cus、Pseudomonas aeruginosa及Proteus等(5)。當有害菌 的數量上升，產生有毒物質時，會對人體造成危害，
由於乳酸菌可以和有害菌競爭吸附腸道的位置，因此 產生競爭性抑制作用，當乳酸菌的數量上升時可以抑 制有害菌在腸道內的定殖作用(5)。另一方面，乳酸菌可 以產生多種小分子的抑菌物質，包含了有機酸（organic acids）、細菌素（bacteriocins）、雙乙醘（diacetyl）
及過氧化氫等。有機酸以乳酸及醋酸為主，可以抑制 大部分的腐敗菌(6)。此外，乳酸菌亦具提高營養價值、
改善乳糖不耐症、維持腸內正常微生物菌相、改善便 秘、預防腹瀉、降低血清膽固醇、預防骨質疏鬆症、
調節免疫功能以及抗腫瘤等功能，因此被當作益生菌
（probiotics）來使用(7-11)。乳酸菌的相關產品也因此受 到世人重視，目前流通在市面上的乳酸菌製品不計其 數，如優格、優酪乳、起士、泡菜、發酵香腸，及宣 稱含乳酸菌之奶粉等。
益生菌（probiotics）有人譯為原生物素、生菌 素、生菌劑或原生保健性菌種，其來源衍生自希臘 語，意指為有益於生命（for life）的物質，最初由Lilly 及Stillwell於1965年提出(12)，為原生動物（protozoan）
所產生能刺激他種生物生長的物質。Parker(13)認為pro- biotics是能夠維持宿主腸道菌相平衡的物質，Fuller(14) 更進一步提出，probiotics必須是一活的微生物，能夠 促進宿主腸內微生物菌相平衡，且對宿主具有正面效 益。近年來由於學者發現經由熱致死之菌體或是破碎 菌株所得之胞內物依舊保有抵抗病原菌感染及提高宿 主免疫功能等正面功效(9,15)。Salminen等人(16)因此定義 probiotics為對宿主健康有益的微生物及其細胞組成物 質，不一定只是活菌。益生菌種類繁多，包括嗜乳酸 桿菌（L. acidophilus）、保加利亞乳酸桿菌（L. bul- garicus）、雙岐雙叉桿菌（B. bifidum）、龍根菌（B.
前 言
乳酸菌廣泛存在於自然界中，一般生存於含有豐 富可溶性碳水化合物、蛋白質分解物、維生素以及含 氧量低的環境，多具有下列特徵：⑴革蘭氏陽性菌；
⑵菌體型態為桿菌或球菌；⑶除極少數乳酸桿菌屬
（Lactobacillus）外，幾乎不具有運動性；⑷除了Spor- olactobacillus之外，皆為非產孢菌；⑸營養需求複雜；
⑹通常缺乏觸酶（catalase）及細胞色素，為厭氧、微 好氧或兼性厭氧菌；⑺可分為同型乳酸發酵菌及異型 乳酸發酵菌(1,2)。
1919年Orla-Jensen(3)依據簡單的型態學與生理學，
將乳酸菌分為Betabacterium、Betacoccus、Streptobacte- rium、Streptococcus、Tetracoccus 及Thermobacterium六 屬。隨著分子遺傳學的發達，以及對乳酸菌的生理活 性有更進一步的認識，又區分出更多新的菌屬，包括 乳酸桿菌屬、肉品桿菌屬（Carnobacteium）、Atopo- bium、Weissela、鏈球菌屬 （Streptococcus）、腸球菌 屬（Enterococcus）、乳酸球菌屬（Lactococcus）、徘 徊球菌屬（Vagococcus）、Abiotrophia、四連球菌屬
（Pediococcus）、四體球菌屬（Tetragenococcus）、白 念球菌屬（Leuconostoc）、Oenoecoccus、有孢子乳桿 菌屬（Sporolactobacillus）、Lactosphaera以及雙叉桿 菌屬（Bifidobacterium）等(1,4)。
在人體的消化系統中，從胃、小腸到結腸分佈 有不同族群及數量的微生物。腸道內的微生物菌相主 要可以分為兩類，第一類為有益菌如Streptococcus、
Bifidobacterium和Lactobacillus等；第二類為有害菌如 Bacteriodes、Eubacterium、Escherichia coli、Enterococ- cus、Veilonella、Clostridium perfrigens、Staphylococ-
市售含益生菌奶粉中微生物品質之調查研究
許雅鈞 高長風 鍾月容 施養志 第五組
摘 要
本計畫於95年5月至12月間以價購方式於大台北地區抽購含益生菌奶粉共計15項，每項各2個批 次，共計30件檢體，經檢測其乳酸菌含量，結果發現活性乳酸菌、雙叉桿菌及乳酸桿菌之菌數均與標 示相符。除利用鏡檢、觸酶反應及API 50 CHL醣類發酵試驗等表現型鑑別試驗，亦針對檢體所含乳酸 菌菌株選用6對引子組進行PCR反應，以鑑定檢體中乳酸菌種類，檢測結果所有檢體皆與產品標示菌 株相符。乳品類衛生標準規定，乳粉中大腸桿菌群每公克最確數10以下，大腸桿菌陰性，不得檢出李 斯特菌及沙門氏菌。本研究針對15項（30件）檢體之李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌及大腸桿菌群進 行檢驗，檢測結果均無不符合規定情形。
關鍵詞：奶粉、活性乳酸菌、李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌
