 0.3774 0.5101. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 0.2945 0.2428 0.4279 0.4024 0.4960 0.5054. GM+1/3N 0.2291 0.4140 0.5300. Peat+1/3N 0.2413 0.3999 0.5588. CF 2.830 2.948 3.043. Compost 2.919 3.080 3.195. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 3.020 2.992 3.133 3.149 3.235 3.223. GM+1/3N 2.874 2.980 3.092. Peat+1/3N 2.908 3.048 3.230. (b) AWCD 72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 0.2478 0.4172 0.4977. (c) Shannon-Weaver index 孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 2.922 3.115 3.207. 11.

(12) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 表 6. 2017/06/13 水稻結穗期土壤微生物經培養後的 R72 值、AWCD72 值及 Shannon-Weaver index (a) R72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 18 20 23. CF 18 19 25. Compost 21 27 29. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 18 19 23 26 27 29. GM+1/3N 24 26 29. Peat+1/3N 17 22 25. Control 0.2985 0.4341 0.5804. CF 0.2962 0.4862 0.6433. Compost 0.3796 0.5569 0.7370. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 0.3873 0.4125 0.5229 0.5701 0.6714 0.7035. GM+1/3N 0.4019 0.5067 0.6669. Peat+1/3N 0.3739 0.5766 0.6812. CF 3.118 3.206 3.296. Compost 3.205 3.299 3.341. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 3.061 3.070 3.185 3.210 3.269 3.303. GM+1/3N 3.144 3.234 3.311. Peat+1/3N 3.130 3.239 3.304. (b) AWCD72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. (c) Shannon-Weaver index 孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 3.068 3.141 3.223. 表 7. 2017/11/16 玉米齊膝期土壤微生物經培養後的 R72 值、AWCD72 值及 Shannon-Weaver index (a) R72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 29 31 31. CF 27 30 30. Compost 27 30 30. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 28 24 30 29 31 31. GM+1/3N 26 28 30. Peat+1/3N 27 30 30. Control 0.6645 0.7573 0.8993. CF 0.6885 0.8804 0.9691. Compost 0.6383 0.8012 0.8773. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 0.7340 0.6372 0.9044 0.8135 0.9506 0.9131. GM+1/3N 0.5341 0.6219 0.7762. Peat+1/3N 0.5449 0.6194 0.7005. CF 3.272 3.366 3.396. Compost 3.301 3.370 3.391. Treatment Compost+1/3NCompost+2/3N 3.309 3.233 3.352 3.326 3.395 3.386. GM+1/3N 3.253 3.327 3.375. Peat+1/3N 3.253 3.341 3.371. (b) AWCD72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. (c) Shannon-Weaver index 孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 3.293 3.378 3.399. 12.

(13) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 表 8. 2017/12/28 玉米結穗期土壤微生物經培養後的 R72 值、AWCD72 值及 Shannon-Weaver index (a) R72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 26 29 31. CF 27 29 30. Compost 26 29 30. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 26 23 29 25 30 30. GM+1/3N 25 27 30. Peat+1/3N 26 29 31. Control 0.6892 0.8300 0.9758. CF 0.6185 0.8307 0.9525. Compost 0.6269 0.8217 0.9542. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 0.5699 0.6697 0.7251 0.7815 0.8136 0.9043. GM+1/3N 0.5011 0.6646 0.7780. Peat+1/3N 0.6801 0.7800 0.8922. CF 3.223 3.342 3.381. Compost 3.242 3.340 3.367. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 3.226 3.173 3.329 3.271 3.369 3.332. GM+1/3N 3.236 3.320 3.360. Peat+1/3N 3.219 3.343 3.394. (b) AWCD72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. (c) Shannon-Weaver index 孵育時間 (hr). Control 3.267 3.344 3.391. 48 60 72. 表 9. 2018/04/19 玉米結穗期土壤微生物經培養後的 R72 值、AWCD72 值及 Shannon-Weaver index (a) R72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. Control 23 28 30. CF 27 29 -----. Compost 24 28 30. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 24 27 29 30 30 31. GM+1/3N 25 31 31. Peat+1/3N 27 30 31. Control 0.5314 0.7730 0.8596. CF 0.5884 0.6910 -----. Compost 0.5578 0.7788 0.8857. Treatment Compost+1/3N Compost+2/3N 0.4987 0.5982 0.7231 0.8376 0.8650 0.8971. GM+1/3N 0.5766 0.8095 0.8695. Peat+1/3N 0.6505 0.8842 0.9445. CF 3.290 3.344 -----. Compost 3.232 3.327 3.360. Compost+1/3N Compost+2/3N 3.248 3.269 3.347 3.364 3.380 3.393. GM+1/3N 3.238 3.355 3.391. Peat+1/3N 3.291 3.360 3.391. (b) AWCD72 值孵育時間 (hr) 48 60 72. (c) Shannon-Weaver index 孵育時間 (hr) 48 60 72. Treatment Control 3.159 3.315 3.365. 13.

