國立宜蘭大學動物科技系研究所 Department of Animal Science
National Ilan University
碩士論文 Master Thesis
利用羥四環素防治蜜蜂美洲幼蟲病的效果 The Control Effects of Oxytetracycline Against the
American Foulbrood Disease of Honey Bees
指導教授：陳裕文 博士
Chen, Yue-Wen Ph. D.
研究生：鄭浩均 Cheng,Hao-Chun
中華民國九十八年一月
中文摘要
美洲幼蟲病（American foulbrood, AFB）是危害西洋蜂（Apis mellifera L.）的一 種重要細菌性病害，病原為可形成孢子的幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus larvae）。為 評估台灣利用羥四環素（oxytetracycline）防治 AFB 的可行性，本研究收集 2006 與 2008 年台灣本土產蜂蜜（599 件）與泰國進口蜜（30 件）共 629 件樣品。從中 取得 263 件本土病原分離株與 11 件泰國分離株。接著利用含 5 µg 紙盤擴散法來測 定病原分離株對羥四環素之敏感性，結果顯示 2006 與 2008 年台灣本土分離株的 抑菌圈分別為 43.0 ± 6.2 及 40.2 ± 8.4 mm （mean ± s.d., n = 208、55），泰國分離株 為 43.3 ± 5.2 mm （n = 11），標準菌（ATCC 9545）則為 58.4 ± 1.6 mm （n = 10），
顯示本土與泰國分離株皆已出現抗藥性。接著，將低感受性病原孢子作為接種源 來進行田間試驗，以測試羥四環素對具耐藥性的台灣本土分離株的防治藥效與殘 留檢測。在藥效評估方面，選取 8 群健壯西洋蜂的 1 日齡幼蟲接種本土具耐藥性 的 P. larvae 孢子，並於試驗期間給予一次含有羥四環素 50 mg 與 125 mg 二種劑 量的糖水，結果顯示兩種處理皆能有效抑制 AFB 的發生。在藥劑殘留量方面，所 有蜂群均於施藥後第 10、20 及 30 日分別搖去儲蜜，並檢測蜂蜜中羥四環素的殘 留量。結果顯示，試驗蜂群必須經過 2 次以上搖除儲蜜，才能有效將羥四環素殘 留量降低至 25 ppb 以下。
關鍵詞：西洋蜂、幼蟲芽孢桿菌、 羥四環素、 防治、 殘留。
Abstract
American foulbrood (AFB) is a serious bacterial disease of honeybee (Apis mellifera L.) caused by the spores of Paenibacillus larvae. In order to appraise the
adequacy of AFB prevention using the oxytetracycline (OTC) in Taiwan, this study collected 2006 and 2008 years Taiwanese domestic honey samples (n=599) and imported honey from Thailand (n=30) for isolating the pathogen. Totally 263 Taiwan isolates of P. larvae and 11 Thailand isolates were obtained. We tested their susceptibility to oxytetracycline by disc-agar diffusion method. The results showed that the zones of inhibition of P. larvae isolates from 2006 and 2008 Taiwan and 2006 Thailand were 43.0 ± 6.2、40.2 ± 8.4 mm ( mean ± s.d., n=208、55 ) and 43.3 ± 5.2 mm ( n=11 ), respectively. Both of them are significantly smaller ( P < 0.05) than that of the type strain of P. larvae (ATCC 9545). Next, a spore inoculums achieved from a Taiwan isolate with lower OTC susceptibility had been carried into the field trials to test the efficacy of OTC for AFB prevention and residues in honey. Honeybee colonies were medicated with OTC syrup and their 1-day-old worker larvae were inoculated with the spore inoculums. The honey of the treated bee colonies were extracted every 10 days after medication for determining OTC residue. Results showed that both of two doses of OTC syrup, 50 mg / colony and 125 mg / colony, well prevented the occurrence of AFB signs in the treated colonies. However, the contaminated honey should be continue to be remove two times thus would effectively reduce the OTC residue allowance to 25 ppb below.
Key words: Apis mellifera L, Paenibacillus larvae, oxytetracycline, control, residue.