longum）、嗜熱性鏈球菌（S. thermophilus）等。益生 菌的應用形式包括一種或數種菌種混合使用，應用範 圍除了以食用方式經口攝取，也有製成霧狀以應用至 上呼吸道或製成藥膏抹劑塗抹於泌尿道，進行局部的 治療(17)。益生菌在食品的應用約有70％應用於乳品，
如作成發酵乳、乳酸菌飲料、優酪、含益生菌奶粉或 冰淇淋等(17)。近幾年來，由於益生菌的臨床效益逐漸 被證實，益生菌因此也以醫療製藥的形式作為整腸 劑、下痢治療劑以及醫療輔助品。
Sanders和Veld(18)指出，每日至少需補充109~1010 CFU益生菌數，對促進健康才有顯著效果。Canganella 等人(19)之研究則指出某些商品之實際菌株種類與標示 不符；Temmerman等人(20)檢測30種乾燥乳酸菌粉產品 及25種乳製品，結果顯示乾燥乳酸菌粉產品中有47％
之實際菌株種類或含量與標示不符，乳製品中也有 40％與標示不符。Hamilton-Miller等人(21)檢測52種含 益生菌之產品，結果有67％產品之實際菌株種類或含 量與標示不符，因此有必要確認市售含益生菌奶粉中 實際乳酸菌種類及含量與標示之符合性，以確保產品 之功效性及消費者權益。在衛生品質方面，王等(22)針 對乳品（鮮乳、保久鮮乳、調味乳、保久調味乳）60 件、乳粉10件及乾酪30件，進行仙人掌桿菌、金黃色 葡萄球菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌及大腸桿菌群之檢 驗，結果有1件調味乳之大腸桿菌群最確數超出衛生標 準，其他均符合規定。依據乳品類衛生標準(23)乳粉中 生菌數為每公克五萬以下，大腸桿菌群為最確數10以 下，大腸桿菌陰性，不得檢出李斯特菌及沙門氏菌。
依據食品衛生管理法第十條：針對標示含乳酸菌產品 適用衛生標準之解釋(24)，如有檢體檢出生菌數超過衛 生標準，而該檢體標示含乳酸菌者，先檢驗案內產品 中乳酸菌之含量，再評估生菌數過高之原因。如產品 乳酸菌含量相當高，則不適宜測生菌數，應另測大腸 桿菌群及大腸桿菌，必要時檢測沙門氏菌及李斯特菌
(25)。為了解市售含益生菌奶粉之衛生品質狀況，擬針 對含益生菌奶粉進行李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌 及大腸桿菌群之檢驗，以確保消費者食用安全。
材料與方法
一、實驗材料 灱參考菌株
Lactobacillus acidophilus BCRC 10695、L. del- brueckii subsp. bulgarics BCRC 10696、L. casei BCRC 10697、Bifidobacterium longum BCRC 11847、B. bifidum BCRC 14615及B. animalis subsp.
lactis BCRC 17394均購自新竹食品工業發展研究 所生物資源保存及研究中心。
牞檢體來源
自95年5月至12月間以價購方式於超級市場、大賣 場及藥局等地區購得不同品牌或品目之標示含益 生菌奶粉15項，每項2個批次，共30件檢體。
犴培養基
1. 牛津培養基（Oxford medium, OXA）、Lactoba- cilli MRS Agar及 Lactobacilli MRS Broth均購自
美國Difco公司。
2. 硫酸月桂胰化蛋白腖培養基（Lauryl Sulfate Tryptose Broth, LST）、木糖離胺酸去氧膽酸 鹽培養基（Xylose Lysine Deoxycholate Agar, XLD）、海克頓腸內菌培養基（Hektoen Enteric Agar, HE）及亞硫酸鉍培養基（Bismuth Sulfate Agar, BS） 均購自Becton, Dickinson and Com- pany。
3. Listeria selective enrichment supplement、Oxford Listeria selective supplement、PALCAM Liste- ria selective supplement、亞硒酸胱胺酸培養液
（Selenite Cystine Broth, SC）及四硫代硫酸鹽 培養液（Tetrathionate Broth, TT）均購自德國 Merck公司。
犵藥品
1. Ethidium Bromide、Agarose和1X TBE Buffer均 購自美國 Amresco公司。
2. 100 bp DNA ladder購自台灣紫外光公司。
3. PUREGENE® Genomic DNA Purification Kit購自 騰達行企業股份有限公司。
4. DyNAzymeTM II DNA Polymerase購自美國 Finnzymes公司。
5. 厭氧包、無菌礦物油、革蘭氏染色套組及API 50 CHL醣類發酵菌種鑑定套組均購自法國bio- Mérieux公司。
6. 半胱胺酸-鹽酸鹽（L-cysteine-HCl）購自德國 Merck公司。
7. BactoTM peptone購自美國Difco公司。
8. Brilliant green dye、Bromocresol purple、Cal- cium carbonate、Dicloxacillin、Lithium chlo- ride、Mannitol、Phenol red、Sodium hydroxide 及Sodium pyruvate均購自Sigma公司。
