科技部補助產學合作研究計畫成果精簡報告
含氯污染場址分子生物監測套件之開發(3/3)
計 畫 類 別 ： 開發型
計 畫 編 號 ： MOST 106-2622-E-006-002-CC2 執 行 期 間 ： 106年02月01日至107年01月31日 執 行 單 位 ： 國立成功大學環境工程學系（所）
計 畫 主 持 人 ： 林財富 共 同 主 持 人 ： 黃良銘
計畫參與人員： 碩士級-專任助理：鄭嘉俊
碩士班研究生-兼任助理：游漢威 博士後研究-博士後研究：莊蕙萍
處 理 方 式 ： 公開方式：立即公開
中 華 民 國 107 年 04 月 30 日
中 文 摘 要 ： 近年來土壤與地下水中氯烯類化合物污染的問題非常受到關注，現 階段最受重視的整治方式之一為現地生物復育法，其關鍵因子為場 址中是否存在具有降解氯烯類污染物能力的微生物。為快速且方便 地將微生物檢測技術應用於現地場址中，本研究延續前兩年DNA、
RNA目標基因檢測，進一步建立一套複合式關鍵基因檢測平台，可同 時量測厭氧脫氯反應中的三個關鍵基因，包括脫鹵球菌
(Dehalococcoides) 16S rRNA、tceA和vcrA基因，偵測極限可達到2 Copies/L groundwater以下，技術並成功地應用於11個環境樣本定 量。
本研究並發展RNA層級之目標基因檢測平台和微生物共營社群定量技 術，分別應用於南部和北部污染場址整治成果監測，結果顯示：一
、生物刺激法中之松下藥劑有助於活化污染場址中現存
Dehalococcoides屬與啟動功能性基因的表現；二、同時具有tceA和 vcrA基因之Dehalococcoides菌屬，如UCH007、BTF08和UCH-
ATV1，在該南部場址屬於優勢；三、地下水流動為氯烯類污染物在 場址中移動的原因之一；四、北部污染場址經200天的生物整治後
，明顯觀察到具降解氯烯類污染物的相關微生物社群與功能性基因 增加1000倍以上。
本研究並整合三年來現地污染場址採樣分析資料，並轉化為現場操 作人員能應用的專家系統，包括彙整地化參數、污染物濃度、微生 物與基因豐富度、微生物對污染物的降解速率等資訊，以推估四種 污染物所需要的降解時間，可將微生物資訊進一步應用於現地污染 場址的生物整治時程規劃。
中 文 關 鍵 詞 ： 複合式基因定量平台、氯烯類降解社群、還原性脫鹵基因、專家系 統
英 文 摘 要 ： In recent years, contamination of chlorinated compounds in soils and groundwater has received more and more concern.
In-situ bioremediation is one of the most common remediation technologies to be used in the sites
contaminated with chlorinated hydrocarbons (HCs). To have successful bioremediation outcomes, the key factor is the presence of chlorinated HCs degrading microbes in the
sites. Following the development of q-PCR based DNA and RNA quantification methods in the first two years of this
project, in this year (the third year), a multiplex genes quantification platform was further established.
Experimental results showed that the system was able to quantify three major genes relvant to anaerobic
dehalogenation, including Dehalococcoides 16S rRNA, tceA and vcrA genes, with detection limit lower than 2 Copies/L groundwater. The system was further tested for 11 samples collected in contaminated sites.
Quantification of RNA-level targeted-genes and co- surviving functional microbes was also developed and tested in two major chlorinated HCs contaminated sites, denoted as the South and the North in Taiwan. The major observations
are summarized here. First, Panasonic chemical, a
commercial chemical used for biostimulation, was found to be able to activate genus Dehalococcoides and functional genes. Secondly, genus Dehalococcoides with tceA and vcrA genes dominated in the South contaminated site including strains UCH007, BTF08 and UCH-ATV1. Thirdly, groundwater flow may affect the transport and migration of chlorinated HCs in the two sites. Fourthly, after bioremediation for 200 days, the abundance of targeted microbes and functional genes in the North site was found to significantly increase by 1000-fold if compared to before remediation.