目錄
中文摘要...i
英文摘要...ii
壹、前言...1
貳、往昔研究...4
一、 美洲幼蟲病背景資料與發生傳佈...4
二、 病原菌的特性...6
三、 美洲幼蟲病的防治...7
四、 蜂產品中羥四環素的殘留量與檢測法...8
参、材料與方法...10
一、 蜂蜜中美洲幼蟲病原孢子的檢測...10
(一) 蜂蜜樣本的來源...10
(二) 檢測病原孢子數與建立分離株...10
(三) 幼蟲芽孢桿菌分離株對羥四環素的敏感性測試...11
1. 標準菌的試驗...11
2. 本土與進口分離株的試驗...11
二、 羥四環素防治 AFB 的效果...11
(一) 孢子接種源的製備...11
(二) 田間蜂群的防治試驗...12
三、 蜂產品中羥四環素的檢測法...12
1. 試藥與器材...13
2. 分析方法...13
(1) HPLC 操作條件...13
(2) 檢量線...13
(一) 蜂蜜樣品的分離與淨化...14
(二) 蜂王乳樣品的分離與淨化...14
(三) 蜂花粉樣品的分離與淨化...15
四、 田間蜂蜜樣品的檢測...15
肆、結果...16
一、 蜂蜜中美洲幼蟲病原孢子的檢測...16
二、 幼蟲芽孢桿菌分離株對羥四環素的感受性...17
三、 羥四環素防治 AFB 的效果...18
(一) 孢子接種源取得的結果...18
(二) 田間蜂群防治試驗結果...18
四、 蜂產品中羥四環素的檢測法...19
五、 田間蜂蜜樣品中羥四環素殘留測定...19
伍、討論...21
一、 蜂蜜樣品中美洲幼蟲病原孢子的探討...21
二、 OTC 對幼蟲芽孢桿菌分離株的探討...22
三、 OTC 的防治效果...24
四、 OTC 殘留檢測法...24
五、 蜂蜜中 OTC 殘留測定探討...25
六、 美洲幼蟲病的防治策略...26
陸、引用文獻...39
柒、附錄...51
表次
表一、以平盤培養法檢測 2006 和 2008 年蜂蜜樣本的病原孢子檢出率...28
表二、利用含 5 µg 羥四環素紙錠測量幼蟲芽孢桿菌不同分離株的抑菌圈...29
表三、幼蟲芽孢桿菌分離株對 5 µg 羥羥羥羥四環素紙錠的敏感性分類...30
表四、餵飼 50 mg 及 125 mg OTC 糖水後，各蜂箱 10、20 及 30 日蜂蜜的 OTC 殘 留量...31
圖次
圖一、2006 年與 2008 年台灣地區蜂蜜樣本中美洲幼蟲病原孢子數含量（CFU/g）。
( A ) 2006 年檢測結果( B ) 2008 年檢測結果...32
圖二、1 日齡蛹體注射 Paenibacillus larvae 的孢子，1 個月後蟲體呈現乾癟狀美洲 幼蟲病徵...33
圖三、蜂群餵飼 125 mg OTC 糖水處理前後接種 P. larvae 孢子幼蟲發病率...34
圖四、蜂群餵飼 50 mg OTC 糖水處理前後接種 P. larvae 孢子幼蟲發病率...35
圖五、接種 Paenibacillus larvae 孢子於田間蜂群，12 天後蟲體呈現腐爛狀美洲幼 蟲病徵...36
圖六、濃度 5.0µg/ml OTC 於高效能液相色層分析儀所呈現的圖譜, 所使用的管 柱為 ZORBAX SB-C18, 4.6×250 mm，5µm, 移動相為咪唑緩衝溶液 / 甲醇 ( 77 ：23,v/v)，檢測器為螢光檢測器，檢測波長分為激發波長 380 nm，發 射波長 520 nm 流速 1.0 ml/min，進樣量 100µl...37
圖七、不同蜂產品含濃度 5.0µg/ml OTC 於高效能液相色層分析儀所呈現的圖譜，
所使用的管柱為 ZORBAX SB-C18 4.6×250 mm，5µm，移動相為咪唑緩衝 溶液 / 甲醇 ( 77 ：23,v/v )，檢測器為螢光，檢測波長分為激發波長 380 nm, 發射波長 520 nm，流速 1.0 ml/min，進樣量 100µl，(A) 羥四環素標準品；
(B) 蜂蜜...38
壹、前言
蜜蜂（honeybee）是一種真社會性昆蟲（eusocial insects）。一個強勢的蜂群約 分別含有 20,000 至 30,000 隻的成蜂與幼蟲。蜂群由形態、機能不同的三種階級蜜 蜂組成：蜂王、雄蜂及工蜂；蜂王專司產卵及繁殖後代之職責；雄蜂唯一功用是 與處女蜂王交尾，工蜂則擔任巢內外所有的工作，包括防禦外敵、建構巢脾、清 理巢房、養育幼蟲、巢房封蓋、採集並貯存蜂蜜及花粉（Winston, 1987; 安等，
2004）。同時牠們也是作物、水果與野花重要的授粉媒介。因此，不僅對於一個能 維持一定水平且有營利的農業來說不可或缺，也對於非農業生態系統的維持相當 重要（Dominique et al., 2008）。
正常的蜂群內都能維持相當穩定的生態環境條件，除了能夠調節巢內的溫 度、濕度、氣體交換和營養，蜂群本身也有自我適度調整的能力，以適應巢內環 境變化、維持個體的正常發育。個體與群體之間相互影響，成為一種穩定的平衡 狀態。當蜂群受到生態環境激烈變化的影響，不利因素超出蜂巢內自我調適的能 力時，蜂群就會逐漸衰弱，導致蜜蜂生病。蜜蜂的疾病分為非傳染性及傳染性病 害兩類。非傳染性病害由環境中不利因素及生理異常造成，不具傳染性或蔓延給 其他蜂群，如下痢、凍害及饑餓等；而傳染性病害是由於病原或寄生性害蟲會大 量繁殖，導致病徵在蜂群內迅速出現，依病害種類不同而有所差異，如美洲幼蟲 病（American foulbrood，以下簡稱 AFB）、蜂微粒子病（nosema disease）及歐洲 幼蟲病（European foulbrood）。此外，由於蜜蜂具有清潔行為（hygienic behaviour）
（Woodrow, 1941; Thompson, 1964; Spivak and Gilliam, 1993; Riessberger and Crailsheim, 1997; Hrassnigg et al., 2000），因此在疾病潛伏時，蜂群常會自行清除罹 病體，因此病原需在蜂群中達到一定程度的數量後，才會被養蜂者發現，並依病 原數量的多寡，而使蜜蜂出現不同程度的病徵。（陳，2004; 陳和陳，2007）。
台灣位於亞熱帶地區氣候溫暖多濕，飼養的西洋蜂群密度高，再加上常隨蜜 源花期而遷移飼養場所，並於管理蜂群時經常調換巢脾，為蜜蜂病蟲害的發生及 蔓延產生有利條件，因此，若爆發嚴重的病蟲害，便容易造成疾病的傳佈，導致 大規模的經濟損失（馮，1995；安等，2004；Ritter and Pongthep, 2006; 陳和陳，
