行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
利用雞胚葉細胞進行家禽基因轉殖(2/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2313-B-006-003- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學生物科技研究所 計畫主持人： 戴謙 計畫參與人員： 劉瑞珍 劉振發 蕭振文 黃祥吉 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢 中 華 民 國 92 年 5 月 29 日行政院國科會專題計畫進度報告(第二年) 計畫名稱:利用雞胚葉細胞進行家禽基因轉殖(2/3) 計畫編號: NSC 90-2313-B-006-001 主持人:戴 謙 國立成功大學生物科技研究所 利用基因轉殖家禽作為藥用蛋白質或抗體之生產有其先天 上的優勢，因為家禽之世代間距短，每隻雞平均年產 250 個蛋， 基因轉殖家禽大量繁殖較大動物更容易，而且每一個蛋的蛋白中 含 3g 以上的蛋白質，蛋黃也含有免疫球蛋白，更因為蛋白或蛋黃 中蛋白質純化的過程也相當清楚， 另外用雞胚來生產苗供人纇使 用已實施多年，因此雞蛋是一個理想的藥用蛋白質來源。 本研究室在國科會補助下 88 年著手進行「利用始基生殖細 胞注射法生產嵌合體鴨」計畫，以探討正番鴨與菜鴨間的屬間雜 交（土番）無法生殖的現象，並期望以性腺嵌合體來突破其屬間 隔閡的瓶頸。目前已獲得一隻性腺嵌合正番公鴨，檢定期間此嵌 合鴨與褐色菜鴨配種，其孵出之 154 隻後裔中，有 24 隻褐色菜鴨， 佔 16﹪。證實可利用胚胎始基生殖細胞注入另一品種鴨之胚胎， 來生產性腺嵌合體鴨。 本計畫則更進一步擬利用雞胚葉細胞作為基因轉殖的對 象，以螢光基因（GFP-gene）作為報導基因，來探討利用胚葉細 胞注入 Stage X（未孵化前之受精卵）的胚盤中，或作 in ovo electroporation（卵內電穿孔） 引入外源 DNA 以生產體細胞或性 腺嵌合體，然後再作個體篩選以發現性腺嵌合體。由於 GFP-gene 之螢光表現易於判定，加上 in vivo 電穿孔可以有效地提高外源 DNA 之嵌入，利用此法來建立家禽基因轉殖途徑十分可行，因此 本研究室擬以三年計畫分別進行下列各項技術之開發，以建立家 禽基因轉殖之相關技術。 (1)利用 Stage X 雞受精卵的胚葉細胞之互換來建立土雞與來亨雞 間的性腺嵌合體，以建立利用雞胚葉細胞作為家禽基因轉殖 之途徑。
(2)利用 GFP-gene 作為報導基因來進行 in vivo electroporation 以 便建立家禽生殖細胞基因轉殖之方法。
(3)以 pCMVhAT2f 重組基因（α1-抗胰蛋白基因，human -α1 antitrypsin; hAT）作為外源性 DNA，探討利用 in vitro 電穿 孔法及 in vivo 電穿孔法轉殖入雞胚葉細胞，以基因轉殖雞生 產人類α1-抗胰蛋白的可行性。
第二年進度報告 本計畫中第一年之主要結果如下： 1. 建立取得土雞胚葉細胞並注入另一來亨雞之 stage X 之受精蛋中 之技術，以獲得嵌合雞，此一來亨雞可能為體細胞嵌合雞表型或 完全正常之來亨雞毛色(圖 1)。 2. 育成後進行後裔測試，以便了解是否為生殖系嵌合體，圖 2 所顯 示即為 WL♂64384 測定之結果，證明它可以生出黑色之後裔，為 具有土雞生殖細胞之生殖系嵌合公雞。 3. 本計畫結果顯示利用胚葉細胞之轉移獲得生殖系嵌合雞之技術已 建立。 本計畫之第二年主要結果如下： 1. 利用 Tungsten needles(Dossel,1958)之作法製作末端直徑極細之 電極針（50μm），以便放置於胚盤上進行 in ovo 電穿孔處理。(圖 3) 2. 建立in ovo 電穿孔法進行因轉殖之操作方法，（圖 3），並已孵化 出 5 隻雛雞或雛鴨，其是否帶有外源性轉殖基因正在分析之中。 3. 利用 Single-well electrode 對胚葉細胞進行電穿孔處理，即取 得胚葉細胞後，以 BTX Single-well electrode，以 GFP 為外源性 基因進行電穿孔處理，再將胚葉細胞培養一天約觀察其 GFP 之表 現，證明可以使胚葉細胞表現 GFP 基因 (圖 4)，但轉染率平均為 8%，此 PGC 為低。 4. 為提高移轉用細胞之基因轉染率，本實驗室另外嘗試以供應胚之 PGC 注入受胚者之胚盤中，期待利用本實驗室已經建立之轉染率較 高度（約 50％）的 PGC 外源性基因轉染法來提高注入細胞中帶有 外源性基因之效果，結果證明此法一樣可以孵出雛雞來，因此更 進一步將 PGC 中轉殖入外源基因，注入 stage X 之雞胚盤中，所 孵出之後代目前正育成，擬分析是否帶有外源性基因(圖 5)。
Fig.2 Progeny of germline chimera White Leghorn male (No. 63624) showing the black plumage color of donor breed (Native chicken).
Blastoderm cells collection from Native chicken egg
Blastodermal cells microinjection to the White Leghorn eggs at stage X
White Leghorn chicks hatched from the eggs transferred with the blastodermal cells of Native chicken at stage X Left: WL chicks showing somatic chimera; Right: WL chicks without somatic chimera
Fig.3 In ovo electroporation of chicken balstoderm
Tungsten needles made for in ovo electroporation
In ovo electroporation of chicken egg
Fig.4 Gene transfer by the transfer of blastodermal cells
Collection of blastodermal cells
GFP-gene transfected blastodermal cells
Fig.5 Transfer of cPGC into blastododerm at Stage X
Chick embryo at stage 13-18 cPGC (circulating pgc) collected from stage 13-18