To set-up a simple expert system for field operation, this study integrates three-years data colleted from the field, including geochemical parameters, pollutant
concentrations, abundance of targeted microbes and genes, and degradation rates of chloroethene species per genes, and develop a simple expert system for the predicition of remediation efficiency. The system may provide a simple estimation for the evaluation of bioremediation time and efficiency based on simple input parameters.
英 文 關 鍵 詞 ： Multiplex gene quantification platform, Chloroethene-
degrading communuty, Reductive dehalogenases, Expert system
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科技部補助產學合作研究計畫成果精簡
(
進度)
報告計畫名稱：含氯污染場址分子生物監測套件之開發
Development of Biomolecular Monitoring Kits for Chlorinated Hydrocarbon Contaminated Sites
計畫類別：□ 先導型 ■ 開發型 □ 技術及知識應用型 計畫編號：MOST 106-2622-E-006-020-CC2
執行期間：民國106 年 02 月 01 日至民國 107 年 01 月 31 日 執行單位：國立成功大學 環境工程系
計畫主持人：林財富 特聘教授 共同主持人：黃良銘 特聘教授
計畫參與人員：莊蕙萍、鄭嘉俊、游漢威
研究摘要（500 字以內）：
近年來土壤與地下水中氯烯類化合物污染的問題非常受到關注，現階段最受重視的整治方式之一 為現地生物復育法，其關鍵因子為場址中是否存有降解氯稀類污染物能力的微生物。為快速且方便地 將微生物檢測技術應用於現地場址中，本研究延續前兩年 DNA、RNA 目標基因檢測，進一步建立一 套複合式關鍵基因檢測平台，可同時量測厭氧脫氯反應反應中的三個關鍵基因，包括脫鹵球菌 (Dehalococcoides) 16S rRNA、tceA 和 vcrA 基因，偵測極限可達到 2 Copies/L groundwater 以下，技術 並成功地應用於11 個環境樣本定量。本計畫並應用三年來所發展之 DNA 和 RNA 層級氯烯類降解菌 群與基因之定量平台，本年度分別應用於台灣南部和北部兩大污染場址，結果顯示生物刺激法能有效 地 培 養 並 活 化 污 染 場 址 中 現 存 之 脫 氯 菌 群 和 功 能 性 基 因 ， 且 以 具 有 兩 種 以 上 關 鍵 基 因 之 Dehalococcoides 屬如 UCH007、BTF08 和 UCH-ATV1 優勢於污染場址。此外，本年度也整合三年來 於現地污染場址採樣所分析獲得的資料庫，並轉化為現場操作人員能應用的專家系統，彙整地化參 數、污染物濃度、微生物與基因豐富度、微生物對污染物的降解速率等資訊，推估污染物所需要的降 解時間，提供現地污染場址生物整治時程規劃的參考。
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人才培育成果說明：
本研究計畫三年的執行期間，已培育至少博士生1 名、碩士生 2 名和助理 1 名。本年度共計有 2
名碩士生參與，計畫內容中的研究規劃、實驗設計、實驗操作、結果討論等方面均可藉由計畫的參與 而獲得相關實驗技術與規劃和統整的概念。此外，在本年度的計畫執行期間與一家合作廠商進行定期 討論，該公司(中環科技公司)多年來在土壤地下水之現地實務經驗，為提升公司競爭力並考量中長程 發展，除了在計畫執行期間將定期派員參與計畫之外，目前已有一名專任助理轉任該公司正式工程 師，協助該公司建立分子生物監測實驗室，以利技術承接；該公司並以應用本計畫開發之技術，用於 南部污染場址整治計畫中，目前並與該公司洽談套件技術轉移中，預期本年度(2018 年)將會有一件技 轉案。整體而言，參與本計畫的相關人員，不僅能在計畫執行期間能學習到相關知識與技術之外，對 於未來的就業選擇具有可預期性，所發展之技術亦具延伸性及推廣性。