玎儀器
1. 高速冷凍離心機（Kubota 3740），日本Kubota 公司。
2. GeneAmp PCR System 9700，美國Applied Bio- systems公司。
3. 桌上型恆溫振盪器（Thermomixer comfort 5355），美國 Eppendorf公司。
4. 電泳膠片影像擷取系統Inspection centificate DOC-008.XD，英國UVI tec公司。
5. 顯像系統（Video copy processor）及厭氧缸，日 本Mitsubishi公司。
6. DNA電泳槽（Mupid-2），美國Cosmo Bio公 司。
7. 殺菌釜（Tomy autoclave SS-325），日本Tomy 公司。
二、實驗方法 灱菌種的保存及活化
將冷凍保存之菌株由-80℃ 冷凍庫中取出，於室 溫下進行回溶，接種1%（v/v）菌量於MRS broth 中，於37℃厭氧培養16小時，經兩次繼代培養後 備用。冷凍保存菌株的製備，是將活化菌株之
MRS broth培養物加入約20%（v/v）的甘油，混合 均勻後置於-80℃冷凍庫中凍藏備用。
牞乳酸菌菌數之計數 1. 活性乳酸菌
依據CNS 14760/N6371「乳品檢驗法—乳酸菌 之檢驗」標準檢驗方法進行檢驗(1)。
2. 雙叉桿菌（Bifidobacterium）
將檢體混合均勻，以0.1% peptone water進行10 倍系列連續稀釋至適當倍數，分別取各稀釋檢 液（液態檢體包含原液）1 mL於培養皿中，
每皿倒入MRS培養基（每100 mL MRS培養基 分別加入0.01％ dicloxacillin、10％ LiCl及10％
cysteine-HCl溶液0.5 mL、1 mL及0.5 mL）15~20 mL，混合均勻，待培養基凝固，於37℃厭氧培 養72小時後，計算菌落數(27)。
3. 乳酸桿菌（Lactobacillus）
將檢體混合均勻，以0.1% peptone water進行10 倍系列連續稀釋至適當倍數，分別取各稀釋檢 液（液態檢體包含原液）0.1 mL注入已凝固乾 燥之培養基（MRS培養基400 mL分別加入40％
sucrose溶液20 mL、0.2％Bromocresol purple溶 液40 mL，並以2 N NaOH調整pH至約7.0後，倒 入培養皿中作成平板培養基），利用已滅菌之 L型彎曲玻棒進行塗抹，使檢液均勻分布於培 養基表面，於37℃培養72小時後，計算菌落數
(28)。
犴乳酸菌之生理生化鑑定 1. 革蘭氏染色
將無菌水滴於乾淨之載玻片上，鉤取培養基上 之菌落，以無菌水作成均勻抹片，過火焰2~3次 固定後以革蘭氏染色組進行染色，先以結晶紫 染液（crystal violet）染色1分鐘後，用水洗去 染料，再加數滴革蘭氏碘液（Gram's iodine）固 定，1分鐘後用95％乙醇沖洗玻片，進行脫色，
最後以哈克氏複染液（Hucker's safranin）複染 45秒後以水洗去染料，靜置風乾後以光學顯微 鏡觀察結果。革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏 陰性菌呈粉紅色，乳酸菌應呈陽性反應。
2. 觸酶（catalase）試驗
以接種環鉤取培養基上之菌落塗抹於載玻片 上，滴上3％H2O2溶液，觀察是否產生氣泡。有 氣泡產生者為「陽性」反應，無氣泡產生者為
「陰性」反應，乳酸菌應呈陰性反應。
3. API 50 CHL Biotest Kit菌種鑑定
將受試菌株接種在MRS平板培養基上，於37℃
厭氧環境培養24小時後，以無菌棉花棒沾取菌 落，懸浮於無菌水2 mL中混合均勻為懸浮菌 液。吸取懸浮菌液數滴，滴於無菌水5 mL中，
混合均勻使濃度相當於McFarland 2，紀錄滴數 為n。另吸取2 n滴懸浮菌液，滴於API 50 CHL 培養液中，混合均勻後為試驗菌液。培養盒中 灑上無菌水以保持溼度，將試劑條放入盒中，
以無菌滴管吸取試驗菌液注入試劑槽中，加入 無菌礦物油，蓋上外蓋，於37℃厭氧培養24及
48小時後進行判讀。
犵乳酸菌菌株16S rDNA之PCR檢測 1. DNA之製備
乳 酸 菌 菌 株 之 染 色 體 D N A 抽 取 乃 利 用 PUREGENE® Genomic DNA Purification Kit商業 套組進行製備。將受試菌株接種於MRS培養液 隔夜培養後，取懸浮菌液1 mL至1.5 mL離心管 中，以15,000 x g 離心1分鐘後移去上清液，加 入套組中提供之細胞懸浮溶液（cell suspension solution）300 µL，以微量吸管輕輕上下吸放，
使菌體均勻懸浮，再加入細胞溶解酵素溶液
（lytic enzyme solution）1.5 µL 反轉混合25次 後，於37℃ 培養30分鐘以破壞細胞壁。反應完 成後以15,000 x g離心1分鐘，將上清液丟棄。
沉澱物加入細胞溶解溶液（cell lysis solution）
300 µL，以微量吸管輕輕上下吸放，使沉澱均 勻懸浮後，於80℃作用30分鐘使細胞溶解。反 應完成後冷卻至室溫，加入蛋白質沉澱溶液