(14) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 本研究至目前為止，已篩選、純化並定序之可培養微生物菌株共 113 株，其 16S rDNA 序列分析鑑定結果如表 10 所示，其中 98 株鑑定結果為細菌，15 株為真菌，尚有部份菌株正陸續定序分析中。以 16S rDAN 之片段序列 (經 3F 引子螢光標記定序)，利用 ClustalX 軟體進行多重序列比對 (Multiple sequence alignment, MSA) 後，再以 Mega 6.0 軟體利用 neighbour-joining (NJ) 演算法進行種系發生之樹狀圖分析，所有菌株以其來源處理為分組作圖，依照各處理表 10. 土壤微生物經篩選純化後之菌種鑑定結果 Strain HIH213_3F HIH214_3F HIH215_3F HIH216_3F HIH217_3F HIH218_3F HIH219_3F HIH220_3F HIH221_3F HIH222_3F HIH223_3F HIH224_3F HIH225_3F HIH226_3F HIH227_3F HIH229_3F HIH230_3F HIH231_3F HIH232_3F HIH233_3F HIH234_3F HIH235_3F HIH236_3F HIH237_3F HIH240_3F HIH241_3F HIH242_3F HIH245_3F HIH248_3F HIH250_3F HIH252_3F HIH253_3F HIH257_3F HIH258_3F HIH279_3F HIH280_3F HIH281_3F. Isolation source Control Control Control Control Control Chemical Chemical Chemical Chemical Compost Compost Compost Compost Compost Compost Compost Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost + 2/3N Compost + 2/3N Compost + 2/3N Compost + 2/3N Compost + 2/3N GM + 1/3N GM + 1/3N Peat + 1/3N Peat + 1/3N Peat + 1/3N Peat + 1/3N Chemical Chemical Chemical. Scientific name Lapillicoccus jejuensis Knoellia locipacati Bacillus velezensis Bacillus bataviensis Bacillus aryabhattai Bacillus aryabhattai Bacillus pseudomycoides Bacillus wiedmannii Bacillus anthracis Intrasporangium oryzae Variovorax defluvii Fictibacillus halophilus Pseudomonas granadensis Bacillus pseudomycoides Bacillus megaterium Pseudomonas granadensis Humibacillus xanthopallidus Bacillus cucumis Bacillus aryabhattai Bacillus aryabhattai Bacillus pseudomycoides Bacillus velezensis Brevundimonas naejangsanensis Rhodanobacter spathiphylli Bacillus megaterium Bacillus pseudomycoides Bacillus pseudomycoides Bacillus tequilensis Bacillus mesonae Bacillus pseudomycoides Nocardia elegans Bacillus mesonae Bacillus velezensis Bacillus pseudomycoides Microbacterium testaceum Pseudomonas geniculata Mycobacterium smegmatis. 14. Identity 700/700(100%) 692/700(98.8%) 700/700(100%) 700/700(100%) 710/710(100%) 720/720(100%) 710/710(100%) 730/730(100%) 730/730(100%) 729/730(99.8%) 717/720(99.5%) 301/310(97.1%) 718/720(99.7%) 720/720(100%) 700/700(100%) 707/710(99.5%) 698/699(99.8%) 698/698(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 650/650(100%) 650/650(100%) 507/510(99.4%) 532/540(98.5%) 598/600(99.6%) 700/700(100%) 700/700(100%) 599/600(99.8%) 699/700(99.8%) 700/700(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 430/430(100%) 687/688(99.8%) 500/500(100%).