2007）。事實上，目前除了小蜂蟎（Tropilaelaps clareae）、氣管蟎（Acarapis woodi）
與蜂箱小甲蟲（Aethina tumida）尚未在台灣發現外，其餘常見的有害生物均已在 台灣的養蜂場發現（陳和陳，2007）；而一般常見的蜜蜂病蟲害中，AFB 是危害西 洋蜂最為嚴重者，除了具有長潛伏期、不易察覺病徵的特性外，若染病蜂群無妥 善處理，該染病蜂群會滅亡，還可能藉由人為管理或蜂群間的盜蜂與迷巢蜂等途 徑（Goodwin et al., 1994），迅速蔓延整個蜂場，造成養蜂場極大的損失（Hornitzky, 1998; Fries and Scott, 2001; Lindström, 2006; Fries et al., 2006）。
AFB 在全世界主要養蜂地區皆普遍的發生（Matheson, 1995），而台灣於 1967 年首度發現 AFB 後（嚴和秦，1971），至今仍影響著各地養蜂場。美國是養蜂技 術進步的國家之一，而該國可合法使用部分抗生素防治 AFB，常藉由羥四環素
（oxytetracycline, OTC）的施用以達到防治 AFB 的效果，然而近年來的報告指出，
AFB 的病原孢子已對該類抗生素產生抗藥性，已經出現抗藥性菌株（Miyagi et al., 2000; Piccini and Zunino, 2001; Evans, 2003; Alippi et al., 2005）。
在台灣的養蜂環境中，農委會並未核准使用羥四環素作為 AFB 防治藥劑，面 對 AFB 的威脅，農政單位建議進行全面性的消毒或是燒燬病徵出現的蜂箱、蜂群 來進行 AFB 的撲滅（陳等，2005），這些方法通常不易被蜂農接受，因其造成蜂 農極大地經濟損失。所以早期仍有許多養蜂業者使用羥四環素作為防治藥劑，因 此，本論文除了廣泛收集台灣地區的蜂蜜樣本以探討病原孢子在台灣的分佈狀況 外，並進一步從蜂蜜樣品中分離眾多的幼蟲芽孢桿菌分離株，檢測其對羥四環素 的感受性，並評估羥四環素對本土蜂群 AFB 的防治效果與藥效持續性，再利用高 效能液相層析法（High Performance Liquid chromatography, HPLC）來檢驗其蜂產
品中殘留的情形，作為防治策略的參考。
本研究利用固相萃取的方式來提取蜂產品中的 OTC，之後再用高效能液相層 析儀並搭配螢光偵測儀來檢測蜂產品中 OTC 的殘留量，並參考 Viñas et al. （2004）
的報告，利用各種蜂產品的差異來調整萃取的方式，期望可成功找出各種蜂產品 中萃取 OTC 的管柱及萃取溶液，並利用田間試驗所收集的蜂產品，測試管柱回收 OTC 的效果，期望能建立一套標準的蜂產品萃取流程。
貳、往昔研究
一、 美洲幼蟲病的背景資料與發生傳佈
美洲幼蟲病在西洋蜂（Apis mellifera L.）中是一種普遍的細菌性病害，其分 佈遍及世界各地（安等，2004; Ellis and Munn, 2005; Ritter and Pongthep, 2006; De Graaf et al., 2006）。AFB 的病原是一種可形成內孢子的細菌（安等，2004; Genersch et al., 2006）--幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus larvae），此病原只有孢子期具有感染 力，成蜂對其具有抗性（Riessberger-Gallé et al., 2001），病原孢子對蜜蜂幼蟲的致 病力與蟲齡的大小關係密切；對西洋蜂 1 日齡幼蟲的致病力很高 LD50為 21 個孢 子，LD95為 442 個孢子；對 2 日齡幼蟲的致病力大為減低，接種 4.5 ×104個孢子 只引起 37.2%的死亡率（陳等, 1997），3 日齡以上的幼蟲與成蜂則不感病；東方蜂
（A. cerana）和非洲蜂（A. m. scutellata）對本病則具有抗性（楊，1973; 陳等，1997;
Chen et al., 2000; Fries and Raina, 2003）。
AFB 幾乎在全世界主要養蜂地區皆有發病的紀錄，由於 AFB 的病原孢子對於 環境抗逆性極高，連養蜂技術進步的美國，蜂群仍有 1.8%的發生率（Shimamuki et al., 1992）。阿根廷在 1989 年首度爆發 AFB，由於無適合的防治方法，導致 AFB 迅速傳染，雖然僅估算蜂群死亡與蜂蜜減產值，便已造成每年約 1 仟萬美元的損 失，約佔該國蜂蜜年產值的 1/5（Alippi, 1996）。
蜂群內，無論是蜂王、雄蜂和工蜂的幼蟲皆會受到 AFB 感染而出現病徵
（Rinderer and Rothenbuhler, 1969），發病過程為 0 - 2 日齡幼蟲食入孢子汙染的食 物，孢子在 24 hr 之內便會在中腸萌發，通常罹病的幼蟲不會立即死亡，仍可進入 封蓋期，一般會在完成排便、吐絲後才會發病死亡，此時屬於前蛹期（prepupal stages），但也有於蛹期才死亡者（Bailey, 1981）。通常病徵出現的蟲體呈腐爛狀，
體色會由乳白色逐漸轉變成棕黑色，如以小樹枝搓揉可拉出長 2.5 cm 以上的細
絲，而病徵出現的蟲體會產生一股特殊的魚臭味，是源自病原產孢時的副產物
（Gochnauer and Shearer, 1981）。蜂群於病徵出現初期仍能將蟲體移除，若病情持 續加劇，多量的蟲屍無法被清除，蟲屍約一個月後會變成乾癟鱗片狀（scale）。AFB 病原孢子具有高度的環境抗逆性，可抵禦外界不良的環境長達 35 年之久，因此常 潛伏於養蜂環境之中，待其環境適當即可發病（Baily and Ball, 1991; Shimanuki and David, 2000; 安等，2004; 陳，2004; Lindström, 2006; Ritter and Pongthep, 2006）。