技術研發成果說明：
本研究計畫本年度執行期間，針對技術研發成果主要分為三大部分：
(1) 複合式關鍵基因定量平台建立
針對現地氯烯類污染場址中評估厭氧還原脫氯成效的主要三個關鍵基因- Dehalococcoides 屬 16S rRNA、tceA 基因和 vcrA 基因，建立一套快速且便利之檢測分析平台。以 TaqMan-qPCR 為基礎，設計 三組專一性之寡核酸引子探針組，結果顯示三組基因之偵測極限低於2 Copies/L groundwater，且成功 地應用於11 個污染場址環境樣本中定量。
(2) DNA/RNA 定量分析平台應用在南部和北部污染場址之應用
本研究整合前兩年所發展之DNA 層級和 RNA 層級之關鍵基因定量分析平台，應用於台灣南部受 三氯乙烯(TCE)污染的 16 口觀測井中地下水樣本檢測，以比較利用添加藥劑之生物刺激法整治前後，
對場址中關鍵基因與氯烯類污染物和地化參數之影響及相關性。圖1 顯示基因與污染物種與加藥井呈 現正相關，推測生物刺激法將誘發污染場址中現存關鍵基因活性而改變污染物種類與濃度，其中又以 松下藥劑較另外兩種藥劑(糖蜜和乳化油)較能活化關鍵菌群和活化功能性基因。圖 2 顯示 genus Dehalococcoides (Dhc)、vcrA 和 bvcA 三基因之活性與 DO 和 ORP 呈負相關，驗證厭氧還原脫氯環境 有助於活化此三種基因。而兩種VC 還原酵素(vcrA 和 bvcA)與 cis-1,2-DCE 和 VC 轉換具有正相關，且 vcrA 在低氯數污染物轉換的影響較 bvcA 明顯，推測 vcrA 基因為此場址轉換氯烯類污染物之主要貢獻 者。
另一方面，本計畫也應用此分析平台，定量北部受四氯乙烯(PCE)污染的污染場址中關鍵基因之 變化，結果顯示於圖3和圖4。監測結果顯示，在200天的整治期間，可明顯觀察到總細菌群、共營菌 群和主要的Dehalococcoides屬(如圖3)相較於前期(第73天)增加1000倍以上，負責厭氧脫氯反應的四個 功能性基因- pceA基因、tceA基因、bvcA基因和關鍵的vcrA基因(如圖4)均明顯地增加。在第73天只有3 口井中檢測到，經200日後，幾乎所有場址內的井(16口)均可以測到相關基因，顯示場址中的功能性基 因可藉由生物刺激法有效地被活化。
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圖1. PCA 法分析南部污染場址於藥劑添加前後目 標基因(Bac、Dhc、tceA、vcrA 和 bvcA)與污染 物種類(TCE、cis-1,2-DCE 和 VC)間之相關性。
圖2. PCA 法分析南部污染場址中關鍵基因(Bac、
Dhc、tceA、vcrA 和 bvcA)、氯烯類種類(TCE、
cis-1,2-DCE 和 VC)及地化參數(DO、ORP、
temperature 和 pH)三者間之相關性。
圖3. 台灣北部污染場址地下水中 Dehalococcoides 屬之數量。
圖4. 台灣北部污染場址地下水中 vcrA 基因之豐富 度。
(2) 污染場址之專家系統建立
本研究彙整三年來的監測及分析資料，建立一套專家回饋系統，此系統是藉由彙整地化參數、污
染物濃度、微生物與基因豐富度和污染物降解速率，來估算污染物於現地污染場址的降解天數，以提 供現地整治人員進行策略規劃。依本系統推估結果，當北部污染場址中PCE 的初始濃度為 0.15 mg/L 時，需約4 年才能達成生物復育降解污染物的目標。
技術特點說明：
本研究針對受氯烯類污染場址的土壤地下水中，已存在或是可優勢培養的目標菌群，以及可活化 的還原性脫鹵基因，進行生物資訊資料庫之建立，以回饋現場操作人員對於現地生物復育工法的選 擇、改良、操作與效益評估。本研究計畫主要發展的技術特點如下：
(1) 基於 TaqMan-qPCR 技術，發展一套快速且便利的複合式基因定量平台，可快速同時定量場址中多 種目標功能性基因
(2) 規劃一套彙整現地環境參數、污染物濃度和微生物相關資訊的專家回饋系統，可以提供場址操作 時，快速推估整治濃度及時間之關聯性。