(15) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 表 10. 土壤微生物經篩選純化後之菌種鑑定結果 (續) Strain HIH282_3F HIH283_3F HIH284_3F HIH286_3F HIH288_3F HIH289_3F HIH291_3F HIH292_3F HIH293_3F HIH294_3F HIH316_3F HIH317_3F HIH318_3F HIH330_3F HIH332_3F HIH339_3F HIH340_3F HIH272_3F HIH273_3F HIH274_3F HIH275_3F HIH276_3F HIH277_3F HIH278_3F HIH364_NL1 HIH366_NL1 HIH367_NL1 HIH368_NL1 HIH369_NL1 HIH370_NS1 HIH371_NL1 HIH372_NL1 HIH373_NL1 HIH374_NL1 HIH376_NL1 HIH377_NL1 HIH381_NS1 HIH383_NS1 HIH385_NS1 HIH387_3F HIH388_3F HIH389_3F HIH390_3F HIH392_3F HIH393_3F HIH398_3F HIH399_3F HIH400_3F HIH401_3F. Isolation source Chemical Chemical Chemical Compost Compost Compost Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost + 1/3N Compost Compost + 1/3N Compost + 1/3N Control Compost + 1/3N Compost Chemical Control Control Control Control Control Chemical Chemical Control Control Chemical Chemical Chemical Chemical Compost Compost Compost Compost Compost + 1/3 N Compost + 1/3 N GM + 1/3 N GM + 1/3 N Peat + 1/3 N Control Control Control Control Compost+1/3N Compost+1/3N Chemical Compost Compost Compost+1/3N. Scientific name Rhodococcus qingshengii Pseudomonas hibiscicola Bacillus wiedmannii Bacillus altitudinis Bacillus wiedmannii Bacillus pseudomycoides Nocardia bhagyanarayanae Agromyces aurantiacus Nocardia niigatensis Pseudomonas koreensis Bacillus altitudinis Leucobacter aridicollis Lysobacter niastensis Pseudomonas guariconensis Cellulosimicrobium funkei Lysinibacillus xylanilyticus Bacillus altitudinis Bacillus wiedmannii Agromyces soli Rhodococcus qingshengii Stenotrophomonas maltophilia Rhodococcus qingshengii Bacillus pseudomycoides Bacillus pseudomycoides Penicillium purpurogenum strain Fusarium oxysporum strain: JCM 11502 Talaromyces purpureogenus Trichoderma atroviride Penicillium aculeatum Canine parvovirus isolate Paecilomyces tenuis Ochroconis ramosa Talaromyces marneffei strain: R44 Gongronella butleri strain: R21 Talaromyces purpureogenus Acrophialophora levis Canine parvovirus isolate Canine parvovirus isolate Canine parvovirus isolate Brevibacillus halotolerans Bacillus pseudomycoides Bacillus pseudomycoides Bacillus cibi Bacillus velezensis Bacillus pseudomycoides Streptomyces laculatispora Rhodococcus qingshengii Bacillus marisflavi Variovorax gossypii. 15. Identity 700/700(100%) 700/700(100%) 598/600(99.6%) 649/650(99.8%) 700/700(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 699/699(100%) 400/400(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 697/700(99.5%) 711/720(98.8%) 735/741(99.2%) 527/527(100%) 733/733(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 699/700(99.8%) 683/700(97.5%) 700/700(100%) 698/700(99.7%) 500/500(100%) 490/490(100%) 495/500(99.0%) 500/500(100%) 497/500(99.4%) 444/450(99%) 499/500(99.8%) 458/459(99.8%) 499/500(99.8%) 600/600(100%) 484/501(96.6%) 500/500(100%) 340/349(97%) 301/311(97%) 389/398(98%) 700/700(100%) 700/700(100%) 698/700(99.7%) 699/700(99.8%) 700/700(100%) 695/700(99.2%) 697/700(99.5%) 700/700(100%) 700/700(100%) 694/700(99.1%).

(16) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 表 10. 土壤微生物經篩選純化後之菌種鑑定結果 (續) Strain HIH402_3F HIH403_3F HIH404_3F HIH405_3F HIH406_3F HIH407_3F HIH408_3F HIH409_3F HIH410_3F HIH411_3F HIH412_3F HIH413_3F HIH413_3F HIH414_3F HIH415_3F HIH416_3F HIH417_3F HIH418_3F HIH419_3F HIH420_3F HIH421_3F HIH422_3F HIH423_3F HIH424_3F HIH425_3F HIH426_3F HIH427_3F. Isolation source Compost+1/3N Compost+2/3N Compost+2/3N GM+1/3N Compost+1/3N Compost+1/3N Peat+1/3N GM+1/3N Peat+1/3N Peat+1/3N GM+1/3N GM+1/3N GM+1/3N GM+1/3N GM+1/3N GM+1/3N Compost+2/3N Peat+1/3N Peat+1/3N Compost+1/3N Peat+1/3N Peat+1/3N GM+1/3N Peat+1/3N GM+1/3N Peat+1/3N Peat+1/3N. Scientific name Bacillus pseudomycoides Bacillus pseudomycoides Bacillus wiedmannii Streptomyces cyslabdanicus Humibacillus xanthopallidus Nocardia niigatensis Bacillus luciferensis Bacillus velezensis Bacillus luciferensis Paenibacillus hispanicus Paenibacillus cineris Bacillus velezensis Bacillus siamensis Bacillus cucumis Bacillus megaterium Bacillus altitudinis Bacillus velezensis Bacillus velezensis Micromonospora polyrhachis Microbacterium testaceum Bacillus wiedmannii Lysinibacillus fusiformis Bacillus tequilensis Bacillus pseudomycoides Bacillus aryabhattai Bacillus velezensis Bacillus megaterium. Identity 697/700(99.5%) 700/700(100%) 700/700(100%) 699/700(99.8%) 698/699(99.8%) 700/700(100%) 699/700(99.8%) 700/700(100%) 699/700(99.8%) 690/700(98.5%) 697/699(99.7%) 700/700(100%) 700/700(100%) 698/698(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 700/700(100%) 699/700(99.8%) 696/700(99.4%) 700/700(100%) 699/700(99.8%) 700/700(100%) 698/700(99.7%) 700/700(100%) 700/700(100%) 699/700(99.8%). 序列量，選擇 Control、Chemical、Compost 及 Compost +1/3N 等施肥處理作圖。圖 1 顯示對照組處理所篩選出的 11 株定序菌株，大致可分成 7 個菌群；傳統化肥組的 13 株菌株，可區分成 4 個菌群；堆肥處理組的 12 株菌株，可分成 6 個菌群；堆肥處理添加 1/3 化肥組的 14 株菌株，可區分成 9 個菌群，就比例而言，堆肥處理添加 1/3 化肥組的微生物豐富度高於其他組別 (結果如圖 1 所示) 。本研究採集 7 種試驗田區土壤總計 4 次，萃取土壤 DNA 後，7 種施肥處理的 DNA 樣品分別以代號 1~28 表示 (如表 11 所示) ，其中 1-14 為玉米作物的土壤樣品，15-28 為水稻作物的土壤樣品，將 DNA 以 GC-4F，5R 引子進行 PCR 擴增，續以變性膠體梯度電泳分離片段，擷取膠體上之條帶進行 UPGMA 分析親緣樹狀圖，結果如圖 2 所示：玉米時期樣品中 (圖 2 a) ，處理間約可分為 4 群，其中對照組 (編號 1, 8) 差異最大，傳統化肥組 (編號 2, 9) 、堆肥添加 1/3 化肥組 (編號 4, 11) 、綠肥添加 1/3 化肥組 (編號 6, 13) 及泥炭添加 1/3 化肥組 (編號 7, 14) 的 16.