典型的 AFB 病徵容易辨識，但病徵出現的初期徵狀則與歐洲幼蟲病（European foulbrood）十分類似，兩種病害影響幼蟲主要病徵特點列於附錄一。西洋蜂群並 無明顯的 AFB 發病季節，整年均可能出現病徵。此病害在自然的狀態下，成蜂扮 演主要的疾病散佈者。蜂群內，主要是將含有孢子的食物給予幼蟲，造成幼蟲感 染；當幼蟲發病時，每隻罹病體約可產生 2.5×106個細菌孢子，當成蜂在藉由清除 行為將蟲屍移出巢房時造成孢子傳佈（Bailey, 1981）。蜂群間的傳布途徑，主要是 迷巢蜂或盜蜂，會將其中大量的孢子攜帶至原本未感病的蜂群中，此時再經由成 蜂的相互接觸，則會使成蜂體表上的病原孢子傳佈於蜂群內；若是盜蜂將受污染 的蜂蜜帶回巢房內，護士蜂再將受污染之蜂蜜餵予幼蟲，便會使幼蟲病徵出現，
病徵出現的幼蟲在發病後未經由成蜂的清潔行為所排除，則孢子便會散佈於蜂箱 之中，進而造成大規模的傳染。一般而言，Goodwin et al.（1994）指出迷巢蜂傳 佈病害的情形並不嚴重，盜蜂則會造成 AFB 的迅速蔓延，因為罹病群通常是蜂勢 較弱，且儲蜜中含有大量病原孢子，若將來歷不明的蜂蜜餵飼蜂群十分冒險
（Ratnieks, 1992）。此外，在蜂場管理時，調換巢脾是快速增強蜂勢的方法之一，
但任意的置換巢脾，亦是 AFB 傳佈的主要途徑（Fries and Scott, 2001; 安等，2004;
陳等，2005），而野生的蜂群則會經由分蜂的方式減輕 AFB 的危害程度，降低因 水平傳染造成的散佈（Fries and Scott, 2001; Fries et al., 2006）。
二、 病原菌的特性
P. larvae 乃 革 蘭 氏 陽 性 的 微 需 氧 菌 （microaerophilic bacteria ）， 營 養 體
（vegetative cells）為其生長繁殖期，呈長桿狀細菌、末端略圓，會連接在一起形 成鏈狀，細菌的長度 2.5~5 µm，寬度 0.5 µm。當 P. larvae 開始形成孢子時，孢子 呈卵圓形，孢子的長度是寬度的一倍，分別為 1.3 µm 及 0.6 µm，且會堆疊成團簇 狀。每個受到感染的幼蟲約可產生 2.5×106個孢子（陳，1997; Shimanuki and David，
2000; 安等，2004; 陳，2004）。
P. larvae 具有極高的環境抗逆性（Alippi et al., 2005），對於不良環境及化學藥 劑具有很強的抵抗力。病原孢子在呈乾癟狀的 AFB 蟲屍裡保持活性達 35 年
（Haneman, 1961），而蜂蜜中的孢子則在陽光照射下可存活 4 ~ 6 週；如以 60℃殺 滅營養體需 15 min，而在煮沸的蜂蜜中則需經 40 min 以上才可殺死孢子；如孢子 於 0.5%硫酸中，則 37.5 hr 仍無法減低其活性，Burnside（1940）指出在沸水 7 hr，
稀釋蜂蜜中煮沸（106℃）5 hr，98℃乾熱加熱 2 天和 100℃蜂蠟 5 天，皆無法完全 殺滅；在室溫下，孢子能抵抗 5%石碳酸溶液數個月之久，在 1%汞溶液中，孢子 能存活 5 天，由此種種，足見其於環境中的抗逆性（馮，1995; 陳，1997）。
P. larvae 對於0 ~ 2 日齡幼蟲具有極高的致病力，但對 3 日齡以上幼蟲或成 蜂，甚至是受到成蜂接觸的幼齡蟲，皆不易感病（Brødsgaard et al., 1998; Crailsheum and Gallé, 2001），Bamrick（1967）發現 3 和 21 hr 幼蟲食入病原孢子有 75%會萌 發；但 45 hr 的幼蟲僅有 55%會有萌發的營養體，若蟲齡達 48 hr，大部分幼蟲對 感染已經產生抗性（Bamrick and Rothenbuhler, 1961; Hoage and Rothenbuhler, 1966;
Brødsgaard et al., 1998）。明顯的，3 日齡以上幼蟲的腸道環境已經不利於 P. larvae 生長；而 Rinderer and Rothenbuhler（1974）認為應該與開始接觸到花粉有關。若 成蜂食入孢子，則孢子無法萌發會隨糞便排出；此糞便內的孢子對幼蟲仍有致病 力（Wilson, 1971）。
三、 美洲幼蟲病的防治
AFB 傳染力極高，而且病原孢子又有極強的環境抗逆性，因此最有效的防治 策略是將病徵出現的蜂群連同巢脾及蜂箱全部燒燬（Ratnieks, 1992; Matheson and Reid, 1992），但這方法是要養蜂業者能於疾病初期即偵測發現 AFB 的前提下使 用，否則當 AFB 蔓延整個蜂場時，全蜂場都必須要燒燬，造成養蜂業者莫大的損 失。實際上，AFB 病徵出現初期不易察覺，一旦發現典型 AFB 病徵時，通常疾病 已經蔓延並危害整個蜂場。目前有許多研究者探討蜂群罹病程度與蜂群儲蜜孢子 數之間的關係（Shimanuki and Knox, 1988; Hornitzky and Clark, 1991; Steinkraus and Morse, 1992; Derakhshifar, 1994），希望能提早發現 AFB 的蜂群或建立預警制度。
然而，有些養蜂業者只燒燬或是殺滅成蜂與罹病的巢片，但其餘物品經過滅 菌後還繼續使用，例如蜂箱、蜂具和巢脾等；對於滅菌有很多方法被討論及應用，
例如早期的氧化乙烯（ethylene oxide）的燻蒸（Shimanuki and Lehnert, 1968; Knox et al., 1976; Gochnauer et al., 1979）以及高頻電子束（high velocity electron beams）
和目前技術最為成熟且已商業化的伽傌射線（gamma radiation）的應用，並且可利 用伽傌射線對蜂產品進行滅菌，未來進步空間很大（Hornitzky, 1994）。
除了滅菌的方式以外，許多抗生素具有抑制 AFB 蔓延的效果（Moffett et al., 1970），其中最廣泛且被深入研究探討的是羥四環素（oxytetracycline，以下簡稱 OTC）。在美國農業部，OTC 是唯一被許可用來防治 AFB 的藥劑。因此，OTC 的 使用方式及藥效成為探討的重點（Corner and Gochnauer, 1971; Wilson and Elliott, 1971; Wilson et al., 1973; Gochnauer and Bland, 1974; Gilliam, 1975; Gilliam and Taber,Ⅲ, 1978; Gilliam et al., 1979; Hoopingarner and Nelson, 1988; Hornitzky et al., 1988; Oldroyd et al., 1989）。然而，使用 OTC 會造成病原逐漸產生抗藥性（Shimanuki and Knox, 1994; Peng et al., 1996; Miyagi et al., 2000; Alippi, 2000; Piccini and Zunino, 2001; Antúnez et al., 2004; Alippi et al., 2005; Cox et al., 2005），也會殘留於