（protein precipitation solution）100 µL，進行劇 烈震盪，混合均勻置於冰上30分鐘使蛋白質沉 澱後，以15,000 x g 離心3分鐘。將含有DNA之 上清液移入含有isopropanol（2-propanol）300 µL之1.5 mL離心管中，反轉混合50次後，以 15,000 x g離心1分鐘，此時底部會有白色DNA 沉澱物，將上清液倒出，再加入70％乙醇300 µL，震盪數秒以清洗DNA，之後以15,000 x g離 心1分鐘，小心地去除上清液，倒置在乾淨紙上 15分鐘。最後加入無菌水100 µL，使DNA完全 溶解，放至隔夜後即可作為DNA模板，保存於 4℃備用，或保存於-20℃。
2. 聚合酶鏈鎖反應
利用萃取之乳酸菌菌株DNA模板進行聚合酶 鏈鎖反應，反應試劑組成分為2.5 mM dNTP
（N=A, T, G, C） 2 µL，2 U/µL DNA聚合 酶（DyNAzyme TM II）0.5 µL，10X緩衝溶 液（DyNAzyme TM II）2.5 µL，DNA模板1 µL，2.5 µM引子組（Bflact2/Bflact5, BiLON-1/
BiLON-2, BiBIF-1/BiBIF-2）2.5 µL或引子組
（La1/La2, LB1/LLB1, Lc1/Lc2）4 µL如表一
（本實驗使用之6對 PCR 引子組係參考相關 文獻資料，委由德國TIB MOLBIOL公司所合 成），最後以無菌去離子水調整反應總體積為 25 µL，置於0.2 mL微量離心管中，而後將微量 離心管置入PCR thermocycler，PCR反應條件如 表二。取聚合酶鏈鎖反應產物10 µL加入1/10X 染劑，混合均勻，將其小心注入2.0％瓊脂膠片 之凹槽中，於1X TBE buffer中進行電泳分離約 25分鐘後，經ethidium bromide染色，置於UV Box下觀察後拍照紀錄。
玎李斯特菌之檢測
依據行政院衛生署88.11.22衛署食字第88072701 號公告「食品微生物之檢驗方法—乳品中李斯 特菌之檢驗」(29)進行檢驗。
甪沙門氏菌之檢測
表一、本實驗使用之引子
Species Primer code Sequence Target site Length
(bp)
Product
size (bp) Reference
B.lactis Bflact2 GTGGAGACACGGTTTCCC 991-1009 18 680 Ventura et al., 2001
Bflact5 CACACCACACAATCCAATAC 1651-1671 20
B. longum BiLON-1 TTCCAGTTGATCGCATGGTC 182-201 20 831 Matsuki et al., 1999
BiLON-2 GGGAAGCCGTATCTCTACGA 1028-1008 20
B. bifidum BiBIF-1 CCACATGATCGCATGTGATTG 184-204 21 278 Matsuki et al., 1999
BiBIF-2 CCGAAGGCTTGCTCCCAAA 475-442 19
L. acidophilus La1 GATCGCATGATCAGCTTATA 205-224 20 123 Furet et al., 2004
La2 AGTCTCTCAACTCGGCTATG 328-309 20
L. bulgaricus LB1 AAAAATGAAGTTGTTTAAAGTAGGTA 640-665 26 1065 Torriani et al., 1999
LLB1 AAGTCTGTCCTCTGGCTGG 1686-1704 19
L. casei Lc1 GTGCTTGCACTGAGATTCGACTTA 61-84 24 124 Furet et al., 2004
Lc2 TGCGGTTCTTGGATCTATGCG 185-165 21
表二、本實驗使用之PCR 反應條件
PCR Primers Target strain PCR condition
Denaturation Amplificationa Extension (℃) (min) (℃) (min) (℃) (min)
95 30
Bflact2/ Bflact5 B.lactis 92 2 58 20 72 1
72 30
95 30
BiLON-1/ BiLON-2 B. longum 92 2 58 20 72 1
72 30
95 30
BiBIF-1/ BiBIF-2 B. bifidum 92 2 58 20 72 1
72 30
94 30
La1/La2 L. acidophilus 94 3 60 30 72 1
72 90
94 45
LB1/ LLB1 L. bulgaricus 94 2 58 30 72 10
72 30
94 30
Lc1/Lc2 L. casei 94 3 60 30 72 1
72 90
aTotal cycles were 35
表三、市售含益生菌奶粉標示之乳酸菌種類及菌數含量 序 號
品名