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可利用之產業及可開發之產品：
本產學計畫是藉由建立目標微生物與基因的檢測平台與其相關之專家系統，有效掌握現地微生物 狀況以提供整治策略調整之依據，因此除了可應用於目前在亞洲有很大市場需求的土壤地下水整治方 面，也可應用於也可應用於其它環境之微生物系統，如廢水處理 (環工領域)、釀造發酵 (食品)、生質 能源、養殖、農業生產系統等方面。
而針對研究中所設計檢測的所有目標菌群和功能性基因，本研究室可以提供現地運用生物復育工 法之顧問及工程公司進行相關項目的專業檢測，目前與合作廠商進行試劑套件優化，預計經產品優化 和驗證後，可以做為現場操作人員、或是實驗室簡易使用的生物檢測套件。
推廣及運用的價值：如增加產值、增加附加價值或營利、增加投資/設廠、增加就業人 數………等。
本研究計畫所發展的關鍵菌群與還原性脫鹵基因表現之檢測分析平台、複合式基因檢測套件與專 家系統，可提供受氯烯類污染場址生物復育整治期間關鍵的生物資訊，可以協助相關執行污染場址復 育的單位(如顧問公司、檢測公司)，進行目標菌群與基因數量鑑定與定量，及污染物降解程度及所需 時程預估，以協助執行單位量化評估復育工法效益，作為工程操作及改善之基礎及參考。合作企業如 中環科技公司為了延續此研究成果並提升公司競爭力，目前已投入經費於該公司，擬建立分子生物實 驗室，可增加本計畫技術延伸、以及提升相關專長的人員的就業機會。
處理方式：
1.立即公開
(依規定，精簡報告係可供科技部立即公開之資料，並以 4 至 10 頁為原則，如有 圖片或照片請以附加檔案上傳，如因涉及專利、技術移轉案或其他智慧財產權、
影響公序良俗或政治社會安定等，而不宜對外公開者，請勿將其列入精簡報告) 2.本研究是否有嚴重損及公共利益之發現：■否 □是
3.本報告是否建議提供政府單位參考 ■否 □是，
（請列舉提供之單位；本部不經審議，依勾選逕予轉送。）
中 華 民 國 107 年 04 月 30 日
106年度專題研究計畫成果彙整表
計畫主持人：林財富 計畫編號：106-2622-E-006-002-CC2
計畫名稱：含氯污染場址分子生物監測套件之開發(3/3)
成果項目 量化 單位
質化
（說明：各成果項目請附佐證資料或細 項說明，如期刊名稱、年份、卷期、起 訖頁數、證號...等）
國
內 學術性論文
期刊論文 3
篇
1.Donamel M. Saiyari, Hui-Ping Chuang, Delia B. Senoro, Tsair-Fuh Lin, Liang-Ming Whang, Yi-Ting Chou and Yi-Hsuan Chen. A Review in the Current Developments of genus Dehalococcoides, Its Consortia and Kinetics for Bioremediation Options of Contaminated Groundwater.
Sustainable Environmental Research, pp. 1-8, 2018.
2.Henry Yew, Hui-Ping Chuang,
Liang-Ming Whang and Tsair-Fuh Lin.
Distribution of Key Microbes and Functional Genes in the Chlorinated Ethene-Contaminated Groundwater.
Journal of Taiwan Agricultural Engineering, Vol. 63 No.1, pp. 13- 21, 2017 (Chinese).
3.Jia-Jun Tee, Hui-Ping Chuang, Liang-Ming Whang and Tsair-Fuh Lin.
Bioremediation Effect on Key Microorganisms and Targeted Pollutants in the Chlorinated
Ethenes Contaminated Groundwater in South Taiwan. Journal of Taiwan Agricultural Engineering, Vol. 63 No.1, pp. 42-49, 2017 (Chinese).