(17) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. (a) Control 控制組 HIH217 Bacillus aryabhattai HIH272 Bacillus wiedmannii HIH216 Bacillus bataviensis HIH215 Bacillus velezensis HIH275 Stenotrophomonas maltophilia HIH330 Pseudomonas guariconensis HIH274 Rhodococcus qingshengii HIH276 Rhodococcus qingshengii HIH273 Agromyces soli HIH213 Lapillicoccus jejuensis HIH214 Knoellia locipacati. 56 63 100. 100 100. 100 68 100. 0.02. (b) Chemical 化學肥料處理組 HIH277 Bacillus pseudomycoides HIH284 Bacillus wiedmannii HIH219 Bacillus pseudomycoides HIH220 99 Bacillus wiedmannii HIH221 Bacillus anthracis HIH278 Bacillus pseudomycoides HIH218 Bacillus aryabhattai HIH340 Bacillus altitudinis HIH280 Pseudomonas geniculata HIH283 Pseudomonas hibiscicola 100 HIH282 Rhodococcus qingshengii HIH281 Mycobacterium smegmatis HIH279 Microbacterium testaceum 68. 84 100. 100 99. 0.02. (c) Compost 堆肥處理組 78 52. 96. 93 23 24. 55. 76. HIH316 Bacillus altitudinis HIH286 Bacillus altitudinis HIH227 Bacillus megaterium HIH226 Bacillus pseudomycoides HIH289 Bacillus pseudomycoides HIH288 Bacillus wiedmannii HIH224 Fictibacillus halophilus HIH339 Lysinibacillus xylanilyticus HIH222 Intrasporangium oryzae HIH223 Variovorax defluvii HIH225 Pseudomonas granadensis HIH229 100 Pseudomonas granadensis. 0.05. (d) Compost +1/3N 堆肥添加 1/3 化肥處理組 HIH232 Bacillus aryabhattai HIH233 Bacillus aryabhattai 95 HIH231 Bacillus cucumis HIH234 Bacillus pseudomycoides HIH235 Bacillus velezensis HIH236 Brevundimonas naejangsanensis HIH294 Pseudomonas koreensis HIH318 Lysobacter niastensis HIH291 Nocardia bhagyanarayanae 100 HIH293 Nocardia niigatensis HIH292 Agromyces aurantiacus HIH317 Leucobacter aridicollis HIH230 Humibacillus xanthopallidus HIH332 Cellulosimicrobium funkei 99. 86. 100. 78 99. 100 68 65 53. 0.02. 圖 1. 不同處理篩選分離菌株序列之親緣樹 17.

(18) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 種系發生較為接近。結果推論：不同施肥處理組別土壤中所分析之微生物族群結構，與其基質種類具有密切關係，即堆肥、綠肥、泥炭等不同基質分析所得的微生物族群關係呈現明顯的區集分隔；水稻時期樣品中，處理間約略亦可分為 4 群， (a) 玉米時期樣品. (b) 水稻時期樣品. 圖 2. 不同施肥處理依據 DGGE 條帶分布以 UPGMA 演算法重建之親緣關系圖。表 11. 分析樣品其採樣時間及處理之 16S rDNA 代號施肥處理 Treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. 玉米齊膝期 20161201 1 2 3 4 5 6 7. 採樣時間 Sampling Time 玉米開花期水稻分蘗期 20170109 20170504 8 15 9 16 10 17 11 18 12 19 13 20 14 21. 18. 水稻結穗期 20170613 22 23 24 25 26 27 28.