活性乳酸菌 (log CFU/g)雙叉桿菌 (Bifidobacterium) (log CFU/g)乳酸桿菌 (Lactobacillus) (log CFU/g) 標示值平均 檢測值a標示菌株標示值平均 檢測值標示菌株標示值平均 檢測值 1桂格成長奶粉健康三益菌配方>57.1B. lactis>67.1L. acidophilus, L. casei－6.8 2桂格高鈣低脂三益菌全家奶粉－b 7.1B. lactis>67.0L. acidophilus, L. casei>56.9 3桂格高鈣脫脂奶粉>57.4B. lactis>67.3L. acidophilus, L. casei－7.3 4桂格小學生奶粉>5.76.8B. lactis－6.5L. acidophilus, L. casei－6.2 5桂格敏兒成長奶粉>55.9B. lactis－5.6L. acidophilus, L. casei－5.4 6桂格高鐵高鈣脫脂奶粉健康三益菌配方>66.4B. lactis－6.6L. acidophilus, L. casei－6.6 7桂格媽媽多力>5.76.6B. lactis－6.4L. acidophilus, L. casei－6.8 8豐力富高鈣低脂奶粉－6.4B. lactis>66.3－－--- 9亞培幼兒恩美力1~3歲幼兒專用－7.1Bifidobacterium spp.>66.8L. acidophilus>67.1 10普健金愛兒壯舒暢配方－5.9－－---c Lactobacillus spp.>5.86.2 11普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉>5.86.0Bifidobacterium spp.－5.4Lactobacillus spp.－5.6 12安佳shape-up 葡萄子高鐵高鈣脫脂奶粉>66.6Bifidobacterium spp.－6.3－－--- 13雀巢特優成長奶粉1+>56.9Bifidobacterium spp. >77.5－－--- 14雀巢成長羊奶粉－6.7Bifidobacterium spp.>66.6－－--- 15雀巢能恩比菲德氏配方－7.2Bifidobacterium spp.>77.3－－--- a2重複 b未標示 c未檢驗
依 據 行 政 院 衛 生 署 9 1 . 1 0 . 1 4 衛 署 藥 檢 字 第 0910064244號公告「食品微生物之檢驗方法—
沙門氏桿菌之檢驗」(30)進行檢驗。
癿大腸桿菌及大腸桿菌群之檢測
依 據 行 政 院 衛 生 署 9 0 . 0 1 . 2 0 衛 署 食 字 第 0900025538號公告「食品微生物之檢驗方法—
大腸桿菌之檢驗」(31)及CNS 10984/N6194「食 品微生物之檢驗方法—大腸桿菌群之檢驗」(32) 標準檢驗方法進行檢驗。
結果與討論
本計畫以價購方式於超級市場、大賣場及藥局等 地區購得標示含益生菌奶粉共計15項產品，每項各2個 批次，共計30件檢體，產品標示之乳酸菌種類及菌數 如表三。針對產品標示之活性乳酸菌、雙叉桿菌（Bifi- dobacterium）及乳酸桿菌（Lactobacillus）進行乳酸菌 種類及菌數檢測，鑑別試驗包括革蘭氏染色、菌株型 態觀察、觸酶試驗及API 50 CHL醣類發酵試驗等表現 型鑑別試驗及聚合酶連鎖反應（polymerase chain reac- tion, PCR）。並依乳品衛生標準(24)進行包括李斯特菌、
沙門氏菌、大腸桿菌及大腸桿菌群之檢驗。
灱乳酸菌菌數之檢測結果
活性乳酸菌數之檢測結果如表三，15項產品中，9 項標示其活性乳酸菌數大於5~6 log CFU/g，結果 顯示菌數介於5.9~7.4 log CFU/g，均符合標示值；
另6項產品未標示菌數含量，結果顯示其菌數介於 5.9~7.2 log CFU/g。雙叉桿菌菌數之檢測結果如 表三，15項產品中，標示含有雙叉桿菌者14項，
1項未標示。含有雙叉桿菌產品14項中，8項標示 其雙叉桿菌菌數大於6~7 log CFU/g，結果顯示菌 數介於6.3~7.5 log CFU/g，均符合標示值；另6項 未標示菌數含量，結果顯示其菌數介於5.4~6.6 log CFU/g。乳酸桿菌菌數之檢測結果如表三，15項產 品中，標示含有乳酸桿菌者10項，5項未標示。含 有乳酸桿菌產品10項中，3項標示其乳酸桿菌菌數 大於5~6 log CFU/g，結果顯示菌數介於6.2~7.1 log CFU/g，均符合標示值；另7項未標示含量，結果 顯示其菌數介於5.4~7.3 log CFU/g。
牞乳酸菌之表現型鑑別試驗結果
本研究針對產品標示之乳酸菌種類進行檢測，所 有檢測之乳酸菌株皆呈革蘭氏陽性反應，觸酶 試驗皆為陰性反應。於光學顯微鏡下觀察菌株 型態發現，Bifidobacterium spp.呈不規則桿狀；
Lactobacillus spp.呈桿狀。利用API 50 CHL醣類 發酵試驗套組進行檢測，觀察菌株對各種醣類的 利用情形，API 50 CHL套組可同時分析乳酸菌對 49種醣類的代謝利用，經與電腦軟體中資料庫進 行比對，以鑑定出最可能之屬名與種名，檢測結 果如表四，15項產品中，8項產品標示含有L. aci- dophilus，經電腦軟體判讀結果顯示其鑑定百分率 介於98.3~99.2％，2項產品標示含有Lactobacillus spp.，經電腦軟體判讀結果皆為L. acidophilus，其 鑑定百分率分別為98.4％及98.8％。其它產品標 示之乳酸菌菌株為資料庫中未記錄之菌種，如L.