研討會論文 5
1.Henry Yew, Hui-Ping Chuang, Jia- Jun Tee, Liang-Ming Whang and
Tsair-Fuh Lin. 氯烯類污染場址中關鍵 菌群與基因之動態變化. 台灣微生物生 態學工作坊. 中央研究院, 2017.
2.Jia-Jun Tee, Hui-Ping Chuang, I- Chieh Chien, Liang-Ming Whang and Tsair-Fuh Lin. 氯烯類污染地下水中兩 關鍵性微生物之核醣核酸(RNA)萃取法及 表現量之評估。 The Annual meeting of the 28th Soil and Groundwater Conference, CIH. Env. Eng.,
Taoyuan, Taiwan, 2016. (學生論文競 賽第二名)
3.Herry Yew, Hui-Ping Chuang,
Liang-Ming Whang and Tsair-Fuh Lin.
氯烯類污染場址地下水中關鍵微生物與 基因濃度之分佈. 第九屆地下水資源及 水質保護研討會暨2016海峽兩岸地下水 與水文地質應用研討會. 新竹交通大學, 2016. (學生論文競賽第二名)
4.Jia-Jun Tee, Hui-Ping Chuang, Liang-Ming Whang and Tsair-Fuh Lin.
生物整治對南部某氯烯類污染地下水中 關鍵微生物與污染物之影響. 第九屆地 下水資源及水質保護研討會暨2016海峽 兩岸地下水與水文地質應用研討會. 新 竹交通大學, 2016.
5.Herry Yew, Hui-Ping Chuang, I- Chieh Chien, Pei-Ling Dong, Liang- Ming Whang and Tsair-Fuh Lin.
Quantification of the key microbes and main functional gene in the chlorinated ethenes-contaminated region using SybrGreen-qPCR method.
The Annual meeting of the 27th Soil and Groundwater Conference, CIH.
Env. Eng., Taoyuan, Taiwan, 2015.
(Best Paper Award and 學生論文競賽 第二名)
專書 0 本
專書論文 0 章
技術報告 0 篇
其他 0 篇
智慧財產權 及成果
專利權 發明專利 申請中 1
件
成功大學技轉育成中心立案編號107- 043AP『氯烯類降解菌群之複合式關鍵基 因快速檢測平台』
已獲得 0
新型/設計專利 0
商標權 0
營業秘密 0
積體電路電路布局權 0
著作權 0
品種權 0
其他 0
技術移轉 件數 1 件 目前與合作廠商中環科技股份有限公司
正在洽談技術轉移
收入 0 千元
國
外 學術性論文
期刊論文 0
研討會論文 3 篇
1.Henry Yew, Hui-Ping Chuang, Jia- Jun Tee, Liang-Ming Whang and Tsair-Fuh Lin. Quantification of
Team Microbes for Cooperated Dechlorination in the Selected Chloroethene-Contaminated Sites.
16th International Conference on Civil and Environmental
Engineering. National Cheng Kung University, 2017.
2.Hui-Ping Chuang, Jia-Jun Tee, Henry Yew, Liang-Ming Whang and Tsair-Fuh Lin. Quantification of Gene Dehalococcoides and Reductive Dehalogenases in the Chloroethene- Contaminated Groundwater Regions.
3th International Conference on Contaminated Land, Ecological
Assessment and Remediation, Taipei, Taiwan, November 2016.
3.Hui-Ping Chuang, Jia-Jun Tee, Henry Yew, Liang-Ming Whang and Tsair-Fuh Lin. Changes of Targeted Microbial Populations in the
Chloroethene-Contaminated Groundwater Regions. 6th Joint Forum of Environmental Sciences, Yeosu, Korea, August 2016.