蜂產品中（黃， 1989; Wilson, 1974; Lehnert and Shimanuki, 1981; Chiu and Chu, 1990;
Matsuka and Nakamura, 1990; Thompson et al., 2005; Martel et al., 2006）。因此，OTC 藥劑的使用量、藥效持續性及蜂產品中藥劑殘留量，都成為防治 AFB 的參考指標 之一。
四、蜂產品中羥四環素殘留量與檢測法
在許多養蜂地區，主要藉由抗生素的施用來治療蜜蜂細菌性的幼蟲疾病，然 而，在 1950 年，美國早已使用羥四環素來預防及控制美洲幼蟲病，因為效果不錯 且價格低廉，所以此方法廣泛的被養蜂業者採用（Sporns et al., 1986）。除了長期 使用可能造成 OTC 殘留，如於果樹開花期間，將四環素類抗生素直接噴灑於作物，
可能導致開花的花蕊含有高濃度抗生素污染，造成蜂蜜裡會有殘留存在的風險。
相對地，在蜂產品中有抗生素的殘留，可能危害消費者健康並增加細菌產生抗性 的風險。
近年來，歐盟及世界各國建立許多初步的檢測系統，主要是控制蜂蜜裡抗生 素的殘留量並檢驗出殘留量多寡。目前，世界各國對於抗生素的管制日趨嚴格，
就蜂產品而言，日本規定的殘留標準為：四環素類總量 0.3 ppm 以下，氯黴素不得 檢出；歐盟則規定四環素殘留量在 25 ppb 以下，氯黴素不得檢出。在如此嚴格的 條件下，蜂農只得避免用藥，以避免殘留的發生。
然而，由於蜂蜜成分複雜，所以樣品淨化不易而難以建立高靈敏性的四環素 類檢測方法。許多用於檢測蜂蜜中 OTC 殘留的方法包括微生物分析法（Kurittu et al., 2000）、酵素免疫分析法（Heering et al., 1998; Sczesny et al., 2003）、分光光度計、
螢光測定法（Chang et al., 1992）、電化學偵測儀、毛細管電泳（Hsiao et al., 2001）
和高效能液相層析儀搭配紫外光（Vinas et al., 2004）、螢光（Pena et al., 2005）及 化學發光偵測方式（Wan et al., 2005）等都能測定蜂蜜裡的殘留量，然而主要是由 於實際運用上缺乏良好的敏感性以及受到蜂蜜裡物質的干擾，導致只有少數幾個
方法能應用於田間樣品的檢測。目前，有報告指出，在測定蜂蜜中 OTC 及四環素 類具有特殊及敏感的分析方法為高效能液相層析儀並搭配螢光偵測儀（Pena et al., 2005）。
許多檢測技術多以檢測蜂蜜中 OTC 殘留量，鮮少提到蜂蜜之外的蜂產品檢測 方法，雖然有部分報告是從蜂花粉或是蜂王乳中檢驗其他成分殘留（Jimenez et al., 2007; Antinelli et al., 2002），但鮮少提到蜂王乳或是蜂花粉中 OTC 的殘留檢測分 析。因此本研究另嘗試建立蜂花粉，以及台灣重要的出口蜂產品－蜂王乳，進行 OTC 殘留檢測的相關研究，此外藉由人工接種孢子來進行田間試驗，以探討 OTC 的防治效果及藥效持續性與蜂蜜中 OTC 殘留量的關係。
參、材料與方法
一、蜂蜜中美洲幼蟲病原孢子的檢測
(一) 蜂蜜樣品的來源
本研究檢測 2006 與 2008 年台灣各地（599 件）及泰國進口（30 件）蜂蜜樣 品，共 629 件樣本，每件樣品約 50 ~ 100 g。台灣本土蜂蜜樣品又分為養蜂場採收 蜜與單群蜜蜂儲蜜等 2 類，而前者是台灣蜂農於 2006 與 2008 年流蜜期採收的蜂 蜜，每處蜂場抽樣約 50 mL 為 1 檢測樣品；單群蜜蜂儲蜜樣品則委請全國各地蜂 農抽樣其飼養蜂群的儲蜜，每處蜂場約抽樣 3 ~ 5 群蜜蜂，以單一蜂群的儲蜜為一 樣品，採樣時以鐵製湯匙擠壓巢片上方的儲蜜區，將流出的蜂蜜收集於 50 mL 塑 膠離心管，每群蜜蜂約取 40 ~ 50 mL 的儲蜜。若依蜂蜜來源的產地區分則包含台 灣與泰國進口，台灣的蜂場採收蜜又可分為委請台灣各地養蜂產銷班採收的蜂蜜 與該年參加苗栗區農改場舉辦全國蜂蜜評鑑比賽通過複賽之評鑑蜂蜜，而單箱儲 蜜的產地則與蜂場採收蜜同為台灣各地；泰國進口的蜂蜜樣本是來自兩家本國進 口商於 2006 年從泰國進口的龍眼蜂蜜，以之與台灣蜂蜜的檢測作為比較。
(二) 檢測病原孢子數與建立分離株
每一蜂蜜樣品秤量 20 g 於 50 mL 塑膠離心管中，加入 20 mL 無菌水並充分震 盪混合，將此均質液於 4℃，6000 xg 離心 40 min，去除上清液，再以無菌水定量 至 1 mL，最後以水浴加熱（80℃，20 min）殺除雜菌。之後取 0.2 mL 分離液，塗 抹於 BHITN（DIFCO，brain-heart infusion supplemented with 0.1 µg/mL thiamine and 9 µg/mL nalidixic acid）平板上，以 1 mm 玻璃珠均勻塗佈。之後培養於 37℃, 5% CO2
恆溫培養箱 72 hr，每一樣品至少塗抹 2 平板。72 hr 後取出，根據菌落形成的時間
（3 日）與形態（圓形，直徑 1 ~ 3 mm，灰白色，扁平狀，菌落周緣不規則）初 步判定為幼蟲芽孢桿菌（Paeniacillus larvae），並計算每克樣品的菌落形成單位
（colony-forming unit, CFU/g）。
每一平板至少挑選疑似菌落進行增殖，增殖後的分離株先以 catalase test 測試 為陰性，再根據 Bakonyi et al. (2003) 的 PCR 檢測法偵測特定 DNA 片段（472 bp）， 以確認分離株是否為 P. larvae，如是則再予以增殖並冷凍保存於 25% glycerol 中。
(三) 幼蟲芽孢桿菌分離株對羥四環素的敏感性測試
1. 標準菌的試驗