casei、Bifidobacterium spp.及B. lactis，則未進行此 項檢測。
犴乳酸菌之聚合酶連鎖反應鑑定結果
已有許多文獻報導利用乳酸菌之16S rDNA區域，
設計PCR引子組來鑑定乳酸菌種，針對市售產品 中常見之乳酸菌種類，搜尋相關文獻。針對本研 究檢體中乳酸菌種類進行鑑定。產品中乳酸菌菌 株之染色體DNA經萃取後，分別以6對PCR引子組 進行PCR增幅反應，將所得之PCR產物進行電泳 分析，檢測結果如表五。
用以鑑定B. lactis之引子組Bflact2/Bflact5係引 用Ventura等(33)報導之方法，其 PCR擴增產物為 680 bp；用以鑑定B. longum之引子組BiLON-1/
BiLON-2係引用Matsuki等(34)報導之方法，其PCR 擴增產物為831 bp；用以鑑定B. bifidum之引子組 BiBIF-1/BiBIF-2係引用 Matsuki等(34)報導之方法，
其PCR擴增產物為278 bp。結果顯示8項標示含有 B. lactis之產品以引子組Bflact2/Bflact5進行PCR 反應皆有偵測到一段長約680 bp的DNA片段如 圖一。6項標示含有Bifidobacterium spp.之產品，
分別以引子組Bflact2/Bflact5、引子組BiBIF-1/
BiBIF-2及引子組 BiLON-1/BiLON-2進行PCR反 應，結果顯示6項產品對引子組Bflact2/Bflact5為 正反應，皆偵測到一段長約680 bp的DNA片段，
對引子組BiLON-1/BiLON-2及引子組BiBIF-1/
BiBIF-2為負反應，皆未偵測到相對應產物片段，
如圖二及圖三，顯示所含菌株為B. lactis。
引子組La1/La2係引用Furet等(35)報導之方法，用以 鑑定L. acidophilus，其PCR擴增產物為123 bp；引 子組LB1/LLB1係引用Torriani等(36)報導之方法，用 以鑑定L. bulgaricus，其PCR擴增產物為1065 bp；
引子組Lc1/Lc2係引用Furet等(35)報導之方法，用以 鑑定L. casei，其PCR擴增產物為124 bp。結果顯 示8項標示含有L. acidophilus 之產品皆有偵測到一 段長約123 bp 的DNA片段如圖四。7項標示含有 L. casei之產品皆有偵測到一段長約124 bp的DNA 片段如圖五。2項標示含有Lactobacillus spp.之產 品，分別以引子組La1/La2、引子組LB1/LLB1及 引子組Lc1/Lc2進行PCR反應，結果顯示2項產品 對引子組La1/La2為正反應，皆偵測到一段長約 123 bp 的DNA片段，對引子組LB1/LLB1及引子組 Lc1/Lc2為負反應，皆未偵測到相對應產物片段如 圖六，顯示所含菌株為L. acidophilus。
犵李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌及大腸桿菌群之 檢驗結果
乳品類衛生標準規定乳粉中大腸桿菌群為10 MPN/
g以下；大腸桿菌、李斯特菌及沙門氏菌為「不得 檢出」。本研究抽購之15項產品均未檢出李斯特 菌、沙門氏菌、大腸桿菌及大腸桿菌群。
結 論
市售含益生菌奶粉之產品15項（30件），經檢測 其實際乳酸菌含量，結果發現活性乳酸菌、雙叉桿菌 及乳酸桿菌之菌數均與標示相符。在乳酸菌之表現型
表四、市售含益生菌奶粉之API 50 CHL醣類發酵試驗結果
序號 品名 標示乳酸菌種類 API 50 CHL檢測結果 ID (%)a
1 桂格成長奶粉健康三益菌配方 B. lactis －b --- c
L. acidophilus L. acidophilus 98.6
L. casei － ---
2 桂格高鈣低脂三益菌全家奶粉 B. lactis － ---
L. acidophilus L. acidophilus 99.1
L. casei － ---
3 桂格高鈣脫脂奶粉 B. lactis － ---
L. acidophilus L. acidophilus 98.3
L. casei － ---
4 桂格小學生奶粉 B. lactis － ---
L. acidophilus L. acidophilus 99.1
L. casei － ---
5 桂格敏兒成長奶粉 B. lactis － ---
L. acidophilus L. acidophilus 99.2
L. casei － ---
6 桂格高鐵高鈣脫脂奶粉健康三益菌配方 B. lactis － ---
L. acidophilus L. acidophilus 98.8
L. casei － ---
7 桂格媽媽多力 B. lactis － ---
L. acidophilus L. acidophilus 99.2
L. casei － ---
8 豐力富高鈣低脂奶粉 B. lactis － ---
9 亞培幼兒恩美力1~3歲幼兒專用 Bifidobacterium spp. － ---
L. acidophilus L. acidophilus 99.2 10 普健金愛兒壯舒暢配方 Lactobacillus spp. L. acidophilus 98.4
11 普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉 Bifidobacterium spp. － ---
Lactobacillus spp. L. acidophilus 98.8 12 安佳shape-up葡萄子高鐵高鈣脫脂奶粉 Bifidobacterium spp. － ---
13 雀巢特優成長奶粉1+ Bifidobacterium spp. － ---
14 雀巢成長羊奶粉 Bifidobacterium spp. － ---
15 雀巢能恩比菲德氏配方 Bifidobacterium spp. － ---
aID, accuracy rate of identification result in API database
b－, 未檢測
c---, 資料庫中未記載
表五、市售含乳酸菌奶粉之聚合酶鏈鎖反應結果
序號 品名 乳酸菌種類 PCR 結果 備註
1 桂格成長奶粉健康三益菌配方 B. lactis B. lactis 圖一
L. acidophilus L. acidophilus 圖四
L. casei L. casei 圖五
2 桂格高鈣低脂三益菌全家奶粉 B. lactis B. lactis 圖一
L. acidophilus L. acidophilus 圖四
L. casei L. casei 圖五
3 桂格高鈣脫脂奶粉 B. lactis B. lactis 圖一
L. acidophilus L. acidophilus 圖四
L. casei L. casei 圖五
4 桂格小學生奶粉 B. lactis B. lactis 圖一
L. acidophilus L. acidophilus 圖四
L. casei L. casei 圖五
5 桂格敏兒成長奶粉 B. lactis B. lactis 圖一
L. acidophilus L. acidophilus 圖四
L. casei L. casei 圖五
6 桂格高鐵高鈣脫脂奶粉健康三益菌配方 B. lactis B. lactis 圖一