專書 0 本
專書論文 0 章
技術報告 0 篇
其他 0 篇
智慧財產權 及成果
專利權 發明專利 申請中 0
件
已獲得 0
新型/設計專利 0
商標權 0
營業秘密 0
積體電路電路布局權 0
著作權 0
品種權 0
其他 0
技術移轉 件數 0 件
收入 0 千元
參 與 計 畫 人 力
本國籍
大專生 0
人次
碩士生 0
博士生 0
博士後研究員 1 莊蕙萍，負責實驗規劃, 設計, 執行和
報告撰寫, 研討會發表
專任助理 1 陳以暄，負責實驗, 設計, 執行和結果 撰寫
非本國籍
大專生 0
碩士生 1 游漢威，負責實驗, 設計, 執行, 結果
撰寫, 研討會發表
博士生 1 Donamel M. Saiyari，菲律賓人，10個 月短期交流，參與計畫執行
博士後研究員 0
專任助理 1 鄭嘉俊，負責實驗, 設計, 執行, 結果
撰寫, 研討會發表 其他成果
（無法以量化表達之成果如辦理學術活動
、獲得獎項、重要國際合作、研究成果國 際影響力及其他協助產業技術發展之具體 效益事項等，請以文字敘述填列。）
本團隊於此計畫執行期間，參與研討會發表，獲得環工年 會1篇最佳論文獎, 環工年會2篇大專生論文發表獎，第九 屆地下水資源及水質保護研討會1篇論文發表獎
本產學合作計畫研發成果及績效達成情形自評表
成果項目 本產學合作計畫預估研究成果及績效指標
（作為本計畫後續管考之參據） 計畫達成情形
技術移轉 預計技轉授權 2 項 完成技轉授權 0 項
專利
國內 預估 2 件 提出申請 1 件，獲得 0 件
國外 預估 0 件 提出申請 0 件，獲得 0 件
人才培育
博士 1 人，畢業任職於業界 1 人 博士 0 人，畢業任職於業界 0 人 碩士 2 人，畢業任職於業界 2 人 碩士 1 人，畢業任職於業界 1 人 其他 1 人，畢業任職於業界 0 人 其他 1 人，畢業任職於業界 1 人
論文著作
國內
期刊論文 1 件 發表期刊論文 3 件
研討會論文 3 件 發表研討會論文 5 件
SCI論文 0 件 發表SCI論文 0 件
專書 0 件 完成專書 0 件
技術報告 1 件 完成技術報告 0 件
國外
期刊論文 0 件 發表期刊論文 0 件
學術論文 0 件 發表學術論文 0 件
研討會論文 0 件 發表研討會論文 3 件
SCI/SSCI論文 3 件 發表SCI/SSCI論文 0 件
專書 0 件 完成專書 0 件
技術報告 0 件 完成技術報告 0 件
其他協助產業發展
之具體績效 新公司或衍生公司 0 家 設立新公司或衍生公司(名稱)：
計畫產出成果簡述
：請以文字敘述計 畫非量化產出之技 術應用具體效益。
（限600字以內）
本研究計畫的主要具體成果，包含建立一套快速簡便之複合式關鍵基因定量平台
、應用DNA/RNA層級之目標基因檢測技術定量台灣北部與南部兩大污染場址於整治 期間之菌群動態變化，並發展一套涵蓋現地水質資訊、污染物濃度與微生物和基 因豐富度之專家回饋系統。上述研究成果目前已提出一項專利申請，且與合作廠 商中環科技股份有限公司正在洽談技術轉移，預期2018年可以完成一件套件技轉 案。此外，目前另外一位碩士班即將畢業，目前也正在撰寫三篇期刊文章，預計 投稿於Journal of Microbiological Methods和Water Research。另一方面，本 研究所發展之專家系統，也將多方面嘗試應用於不同污染場址，以期瞭解其適用 性，並可藉由調整最佳參數來達到可彈性化應用於不同系統。
請就研究內容與原 計畫相符程度、達 成預期目標情況作 一綜合評估
■達成目標
□未達成目標（請說明，以100字為限）
□實驗失敗 □因故實驗中斷 □其他原因 說明：
本研究具有政策應 用參考價值
■否
□是，建議提供機關
（勾選「是」者，請列舉建議可提供施政參考之業務主管機關）
本研究具影響公共 利益之重大發現
□否
□是
說明：（以150字為限）
建立一套污染場址關鍵微生物檢測分析平台，簡易的複合式基因分析套件，以及 整合現地水質和微生物之專家回饋系統。
