【11】證書號數：I686477
【45】公告日： 中華民國 109 (2020) 年 03 月 01 日
【51】Int. Cl.： C12N5/04 C12N15/05 C12N15/33 C12N15/63 C12N15/87 A01H1/00
(2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)
C12N5/10 C12N15/09 C12N15/29 C12N15/82 C12Q1/68 A01H5/00
(2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2018.01) (2018.01)
發明 全 8 頁
【54】名 稱：特異性造成植物葉綠體基因變異的轉殖載體、套組、方法及利用其產生之 轉殖植物細胞與農桿菌
【21】申請案號：107114066 【22】申請日： 中華民國 107 (2018) 年 04 月 25 日
【11】公開編號：201945537 【43】公開日期： 中華民國 108 (2019) 年 12 月 01 日
【72】發 明 人： 張清俊 (TW) CHANG, CHING-CHUN；黃致豪 (TW) HUANG, CHIH-HAO；
沈家儀 (TW) SHEN, JIA-YI；劉育彰 (TW) LIU, YU CHANG
【71】申 請 人： 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG UNIVERSITY
臺南市東區大學路 1 號
【74】代 理 人： 郭雨嵐；林發立
【56】參考文獻：
CN 102770539B US 20160298128A1
Sprink, Thorben, Janina Metje, and Frank Hartung. "Plant genome editing by novel tools: TALEN and other sequence specific nucleases." Current Opinion in Biotechnology 32 (2015): 47-53.
Marton, Ira, et al. "From Agrobacterium to viral vectors:
genome modification of plant cells by rare cutting restriction enzymes." International Journal of Developmental Biology
57.6-7-8 (2013): 639-650.
審查人員：劉建宏
【57】申請專利範圍
1. 一種細胞核基因轉殖載體，包括：一啟動子；一葉綠體訊息蛋白基因，其位於該啟動子 下游；一重組 TALEN 蛋白域，包含如 SEQ ID NO：21 或 SEQ ID NO：22 所示之序列；
以及一第一邊界區及一第二邊界區，其中該啟動子、該葉綠體訊息蛋白基因及該重組 TALEN 蛋白域依序位於該第一邊界區與該第二邊界區之間；其中該重組 TALEN 蛋白域 包括編碼一 DNA 辨識蛋白的 DNA 序列；其中該 DNA 辨識蛋白辨識葉綠體之 rpoB 基因 之片段。
2. 如請求項 1 所述之轉殖載體，其中該啟動子為 rbcS 啟動子。
3. 如請求項 1 所述之轉殖載體，其中該重組 TALEN 蛋白域包括一核酸內切酶的 DNA 序 列。
4. 如請求項 3 所述之轉殖載體，其中該核酸內切酶為 Fok I。
5. 如請求項 1 所述之轉殖載體，其中編碼該 DNA 辨識蛋白之 DNA 序列具有如 SEQ ID NO：3 或 SEQ ID NO：4 所示之序列。
6. 如請求項 1 所述之轉殖載體，更包括一篩選基因。
7. 如請求項 6 所述之轉殖載體，其中該篩選基因為一抗藥性篩選基因、一非抗藥性篩選基 因、或其組合。
8. 如請求項 6 所述之轉殖載體，其中該篩選基因包括一卡那黴素(kanamycin)抗性基因或一 甲硫胺酸磺醯亞胺(methionine sulfoximine,MSO)殺草劑抗性基因。
9. 如請求項 8 所述之轉殖載體，其中該卡那黴素抗性基因包括 nptII 或該甲硫胺酸磺醯亞胺 殺草劑抗性基因包括 bar。
10. 如請求項 1 所述之轉殖載體，更包括編碼一標誌物之序列。
11. 如請求項 10 所述之轉殖載體，其中該標誌物包含選自由發光分子、化學發光分子、螢光 染料、螢光猝滅劑、脂質、有色分子、放射性同位素、閃爍劑、生物素、抗生物素蛋 白、鏈黴親和素、蛋白質 A、蛋白質 G、抗體或其片段、聚組胺酸、Ni2+、Flag 標籤、
myc 標籤、HA 標籤、和酶所組成的群組中的可檢測標記物。
12. 如請求項 1 所述之轉殖載體，其包含如 SEQ ID NO：1 或 SEQ ID NO：2 所示之序列。
13. 如請求項 1 所述之轉殖載體，更包括一 rbcS 基因的 3 端非轉錄區，其位於該重組 TALEN 蛋白域下游。
14. 一種特異性造成植物葉綠體基因變異的套組，包括：一第一轉殖載體，包括：一第一啟 動子；一第一葉綠體訊息蛋白基因，其位於該第一啟動子下游；一第一重組 TALEN 蛋 白域，包含如 SEQ ID NO：21 所示之序列；以及一第一邊界區及一第二邊界區，其中該 第一啟動子、該第一葉綠體訊息蛋白基因及該第一重組 TALEN 蛋白域依序位於該第一 邊界區與該第二邊界區之間；以及一第二轉殖載體，包括：一第二啟動子；一第二葉綠 體訊息蛋白基因，其位於該第二啟動子基因下游；一第二重組 TALEN 蛋白域，包含如 SEQ ID NO：22 所示之序列；以及一第三邊界區及一第四邊界區，其中該第二啟動子、