L. acidophilus L. acidophilus 圖四
L. casei L. casei 圖五
7 桂格媽媽多力 B. lactis B. lactis 圖一
L. acidophilus L. acidophilus 圖四
L. casei L. casei 圖五
8 豐力富高鈣低脂奶粉 B. lactis B. lactis 圖一
9 亞培幼兒恩美力1~3歲幼兒專用 Bifidobacterium spp. B. lactis 圖二
L. acidophilus L. acidophilus 圖四
10 普健金愛兒壯舒暢配方 Lactobacillus spp. L. acidophilus 圖六 11 普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉 Bifidobacterium spp. B. lactis 圖二 Lactobacillus spp. L. acidophilus 圖六 12 安佳shape-up葡萄子高鐵高鈣脫脂奶粉 Bifidobacterium spp. B. lactis 圖二 13 雀巢特優成長奶粉1+ Bifidobacterium spp. B. lactis 圖三
14 雀巢成長羊奶粉 Bifidobacterium spp. B. lactis 圖三
15 雀巢能恩比菲德氏配方 Bifidobacterium spp. B. lactis 圖三
鑑別試驗及聚合酶連鎖反應方面，所有產品之檢測結 果皆與所標示菌株相符。檢測結果所含乳酸菌種類包 括有L. acidophilus、L. case及B. lactis；活性乳酸菌數、
雙叉桿菌數及乳酸桿菌數介於5.4~7.5 log CFU/g。衛 生品質檢測方面，15項（30件）檢體均未檢出李斯特 菌、沙門氏菌、大腸桿菌及大腸桿菌群。
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8.
9.
圖一、 以Bflact2/Bflact5引子組檢測含B. lactis產品之PCR結 果。
Lane a : 100 bp ladder
Lane b : B. lactis BCRC 17394 (Postive Control) Lane c : 桂格成長奶粉健康三益菌配方 Lane d : 桂格高鈣低脂三益菌全家奶粉 Lane e : 桂格高鈣脫脂奶粉
Lane f : 桂格小學生奶粉 Lane g : 桂格敏兒成長奶粉
Lane h : 桂格高鐵高鈣脫脂奶粉健康三益菌配方 Lane i : 桂格媽媽多力
Lane j : 豐力富高鈣低脂奶粉
Lane k : B. longum BCRC 11847 (Negative Control) Lane l : B. bifidum BCRC 14615 (Negative Control) Lane m : L. acidophilus BCRC 10695 (Negative Control)
圖二、 以Bflact2/Bflact5、BiBIF-1/ BiBIF-2及BiLON-1/BiLON-2 引子組檢測含Bifidobacterium spp.產品之PCR結 果。
Lane a : 100 bp ladder
Lane b : B. lactis BCRC 17394 (Postive Control) Lane c : 亞培幼兒恩美力1~3歲幼兒專用 Lane d : 普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉 Lane e : 安佳shape-up葡萄子高鐵高鈣脫脂奶粉 Lane f : B. longum BCRC 11847 (Negative Control) Lane g : B. bifidum BCRC 14615 (Postive Control) Lane h : 亞培幼兒恩美力1~3歲幼兒專用 Lane i : 普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉 Lane j : 安佳shape-up葡萄子高鐵高鈣脫脂奶粉 Lane k : B. lactis BCRC 17394 (Negative Control) Lane l : B. longum BCRC 11847 (Postive Control) Lane m : 亞培幼兒恩美力1~3歲幼兒專用 Lane n : 普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉 Lane o : 安佳shape-up葡萄子高鐵高鈣脫脂奶粉 Lane p : B. lactis BCRC 17394 (Negative Control) Lane q : 100 bp ladder
a b c d e f g h i j k l m
1000 bp-- 500 bp--
a b c d e f g h i j k l m n o p q 引子組Bflact2/Bflact5引子組Bflact2/Bflact5
BiLON-1/ BiLON-2 BiBIF-1/ BiBIF-2
Bflact2/Bflact5
1000 bp-- 500 bp--
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圖三、 以Bflact2/Bflact5、BiBIF-1/BiBIF-2及BiLON-1/BiLON-2 引子組檢測含Bifidobacterium spp.產品之PCR結果
（續）。
Lane a : 100 bp ladder
Lane b : B. lactis BCRC 17394 (Postive Control) Lane c : 雀巢特優成長奶粉1+
Lane d : 雀巢成長羊奶粉 Lane e : 雀巢能恩比菲德氏配方
Lane f : B. longum BCRC 11847 (Negative Control) Lane g : B. bifidum BCRC 14615 (Postive Control) Lane h : 雀巢特優成長奶粉1+
Lane i : 雀巢成長羊奶粉 Lane j : 雀巢能恩比菲德氏配方
Lane k : B. lactis BCRC 17394 (Negative Control) Lane l : B. longum BCRC 11847 (Postive Control) Lane m : 雀巢特優成長奶粉1+
Lane n : 雀巢成長羊奶粉 Lane o : 雀巢能恩比菲德氏配方
Lane p : B. lactis BCRC 17394 (Negative Control) Lane q : 100 bp ladder
a b c d e f g h i j k l m n o p q BiLON-1/ BiLON-2 BiBIF-1/ BiBIF-2
Bflact2/Bflact5
1000 bp-- 500 bp--
a b c d e f g h i j k l m
100 bp--- 500 bp--
圖四、 以La1/La2引子組檢測含L. acidophilus產品之PCR結 果。
Lane a : 100 bp ladder