(19) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 其中對照組 (編號 15, 22) 同樣差異最大，而堆肥組 (編號 17, 24) 、堆肥添加 2/3 化肥組 (編號 19, 26) 及泥炭添加 1/3 化肥組 (編號 21, 28) 圖譜較為接近。水稻田區厭氧環境之群落分佈關聯性較玉米田區不明顯，僅堆肥處理組各土讓樣品之微生物族群分佈較密集。 28 個土壤 DNA 樣品續以第 3 代定序之 PacBio 技術針對 16S rDNA 全長序列進行高通量序列分析，分析序列區間為高變異區 V1~V9，序列長度約為 1500 bps。序列資料經由 SMRTLink 整理，再用 Mothur 軟體去除嵌合體 DNA，相似度 97% 以上的序列歸納為一個 OTUs (Operational Taxonomic Units) 並視為同一物種，再將各 OTUs 與 GreenGenes 菌種資料庫比對獲得各樣品的物種組成資料，另以 OTUs 的數量與種類等資料進行 Alpha diversity 及 Beta diversity 等樣品間的多樣性分析。圖 3 顯示各樣品於 Phylum (門) 層級的 OTUs 組成，以此圖數據為基礎，進行 UPGMA 樹狀圖，結果如圖 4 所示，由結果可觀察到樣品之分佈大致分成 2 個群集 (少數樣品例外)，上半部多數為玉米齊膝期 (1051201) 與玉米開花期 (1060109) 樣品，下半部則多為水稻分蘗期 (1060504) 與水稻結穗期 (1060613) 樣品，顯示試驗田區土壤微生物之群落組成受到作物之影響遠大於施肥處理。圖 5 顯示各樣品於 Order (目) 層級的 OTUs 組成，結果顯示，Desulfuromonadales (除硫單胞菌目，厭氧菌) 在玉米時期所佔比例低於水稻時期；Bacillales 在玉米時期比例高於水稻時期，除了水稻分蘗期，GM+1/3N 處理此菌比例較其他處理高，比對較低層級，. 圖 3. 不同施肥處理之土壤樣品經高通量分析的 OTUs 組成結果 (細菌門 Phylum 層級) 19.

(20) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 圖 4. 高通量分析的 OTUs 組成於土壤樣品間之親緣關係圖 (細菌門 Phylum 層級). Desulfuromonadales Burkholderiales. Clostridiales Bacillales. Acidobacteriales. 圖 5. 不同施肥處理之土壤樣品經高通量分析的 OTUs 組成結果 (細菌目 Order 層級). 圖 5、不同施肥處理之土壤樣品經高通量分析的 OTUs 組成結果（細菌目 Order 層級）. 20.

(21) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 主要為 Bacillus fumarioli 及 flexus；Bacteroidales (多為厭氧菌)，在玉米時期比例非常低；Acidobacteriales 嗜酸菌在 Compost 的 3 個處理中比例比其他處理低，對照 pH 結果，此 3 處理 pH 較高。實際測得的 OTUs 數目，加上只有 1-2 條序列的 OTUs 數目形成的參數，經過 Chao 1 演算法估計樣品中應有的 OTUs 數目較能正確表達樣品狀況，結果如表 12 所示，Compost 及 Peat + 1/3N 處理的 Chao 1 值在各個採樣期波動較小，受到採樣時間點的影響較小，而 Control 處理受到採樣時間點的影響較大。OTUs 數據經由 Shannon 演算法演算出之 Shannon 值，此值演算參數中包含 OTU 數目及內含序列條帶數，可視為微生物多樣性之均勻度，如表 13 所示。在玉米期時，各處理間之 Shannon 值差異較大，水稻期各處理差異較小，Compost +1/3N 及 GM +1/3N 處理之 Shannon 值隨採樣期的變動較小，而 Chemical 處理之 Shannon 值隨採樣期變動最大，Compost +2/3N 處理次之。圖 6 為各樣品之主成分分析圖，在圖中距離愈近代表樣品中 OTUs 的種類與數量愈相似，由圖中可知，有 3 個樣品與其他樣品差異較大，分別是 #6 (玉米齊膝期，GM +1/3N 處理)、#10 (玉米開花期，Compost 表 12. 分析樣品經高通量定序分析所得 OTUs 的 Chao 1 值施肥處理 Treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. 玉米齊膝期 20161201 905 744 770 900 628 616 667. 採樣時間 Sampling Time 玉米開花期水稻分蘗期 20170109 20170504 1079 680 693 808 786 818 868 699 868 744 635 742 758 721. 水稻結穗期 20170613 790 662 738 686 683 660 751. 表 13. 分析樣品經高通量定序分析所得 OTUs 的 Shannon 值施肥處理 Treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. 玉米齊膝期 20161201 7.55 7.43 7.53 7.57 7.50 7.09 7.32. 採樣時間 Sampling Time 玉米開花期水稻分蘗期 20170109 20170504 7.66 7.22 7.50 7.30 7.56 7.30 7.76 7.35 7.62 7.34 7.21 7.11 7.39 7.32. 21. 水稻結穗期 20170613 7.27 6.93 7.15 7.25 7.19 7.08 7.08.