將標準菌 ATCC 9545 菌株繼代培養 2 次後，利用無菌棉棒挑取菌體均勻塗佈 於 BHIT（DIFCO，brain-heart infusion supplemented with 0.1 µg/mL thiamine）平板 上，於平板中央放置 1 片含 5 µg 羥四環素的紙盤（DIFO，直徑 6 mm），培養於 37℃, 5% CO2恆溫培養箱 72 hr。3 日後取出，測量 5 µg 羥四環素紙盤所導致的抑 菌圈直徑，並整理出標準菌 ATCC 9545 對羥四環素的敏感性。
2. 本土與進口分離株的試驗
從台灣與泰國進口蜂蜜分離培養的菌落中，每一平板至少挑取單一 P. larva 菌落進行繼代培養 2 次後，利用無菌棉棒挑取菌體均勻塗佈於 BHIT 平板上，於 平板中央放置 1 片含 5 µg 羥四環素的紙盤（DIFO，直徑 6 mm），培養於 37 , 5% ℃ CO2恆溫培養箱 72 hr，每分離株至少進行二重複。3 日後取出，測量 5 µg 羥四環 素紙盤所導致的抑菌圈直徑，以探討分離株對羥四環素的感受性。
二、羥四環素防治 AFB 的效果
(一) 孢子接種源的製備
由上述感受性測試中，選取對羥四環素具有低敏感性本國分離株（抑菌圈直 徑為 21 mm），利用移菌環選取 P. larva 菌落培養於 BHIB（Brain heart infusion
broth），37℃，200 rpm 震盪式恆溫培養箱 48 ~ 72 hr。之後，將此培養液於 25℃，
6000 xg 離心 5 min，去除上清液，再以無菌水定量至 1 mL，利用微量注射器注射 進入 1 日齡工蜂蛹體的第一與二體節之間，注射量約 3 µL，共 100 隻，注射後的 蛹置於恆溫培養箱（34℃）中，約一個月可出現典型 AFB 病徵，收集其中 12 隻 感病蟲體先加入 1 mL D.D.W 磨碎後，再加入 2 mL D.D.W 沖洗 Pellet，將上述液 體注入 50 mL 離心管並震盪混勻，將此均質液低速離心（500 xg, 5 min），取上清 液，再以 6000 xg 離心 40 min，去上清液，以 PBS 定量至 12 mL，最後以水浴加 熱（80 , 20 min℃ ）殺除雜菌，以 PBS 做 10 倍量序列稀釋，之後取 100 µL 稀釋菌 液均勻塗於 BHITN 培養基上，各進行二重覆，培養於 37 , 5% CO℃ 2恆溫培養箱 72 hr，用以估算接種孢子源的濃度。
(二) 田間蜂群的防治試驗
於 2007 年 10 月選取宜蘭大學試驗蜂場內 8 群健壯的西洋蜂，每群蜜蜂其工 蜂族群均滿 9 片且有 1 隻產卵正常的后蜂。試驗蜂群各餵飼 800 mL 含 OTC 的糖 漿（蔗糖：水＝1：1，W/W）1 次，糖漿中分別含有 OTC 50 mg 與 125 mg 二種 劑量，換算 OTC 濃度分別 63 µg/mL 與 156 µg/mL，各劑量均餵飼四群（四重複）； 另為減低藥劑殘留期，所有蜂群均於施藥 10、20、30 日後搖去儲蜜，並檢測蜂蜜 中羥四環素殘留量。為探討 OTC 的防治效果，選取 1 日齡幼蟲接種前述備製之本 土分離具耐藥性的 P. larvae 孢子，分別於餵食 OTC 前 9、6、3 日，餵飼後 0 日、
3 日、6 日、10 日，選取 1 日齡工蜂幼蟲接種 0.01 CFU、 0.1 CFU、10 CFU 和 100 CFU 劑量孢子，每劑量於試驗蜂群各接種 50 隻，對照組則接種無菌水，以探討 OTC 對 AFB 的防治效果及藥效的持續性。
三、蜂產品中羥四環素的檢測法
1.試藥與器材
羥四環素標準品（純度 90%, Sigma, USA），氰甲烷（皓峰，台灣）、甲醇
（Mallinckrodt, USA）均為 LC 級，正己烷（95%, J. T. Baker, USA）、醋酸乙酯
（Mallinckrodt, USA）、檸檬酸（石津製藥，日本）、磷酸氫二鈉（石津製藥，日 本）、鹽酸（FERAK, Germany）、咪唑（Fluka, Germany）、醋酸鎂（J. T. Baker, USA）
為試藥級，真空固相萃取裝置包括矽膠過濾層析管柱（DSC-PH 和 DSC-18LT cartridge, SUPELCO），真空減壓濃縮裝置包括冷凝機（Water bath D-606）、抽氣 幫浦（BUCHI Vac® V-500）、控制器（BUCHI Vacuum Controller V-800）、旋轉濃 縮器（BUCHI Rotavapor R-215）、加熱器（BUCHI Heating Bath B-491）。
2.分析方法：
(1) HPLC 操作條件
高效能液相色層分析儀（HPLC, Agilent 1200）包括多溶液輸送系統
（Multisolvent delivery system）、螢光檢測器（fluorescence detector）
與紫外光檢測器（UV detector）。
層析管：ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm, 5µm, Agilent）。前置 Frit Filter 的 Guard-Pak holder，以延長層析管之使用壽命。
移動相：咪唑（imidazole）緩衝溶液 / 甲醇（77：23, v/v），流速 1.0 ml/min，進樣量 100 µL，螢光檢測器的激發波長 380 nm，發散波長 520 nm。
(2) 檢量線
精秤 10 mg 羥四環素標準品，置於 100 mL 定量瓶中，加甲醇至刻度，
均勻混合，即為 100 ppm 原液。取適量原液以 0.5 N 鹽酸稀釋成 5、1、0.5、
0.1、0.05、0.01 ppm，注入高效能液相色層分析儀，分別測定各濃度波峰 面積，以製作檢量線。
(一) 蜂蜜樣品的分離與淨化
取 2.9 g 蜂蜜並人為添加濃度 50 µg/mL 羥四環素，添加量為 100 µL，之後加 入 6 mL 0.01M Na2-EDTA pH 4.0 MacIlvaine 緩衝溶液並震盪混勻。再以 3000 rpm 轉速下離心 15 min，取上清液，分別使用 DSC-PH（phenyl, 7% C）及 DSC-18LT
（octadecyl, 11% C）兩種固相萃取管柱進行淨化，先分別用 5 mL 乙晴、10 mM 草 酸、飽和 Na2-EDTA 進行活化管柱，接著注入蜂蜜樣品，再用 5 mL 之 10 mM 草 酸進行清洗的步驟，最後用 5 mL 乙酸乙酯與甲醇的混合比例（90：10）進行沖提，