Lane b : L. acidophilus BCRC 10695 (Postive Control) Lane c : 桂格成長奶粉健康三益菌配方
Lane d : 桂格高鈣低脂三益菌全家奶粉 Lane e : 桂格高鈣脫脂奶粉
Lane f : 桂格小學生奶粉 Lane g : 桂格敏兒成長奶粉
Lane h : 桂格高鐵高鈣脫脂奶粉健康三益菌配方 Lane i : 桂格媽媽多力
Lane j : 亞培幼兒恩美力1~3歲幼兒專用
Lane k : L. bulgarics BCRC 10696 (Negative Control) Lane l : L. casei BCRC 10697 (Negative Control) Lane m : B. lactis BCRC 17394 (Negative Control)
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29.
30.
31.
圖五、以Lc1/Lc2引子組檢測含L. casei產品之PCR結果。
Lane a : 100 bp ladder
Lane b : L. casei BCRC 10697 (Postive Control) Lane c : 桂格成長奶粉健康三益菌配方 Lane d : 桂格高鈣低脂三益菌全家奶粉 Lane e : 桂格高鈣脫脂奶粉
Lane f : 桂格小學生奶粉 Lane g : 桂格敏兒成長奶粉
Lane h : 桂格高鐵高鈣脫脂奶粉健康三益菌配方 Lane i : 桂格媽媽多力
Lane j : L. acidophilus BCRC 10695 (Negative Control) Lane k : L. bulgarics BCRC 10696 (Negative Control) Lane l : B. lactis BCRC 17394 (Negative Control)
圖六、 以La1/La2、LB1/ LLB1及Lc1/Lc2引子組檢測含 Lactobacillus spp.產品之PCR結果。
Lane a : 100 bp ladder
Lane b : L. acidophilus BCRC 10695 (Postive Control) Lane c : 普健金愛兒壯舒暢配方
Lane d : 普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉
Lane e : L. bulgarics BCRC 10696 (Negative Control) Lane f : L. casei BCRC 10697 (Negative Control) Lane g : L. bulgarics BCRC 10696 (Postive Control) Lane h : 普健金愛兒壯舒暢配方
Lane i : 普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉
Lane j : L. acidophilus BCRC 10695 (Negative Control) Lane k : L. casei BCRC 10697 (Negative Control) Lane l : L. casei BCRC 10697 (Postive Control) Lane m : 普健金愛兒壯舒暢配方
Lane n : 普健金愛兒比菲1-7歲幼童奶粉
Lane o : L. acidophilus BCRC 10695 (Negative Control) Lane p : L. bulgarics BCRC 10696 (Negative Control) Lane q : 100 bp ladder
a b c d e f g h i j k l
100 bp--- 500 bp--
La1/La2 LB1/LLB1
a b c d e f g h i j k l m n o p q Lc1/Lc2
---500 bp ---100 bp ---1000 bp
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35.
36.
Investigations on Microbial Qualities of Commercial Probiotics-containing Milk Powders
YA-JIUN SHEU, CHARNG-FENG KAO, YUEH-JONG CHUNG-WANG AND DANIEL YANG-CHIH SHIH
Food Microbiology Division
ABSTRACT
To investigate the microbial qualities of commercial probiotics-containing milk powders, 30 samples were sampled and tested for the beneficial probiotics of lactobacillus, bifidobacterium and total viable lactic acid bacteria from May to December, 2006. The correspondence between bacterial species and those declared on the labels were identified by conventional biochemical and physiological tests and species-specific PCR. The results showed that the bacterial species used in all milk samples met those declared on the labels and the numbers of lactic acid bacteria in samples were all in compliance with the label claim. These samples were also examined for foodborne pathogens (Listeria monocytogenes, Salmonella spp.) and sanitary indicator bacteria (Escherichia coli and coliforms). All the samples met the requirement of sanitary standard announced by the Department of Health for milk and milk products: MPN of coliform bacteria per mL or per gram, not more than 10; MPN of E. coli per mL or per gram, negatives; L. monocytogenes and Salmonella spp. shall not be detected.
Key words: milk powder, lactic acid bacteria, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella spp.