(22) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 圖 6. 不同施肥處理之土壤樣品經高通量分析未加權的 Beta 多樣性指數. 處理) 及 #17 (水稻分蘗期，Compost 處理)，其餘大致以作物種類分成兩大群，與 UPGMA 結果相似，但可看出玉米齊膝期樣品分散程度大於其他樣品，即在玉米齊膝期時各處理微生物相之差異較大。推測玉米作物經由化肥處理組的試驗土壤，由於化學肥料大量施用造成土壤通氣性較堆肥處理差，土壤硬化造就厭氧微生物 (如：Clostridium 等菌屬) 所適合生長之微域環境；而水稻作物由於栽培階段皆處於厭氧環境，於不同採樣點各施肥處理樣品中並無明顯的微生物族群比例差異。另，玉米作物齊膝期所施用化學肥料處理的試驗區，其微生物族群數均高於堆肥處理組；結穗期堆肥處理中的微生物族群數，於化學肥料與堆肥處理間約略相同，推測乃因化學肥料快速分解與淋洗，導致微生物可利用的養分元素快速變動進而影響 R 策略微生物族群分佈。相較於施用化學肥料的處理，堆肥處理組別的厭氧微生物較化學肥料處理組生長優勢，推測原因為有機質肥料其養分隨栽種時間緩慢性釋出，促使 K 策略微生物族群穩定分佈於環境中，本研究將高通量分析於各土壤樣品中所得比例較高的微生物資訊列於表 14 中。圖 6 及圖 7 為樣品所含微生物群落的差異，以加權及未加權之 Beta 多樣性指標表示，紅色表示差異大，加權 22.

(23) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 後可視為菌種親緣關係和豐度的綜合指標，而未加權只考慮菌種親緣進化關係。如圖所示，未加權 beta 多樣性指標同樣顯示，不同處理之間大致以作物種類進行分群。水稻田區的生物多樣性依作物生長期進行區集，處理間差異不大，而加權後的 beta 指標顯示，不同處理之間的生物多樣性雖依作物種類有分群，但相較於. 圖 7. 不同施肥處理之土壤樣品經高通量分析加權後的 Beta 多樣性指數表 14. 土壤樣品經高通量分析所得之 OTUs 之優勢微生物比對分類層級氧氣需求性 Oxygen requirement 好氧性 (aerobic organism) 好氧性 (aerobic organism) 好氧性 (aerobic organism) 好氧性 (aerobic organism) 好氧性 (aerobic organism) 兼性厭氧 (facultative anaerobic organism) 兼性厭氧 (facultative anaerobic organism) 兼性厭氧 (facultative anaerobic organism) 兼性厭氧 (facultative anaerobic organism) 兼性厭氧 (facultative anaerobic organism) 厭氧性 (anaerobic organism) 厭氧性 (anaerobic organism) 厭氧性 (anaerobic organism) 厭氧性 (anaerobic organism) 厭氧性 (anaerobic organism) 厭氧性 (anaerobic organism). 生物層級 Taxonomy level 科 (family) 科 (family) 科 (family) 種 (species) 種 (species) 科 (family) 屬 (genus) 屬 (genus) 種 (species) 種 (species) 科 (family) 屬 (genus) 種 (species) 屬 (genus) 屬 (genus) 目 (order). 23. OTUs 最相似結果 Target Chitinophagaceae Gemmataceae Syntrophobacteraceae Dyella ginsengisoli Massilia timonae Comamonadaceae Alicyclobacillus Rhodoplanes Bacillus flexus Bacillus fumarioli Thermogemmatisporaceae Clostridium Clostridium butyricum Coriobacteriaceae Desulfosporosinus Desulfuromonadales.

(24) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 未加權指數的結果分散，可看出對照組與堆肥添加 1/3 化肥的處理組有較高的生物多樣性。綠肥添加 1/3 化肥與泥炭添加 1/3 化肥的處理組，其生物多樣性相似度較高，與 DGGE 結果類似。圖 8 為樣品經高通量分析後以各樣品之 OTU 數目及種類所作之，OTU heatmap 圖顯示：栽種玉米田區的土壤樣品，其生物多樣性的相對豐度明顯高於栽種水稻的土壤。圖中顯示所有樣品 (X 軸) 中主要 35 屬 (Y 軸) 菌種的豐富度分佈，顏色表示每個 OTU 與該樣品中總 OTU 的百分比，藍色表示低百分比，紅色表示高分分比，玉米土壤樣品之相對豐度明顯高於水稻土壤樣品。表 15 為各處理歷年產量記錄，產量結果顯示，水稻及玉米產量在不同年度及不同肥料處理有差異，顯示年度氣候影響不同肥料處理之效應顯著。在不施肥的土壤，水稻收穫明顯是最低的，而以化肥及堆肥加化學氮肥的處理下，作物收穫有較高的趨勢。但其收穫量都在誤差範圍內。玉米收穫情況與水稻相似，而以化肥及堆肥加化學氮肥的處理下，作物收穫有較高的趨勢。長期堆肥處理之土壤，在水稻及玉米產量，皆與化肥處理無顯著差異，甚至有些年度水稻產量高過化肥處理。. 圖 8. 不同施肥處理之土壤樣品經高通量分析後之 OTUs heatmap. 24.