該第二葉綠體訊息蛋白基因及該第二重組 TALEN 蛋白域依序位於該第三邊界區與該第 四邊界區之間；其中該第一重組 TALEN 蛋白域和該第二重組 TALEN 蛋白域包括編碼一 DNA 辨識蛋白的 DNA 序列；其中該 DNA 辨識蛋白辨識葉綠體之 rpoB 基因之片段。
15. 一種產生細胞核基因轉殖植物細胞的方法，包括：建構一對如請求項 1 所述之細胞核基 因轉殖載體；透過一農桿菌將該細胞核基因轉殖載體併入一植物細胞；以及篩選及培養 該植物細胞。
16. 如請求項 15 所述之方法，其中該併入包含一同源性導向的修復機制或一非同源性末端接 合導向的修復機制。
17. 如請求項 15 所述之方法，更包括轉殖該細胞核基因轉殖載體至該農桿菌。
18. 如請求項 15 所述之方法，更包括分析該植物細胞並確認該細胞核基因轉殖載體併入該植 物細胞。
19. 一種細胞核基因轉殖植物細胞，係以請求項 15 所述之方法所建構。
20. 一種農桿菌，包括如請求項 1 所述之細胞核基因轉殖載體。
圖式簡單說明
圖 1 係根據本案所請發明一實施例的細胞核基因轉殖載體的圖譜。其中，A 部分及 B 部 分分別為 pTpTalen-L 與 pTpTalen-R，皆為細胞核基因表現的農桿菌雙偶載體，並且為具葉片
KanR （ npt II）為抗卡那黴素（kanamycin）的篩選標誌基因，而 bar 為抗殺草劑（Methionine sulfoximine, MSO）的篩選標誌基因。TP 為葉綠體訊息蛋白的序列。Flag 為 Flag 標籤，而 HA 為HA 標籤。
圖 2 係於本案所請發明一實施例中利用 PCR 確認共轉殖 pTpTalen-L 與 pTpTalen-R 後基 因是否嵌入菸草基因組中。(A) 所使用之 PCR 引子對 Check-F （SEQ ID NO: 5；
AATTCACTCATTGGATTCATAGAAG）與 Check-R （SEQ ID NO: 6；
CTGTAGCCGAGCGTGCGTAG）位於 pTpTalen-L 和 pTpTalen-R 載體上的位置。(B) 將 6 個 共轉殖菸草品系（M0、M11、M14、M17、M39、M42）、對照組（Wt 為未轉殖菸草）、
pTpTalen-L （Lp）和 pTpTalen-Rp （Rp） 載體等的 DNA，使用特異性引子對 （Check-F 與 Check-R）進行 PCR 擴增放大，再將 PCR 產物以 2.2%的瓊膠電泳進行分離。圖中，M 為 100 bp DNA 標誌。箭頭處為預期 PCR 產物大小分別為 482 bp 和 452 bp。
圖 3 係為根據本案發明一實施例之經細胞核基因轉殖的菸草品系之植株外表型態。如圖 所示，經細胞核基因轉殖之 4 個不同轉殖品系呈現不同程度葉片白化或黃化的外表性狀。WT 為對照組（未轉殖菸草）。M0 為全株白化的植物品系。M11 為 2 個分別生長在培養基或泥 土的不同個體。M17 為 2 個分別生長在培養基或泥土的不同個體。M29 為 2 個分別生長在泥 土中的不同個體。
圖 4 係利用高解析度解離（High Resolution Melting, HRM）分析根據本案發明一實施例之 菸草葉綠體 rpoB 基因的突變。自 WT 對照組（未轉殖菸草）的葉片組織和 2 個不同轉殖品系
（M11 和 M17）的白色葉片組織萃取 DNA，接著利用一對引子（SEQ ID NO: 7；
GGATTTAATCAGATACAATTTGAAG）和 （SEQ ID NO: 8；
TTCCAAATTAATCCCGCGGATAC）進行 Q-PCR （Fast Evagreen ®qPCR Master Mix,
Biotium），以擴增放大重組 TELEN 蛋白作用區域附近的 DNA（229 bp），將 PCR 產物進行 高解析度解離分析（HRM, LightCycler ®Nano, Roche）。結果顯示，轉殖植物的白色葉片組 織（M11-W 和 M17-W）與 WT 對照組有明顯的熔解曲線之差異，因此推測 rpoB 基因發生核 苷酸之變異。
圖 5 係顯示重組 TALEN 蛋白造成根據本案發明一實施例之菸草葉片之葉綠體 rpoB 基因 序列的變異。萃取對照組（WT）和 4 個不同轉殖品系（M0, M11, M17 和 M29）的葉片組 織，其中 M11 和 M17 品系植物的 DNA 又分別萃取自白色（M11-W 和 M17-W）和綠色
（M11-G 和 M17-G）葉片組織。以一對引子（SEQ ID NO: 9；
AGCAGAAGTCTGTTTCTAGGGATGT）和（SEQ ID NO: 10；
TAGCTGATGATAGAACTAGAATA）利用 PCR 去擴增放大 DNA，並將 PCR 產物進行定 序，將定序結果利用 CLC Genomics Workbench 9.5.2 軟體進行多重序列比對。結果顯示，在 轉殖品系 M0，M11，M17 和 M29 的白色或黃化葉片組織（M0-W; M11-W, M17-W, M29）
的 rpoB-295 位置明顯有發生 A 突變至 T 的情形。但是在 M11 和 M17 的綠色葉片組織（M11- G、M17-G）的 rpoB 基因序列則與對照組相同。箭頭處為發生變異之核苷酸。
在以下的詳細描述中，為了解釋本發明，提供了許多具體細節，以便能徹底理解所揭露 的實施方式。然而，顯而易見的是，一個或多個的實施方式可以在沒有所述具體細節的情況 下實現。在其它情況中，為了簡化附圖，習知的結構和流程將以示意性的方式顯示。