將沖提液利用真空減壓濃縮機進行濃縮的步驟至沖提液完全乾為止，再用 10mM 草酸定量至 1 mL，最後用 0.22 µm 濾膜來過濾，之後取 100 µL 的樣品過濾液注入 HPLC 並測定波峰面積進行羥四環素殘留分析。
(二) 蜂王乳樣品的分離與淨化
取 0.9 g 蜂王乳並人為添加濃度 50 µg/mL 羥四環素，添加量為 100 µL，之後 加入 6 mL 0.01M Na2-EDTA pH 4.0 MacIlvaine 緩衝溶液並震盪混勻。再以 12,000 xg 轉速下離心 15 min，取上清液，分別使用 DSC-PH（phenyl, 7% C）及 DSC-18LT
（octadecyl, 11% C）兩種固相萃取管柱進行淨化，先分別用 5 mL 乙晴、10 mM 草 酸、飽和 Na2-EDTA 進行活化管柱，再用 5 mL 之草酸（10 mM）進行清洗的步驟，
最後用 5 mL 乙酸乙酯與甲醇的混合比例（90：10）進行沖提，將沖提液利用真空 減壓濃縮機進行濃縮的步驟至沖提液完全乾為止，再用 10mM 草酸定量至 1 mL，
最後用 0.22 µm 濾膜來過濾，之後取 100 µL 的樣品過濾液注入 HPLC 並測定波峰 面積以探討羥四環素的回收率。
(三) 蜂花粉樣品的分離與淨化
取 0.9 g 蜂花粉並人為添加濃度 50 µg/mL 羥四環素，添加量為 100 µL，之後 加入 6 mL 0.01M Na2-EDTA pH 4.0 MacIlvaine 緩衝溶液並震盪混勻。再以 3000 rpm 轉速下離心 15 min，取上清液，添加正己烷，混勻後以 3000 rpm 轉速下離心 15 min，取下層液，重複此步驟兩次。分別使用 DSC-PH（phenyl, 7% C）及 DSC-18LT
（octadecyl, 11% C）兩種固相萃取管柱進行淨化，先分別用 5 mL 乙晴、10 mM 草 酸、飽和 Na2-EDTA 進行活化管柱，再用 5 mL 之草酸（10 mM）進行清洗的步驟，
最後用 5 mL 乙酸乙酯與甲醇的混合比例（90：10）進行沖提，將沖提液利用真空 減壓濃縮機進行濃縮的步驟至沖提液完全乾為止，再用 10mM 草酸定量至 1 mL，
最後用 0.22 µm 濾膜來過濾，之後取 100 µL 的樣品過濾液注入 HPLC 並測定波峰 面積以探討羥四環素的回收率。
四、田間蜂蜜樣品的檢測
取田間試驗蜂群所搖取下來的蜂蜜樣本，利用蜂蜜樣品的分離與淨化方法來 進行檢測。取 3.0 g 蜂蜜樣本再加入 6 mL 0.01M Na2-EDTA pH 4.0 MacIlvaine 緩衝 溶液並震盪混勻。以 3000 rpm 轉速下離心 15 min，取上清液，以 DSC-PH（phenyl, 7% C）固相萃取管柱進行淨化，先分別用 5 mL 乙晴、10 mM 草酸、飽和 Na2-EDTA 進行活化管柱，之後注入上清液，再用 5 mL 乙酸乙酯與甲醇的混合比例（90：10）
進行沖提，將沖提液利用真空減壓濃縮機進行濃縮的步驟，再用 10mM 草酸回溶 定量至 1 mL，最後用 0.22 µm 濾膜來過濾，之後取 100 µL 的樣品過濾液注入 HPLC 進行羥四環素殘留分析。
肆、結果
一、蜂蜜中美洲幼蟲病原孢子的檢測
本研究共收集 2006 與 2008 年台灣地區的蜂蜜樣本共 629 件，其中 2006 年樣 本有 407 件，2008 年樣本則有 222 件。在 2006 年蜂蜜樣本部分，共收集台灣地區 23 處養蜂場的單群蜜蜂儲蜜樣品 103 件；台灣養蜂場採收蜜樣品則有養蜂產銷班 提供 175 件樣品，參加 2006 年全國龍眼蜂蜜評鑑比賽樣品 59 件，參加 2006 年新 竹縣蜂蜜評鑑樣品 10 件，蜂蜜濃縮代工廠提供 30 件，合計 274 件；泰國進口蜂 蜜則有 30 件樣品。2008 年部分，台灣養蜂場採收蜜樣品則有養蜂產銷班提供 128 件樣品，參加 2008 年全國龍眼蜂蜜評鑑樣本共 94 件，合計 222 件。
上述 629 件蜂蜜樣品經分離與平盤培養後，共有 195 件檢驗出含美洲幼蟲病 孢子，檢出率為 31.0%。依照樣品採收年度區分，2006 年共檢測 407 件蜂蜜樣品，
其中有 140 件檢驗出含美洲幼蟲病孢子，檢出率為 34.4%；2008 年共檢測 222 件 蜂蜜樣品，其中有 55 件檢驗出含美洲幼蟲病孢子，檢出率為 24.77%，檢出率顯著 低於 2006 年（P<0.05, Z-test）。再依蜂蜜樣品的來源區分，台灣養蜂場的單群蜜蜂 儲蜜樣品共 103 件，其中 13 件檢驗出病原孢子，檢出率為 12.6%；台灣養蜂場採 收蜜樣品共 496 件，176 件檢驗出病原孢子，檢出率為 35.5%，高於其他來源樣品，
其中 2006 年蜂場採收蜜的檢出率高達 44.2%是主要的因素；泰國進口蜂蜜樣品共 檢測 30 件樣品，其中 6 件檢驗出病原孢子，檢出率為 20.0%（表一）。
就蜂蜜樣品中檢測出的美洲幼蟲病原孢子數而言，可發現台灣單群蜜蜂儲蜜 樣品與泰國進口蜜樣品的孢子數含量很少，多數樣品孢子數小於 1 CFU/g (圖一)，
其中 2006 年台灣單群蜜蜂儲蜜樣品則只有 4 件（3.9%）的孢子數高於 1 CFU/g，
而且均介於 1 ~ 50 CFU/g。2006 年泰國進口蜜樣品只有 2 件（6.7%）的孢子數高 於 1 CFU/g，而且均介於 1 ~ 50 CFU/g。台灣養蜂場採收蜜樣品的病原孢子數量則
較多，以 2006 年採收樣品的孢子含量最多，該年共有 88 件（32.1％）樣品的孢子 數高於 1 CFU/g，其中有 23 件（8.4％）的孢子數達 50 ~ 500 CFU/g，更有 7 件（2.6%）
的孢子數高於 500 CFU/g，其中最高量的樣品來自南投縣，其孢子數達 4,063 CFU/g。在 2008 年台灣養蜂場採收蜜樣品則只有 28 件（12.6％）樣品的孢子數高 於 1 CFU/g，而且只有 3 件（1.4％）的孢子數達 50 ~ 500 CFU/g。
二、 幼蟲芽孢桿菌分離株對羥四環素的感受性