(25) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 表 15. 35 號試驗田歷年水稻及玉米產量 (kg ha-1) (a) 水稻 Treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. Year 2010 4261c 5702a 4490bc 4823bc 5023b 4438bc 4670bc. 2011 3492b 5721a 4807a 4198a 5236a 5423a 4664a. 2012 4588bc 5047c 5584ab 5813a 5354abc 4513c 5277abc. 2013 4433a 5420a 5216a 4946a 5253a 4866a 5293a. 2014 4831ab 5334ab 5107ab 5381ab 5290ab 4554b 5565a. 2015 5057d 6320abc 5852bc 6600ab 6881a 6460abc 5757cd. 2016 6716c 8384ba 7860b 8812a 8479ab 8384ab 7764b. 2017 5668b 6288ab 6716a 6431ab 6240ab 6240ab 6050ab. Average 4881 6027 5704 5875 5970 5610 5630. *Values indicated with the same letter within a row are not significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test. (b) 玉米 Treatment Control Chemical Compost Compost+1/3N Compost+2/3N GM+1/3N Peat+1/3N. 2010 2357c 5348ab 4977b 5946a 5296ab 5041ab 4438b. 2011 2117c 5755a 5180ab 6120a 5360ab 5146ab 4708b. 2012 2083c 4154ab 4366ab 5426a 5087a 4705ab 3603bc. Year 2013 1568c 6697a 5341ab 6740a 5977ab 5553ab 5002b. 201 mu4 3518c 5765ab 6740a 6825a 6570a 4875b 5426ab. 2015 2628c 6528ab 6146ab 6528ab 6486ab 7037a 5214b. 2016 4154c 7715ab 7757ab 8435a 8181a 8605a 6358b. Average 2632 5995 5787 6574 6137 5852 4964. *Values indicated with the same letter within a row are not significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test. 結論 1. 有加堆肥組的 3 個處理及 Peat+1/3N 的氮含量及鈣含量皆偏高，銅含量皆偏低，推測與有機質含量有關。 2. 堆肥組 t+1/3N 處理的玉米產量與 Chemical 處理相近，堆肥組長期處理後，產量時有接近或高過化肥組處理。 3. 堆肥組及堆肥組+N 長期處理後的水稻產量與化肥組處理愈趨相近，甚至有所超越。 4. 長期施用化學肥料之土壤，乙炔還原活性較小且變動不劇烈，較不受作物生長期及環境影響，而對照組之乙炔還原活性變動最大。. 25.

(26) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. 5. 碳源利用測定結果顯示，化肥組處理的微生物族群相對不穩定。而堆肥組處理的豐富度、穩定度及均勻度都較高。 6. 各時期土壤樣品多源基因體的 16S rDNA 序列分析結果顯示： (1) 玉米開花時期樣品物種獨特性最高。 (2) 試驗田區土壤微生物之群落組成受到作物之影響遠大於施肥處理。 (3) 微生物均勻度，物種豐富度皆為對照組>堆肥組>化肥組。 (4) 堆肥加化肥施用可減低單純施用化肥對土壤微生物多樣性造成的影響。 7. 化肥組及堆肥+N 肥的長期處理皆造成土壤酸化。 8. 堆肥處理之土壤，在水稻及玉米產量，皆與化肥處理無顯著差異，甚至有些年度水稻產量高過化肥處理。. 引用文獻 1. Brosius, J., M. L. Palmer, P. J. Kennedy, and H. F. Noller. 1978. Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. 75:4801-4805. 2. Edwards, U., T. Rogall, H. Blocker, M. Emde, and E. C. Bottger. 1989. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 17:7843-7853. 3. Hallmann, J., A. Quadt-Hallmann, W. F. Mahaffee, and J. W. Kloepper. 1997. Bacterial endophytes in agricultural crops. Canad. J. Microbiol. 43(10):895-914. 4. Hardy, R.W., R. C. Burns, and R. D. Holsten. 1973. Application of the acetylene-ethylene assay for measurement of nitrogen fixation. Soil Biol. Biochem. 5:47-81. 5. Koch, B., and H. J. Evans. 1966. Reduction of acetylene to ethylene by soybean root nodules. Plant Physiol. 41:1748-1750. 6. Koeuth, T., L. Versalovic, and J. R. Lupski. 1995. Differential subsequence conservation of interspersed repetitive Streptococcus pneumoniae box elements in diverse bacteria. Genome Res. 5:408-418. 7. Krsek, M. and E. M. H. Wellington. 1999. Comparison of different methods for the isolation and purification of total community DNA from soil. J. Microbiol. Method. 39:1-16. 8. Lodewyck, C., J. Vaugronsveld, F. Porteous, E. R. B. Moore, S. Taghavi, M. Mezgeay, and J. L. Lelie. 2002. Endophytic bacteria and their potential application. Crit. Rev. Plant Sci. 26.

(27) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. 86:583-606. 9. Mano, H. and H. Morisaki. 2008. Endophytic bacteria in the rice plant. Microbes Environ. 23:109-117. 10. Park, M., C. Kim, J. Yang, H. Lee, W. Shin, S. Kim, and T. Sa. 2005. Isolation and characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea. Microbiol. Res. 160:127-133. 11. Saito, A., S. Ikeda, H. Ezura, and K. Minamisawa. 2007. Microbial community analysis of the phytosphere using culture-independent methodologies. Microbes Environ. 22:93-105. 12. Shen, F. T., and C. C. Young. 2005. Rapid detection and identification of the metabolically diverse genus Gordonia by 16S rRNA-gene-targeted genus-specific primers. FEMS Microbiol. Lett. 250:221-227. 13. Soeta, N., M. Terashima, M. Gotoh, S. Mori, K. Nishiyama, K. Ishioka, H. Kaneko, and T. Suzutani. 2009. An improved rapid quantitative detection and identification method for a wide range of fungi. J. Med. Microbiol. 58:1037-1044. 14. Sturz, A. V., B. R. Christie, J. Nowak. 2000. Bacterial endophytes: potential role in developing sustainable systems of crop production. CRC Crit. Rev. Plant Sci. 19:1-30. 15. Wicklow, D. T., S. Roth, S. T. Deyrup, and J. B. Gloer. 2005. A protective endophyte of maize: Acremonium zeae antibiotics inhibitory to Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Mycolog. Res. 109:610-618.. 16. Lin, S.-Y., Y. C. Liu, A. Hameed, Y. H. Hsu, H. I. Huang, W. A. Lai, and C. C. Young. 2016. Azospirillum agricola sp. nov., a nitrogen-fixing species isolated from cultivated soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 66:1453-1458.. 27.

(28) 溶磷菌肥料肥 (功) 效評估及驗證研討會專刊. Analysis of Soil Microbial Diversity and Function in Rice and Maize Fields under Long-term Upland and Lowland Rotational System in Different Fertilization Treatments Chiu-Chung Young1,*, Hsin-I Huang2, Shih-Yao Lin3, Yu-Weng Lin4. Summary The experimental plot of this research project has been cultivated by the upland and lowland rotational system over 20 years since 1995, and the management strategy of the field fertilization has been carried out in various treatments (fertilizer, compost, green manure, peat and control group) by RCBD design. Soil sample was collected and analysed at different growth stages. The results of carbon source utilization test showed that the number of slow-growing microbial populations in Compost + 2/3N group was higher than that in other treatments, while the number of fast-growing microbial populations was less than other treatments. The microbial activity and diversity were lowest in chemical fertilizers treatment. The full-length sequencing and analysis results of PacBio 16S rDNA showed that the composition of the microorganisms was more affected by the crop than the treatment. The Chao 1 value of the Control group was greatly affected by the sampling time. In Maize, the Shannon values of the treatments * 1. 2. 3. 4. Corresponding author, e-mail: [email protected] Professor, Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan, ROC. Academician of the Academia Sinica. Researcher Assistant, Department of Soil and Environmental Science, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan, ROC. Postdoctoral Researcher, Department of Soil and Environmental Science, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan, ROC. Associate Researcher, Agricultural Chemistry Division, Taiwan Agriculture Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 28.

(29) 施肥對水旱輪作土壤微生物之影響. were different, and the differences in the treatments in the rice field sample were small. The Shannon values of the Chemical fertilizer groups varied the most with the sampling time, and the Compost + 2/3N group were the second. The Principal Component Analysis shows that the samples are roughly divided into two groups according to the crop type, which is similar to the UPGMA results, but the difference in the microbial diversity of each treatment during the maize tillering period is biger. The weighted beta-diversity showed that the Control and Compost + 1/3N had higher biodiversity. GM +1/3N and Peat + 1/3N had higher similarity. The OTU heatmap shows that the relative abundance of biodiversity in the soil samples in maize is significantly higher than that in the rice. In the rice and maize yields, the Control group had the lowest production, the Chemical fertilizers and Compost +1/3N had a higher production and the yields of the two gropus were close ; the maize production was similar to rice. Keywords: Rice, Maize, Water and drought rotation, Microbes, Nitrogen fixation activity, Microbial population, Biodiversity, PacBio.. 29.

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