本研究共計從 2006 與 2008 年蜜蜂樣品中分別分離取得 219 及 55 株幼蟲芽孢 桿菌分離株，其中從 2006 年台灣本土蜂蜜分離得 208 株，泰國進口蜂蜜分離得 11 株，從 2008 年台灣本土蜂蜜分離得 55 株。以含 5 µg 羥四環素的紙盤測試這些分 離株的感受性，2006 年台灣本土分離株的抑菌圈直徑為 43.0 ± 6.2 mm（mean ± s.d.），數值範圍介於 21 ~ 60 mm；2008 年台灣本土分離株的抑菌圈直徑為 40.2 ± 8.4 mm（mean ± s.d.），數值範圍介於 20 ~ 59 mm；2006 年泰國進口蜂蜜分離株的抑 菌圈則為 43.3 ± 5.2 mm（mean ± s.d.），數值範圍介於 31 ~ 49 mm；幼蟲芽孢桿菌 的模式品系（ATCC 9545）的抑菌圈則為 58.2 ± 1.7 mm，顯著大於台灣與泰國分離 株的抑菌圈（P < 0.05）（表二）。
將 2006 與 2008 年的蜜蜂樣品中所有幼蟲芽孢桿菌分離株對羥四環素感受性 的檢測結果區分為高感受性（抑菌圈直徑大於 50 mm）、中感受性（抑菌圈直徑 40
~ 50 mm）與低感受性（抑菌圈直徑小於 40 mm），可發現模式品系皆為高感受性；
2006 與 2008 年台灣本土分離株分別有 34 株（16.4%）及 12 株（20.3%）被歸類為 高感受性，124 株（59.6％）及 18 株（30.5％）為中感受性，另有 50 株（24.0％）
及 29 株（49.2％）呈現低感受性；泰國進口蜂蜜分離株則多數為中感受性（9 株，
81.8％），少數為低感受性（2 株，18.2％），並未發現高感受性菌株（表三）。
三、羥四環素防治 AFB 的效果
(一) 孢子接種源取得的結果
將自台灣本土蜂蜜樣品中分離出來對羥四環素具有低敏感性（抑菌圈直徑 21 mm）的幼蟲芽孢桿菌營養體懸浮液注射於一日齡蛹後，並置於恆溫培養箱（34℃）
中約一個月，即可在蛹體上明顯觀察到 AFB 的典型病徵，初期可見蛹體由白色逐 漸變成深褐色，此外體軀亦逐漸變為乾癟狀，最終則黏附於組織培養盤底部（圖 二）。
P. larvae 營養體經懸浮培養後，注射於蛹體中，分離蛹體孢子，再經過平板培
養孢子菌落，可自平板上計算其 CFU（colony forming units），以 10-4稀釋倍率（約 52.4 CFU/mL）推算，可得知種孢子液中孢子濃度為 5.24 × 106 CFU/mL（52.4 × 10
× 104＝5.24 × 106 CFU/mL）。
(二) 田間蜂群防治試驗的結果
本研究評估以羥四環素防治本土蜂群 AFB 的適用性，分別以含 125 mg OTC 和 50 mg OTC 糖漿餵飼蜂群 1 次，換算 OTC 濃度分別 63 µg/mL 與 156 µg/mL，
再於施藥前後接種 0.01 CFU、 0.1 CFU、10 CFU 和 100 CFU 劑量孢子於 1 日齡幼 蟲，探討 OTC 防治的效果與藥效持續性。蜂群餵飼 125 mg OTC 的結果顯示（圖 三），施藥前 9 日接種孢子的幼蟲，因其幼蟲取食期未接觸藥劑，因此接種後的幼 蟲於封蓋期時皆出現典型 AFB 病徵。施藥前 3 日接種者，於中、末齡幼蟲期能有 機會接觸到 OTC，可發現接種 4 種劑量孢子的幼蟲，蛹存活率大幅提高，並未出 現典型 AFB 病徵，而且蛹存活率已和陰性對照組無明顯的差別（P > 0.05），顯示 此 OTC 劑量可以完全防治已經感染孢子的幼蟲。而施藥當日、施藥後 3 日、6 日 經接種孢子處理的幼蟲，此 OTC 劑量亦皆能有效的防治 AFB 的發生，施藥後 10 日接種孢子的幼蟲（因需檢測蜂蜜中 OTC 殘留量，所以搖去儲蜜），結果仍顯示
所有接種孢子的處理組皆無 AFB 的發生，顯示 125 mg OTC 可以完全防治高劑量 孢子感染至少達 13 日（施藥前 3 日+施藥後 10 日）。
蜂群餵飼 50 mg OTC 的結果顯示（圖四），施藥前 9 日接種孢子的幼蟲，因其 幼蟲取食期未接觸藥劑，因此接種後的幼蟲出現典型 AFB 病徵。但施藥前 3 日接 種、施藥當日、施藥後 3 日、6 日所感染孢子的幼蟲，皆未出現 AFB 病徵者，顯 示 50 mg OTC 可以完全防治施藥前 3 日和施藥後 3 日及 6 日感染孢子的幼蟲；但 施藥後 10 日接種者，則於 0.1 CFU、10 CFU 和 100 CFU 劑量接種幼蟲分別出現 5.88、15.8 及 38.4% AFB 發生率，此結果說明在試驗蜂群搖去儲蜜後，50 mg OTC 的防治效果才比 125 mg OTC 低，前者藥效的持續性與藥效下降的速度比後者來的 明顯，已無法完全防治遭受感染的幼蟲（圖五）。
四、蜂產品中羥四環素的檢測法
本研究首先測定羥四環素標準品的滯留時間，將 OTC 以甲醇溶解後用 0.5 N 鹽酸稀釋後注入 HPLC 分析，結果顯示，羥四環素標準品可在 5 min 左右偵測到明 顯的波峰（圖六），偵測極限為 1 ng/100 µL。在樣品檢測方面，當蜂蜜、蜂王乳及 蜂花粉萃取樣本先加入 Na2-EDTA pH 4.0 MacIlvaine 緩衝溶液混合離心後（蜂花粉
樣本需再添加正己烷並離心，此步驟重複兩次），進行固相萃取匣淨化分離時，發
現蜂蜜樣本利用 DSC-Ph（phenyl, 7% C）固相萃取管柱的效果最佳，在濃度 5 µg/mL 回收率約為 89.8 ± 1.1%，偵測極限為 5 ng /g；而蜂王乳及蜂花粉萃取樣本各別用 DSC-18Lt （octadecyl, 11% C）及 DSC-Ph（phenyl, 7% C）這兩種管柱，可以得到 較好的回收效果，在濃度 5 µg/mL 回收率分別為 51 ± 0.17 及 53.7 ± 2.8%（圖 七）。
五、田間蜂蜜樣品中羥四環素殘留測定
利用前述已建立的蜂蜜中羥四環素殘留檢測法，蜂蜜樣品先由 DSC-Ph 固相
萃取管柱淨化，再用 HPLC 進行分析，檢測其蜂蜜樣本的殘留量。試驗蜂群在餵 飼 50 mg OTC 劑量的結果顯示，施藥前各試驗蜂群的蜂蜜樣本皆無抗生素殘留，
之後檢測施藥後 10 及 20 日所搖除的蜂蜜樣本，其平均羥四環素殘留量為 2625 ± 695 及 40 ± 38 ppb。在施藥後 30 日所搖除的蜂蜜樣本中，餵飼 50 mg OTC 的試 驗蜂群皆未檢測出羥四環素殘留。另外在試驗蜂群餵飼 125 mg OTC 劑量的結果顯 示，施藥前各試驗蜂群的蜂蜜樣本皆無抗生素殘留，施藥後 10 及 20 日所搖除的 蜂蜜樣本，其平均羥四環素殘留量分別為 6983 ± 4069 及 99 ± 71 ppb，施藥後 30 日所搖除的蜂蜜樣本則有 2 群蜜蜂檢測出羥四環素殘留，其殘留量分別為 8 ppb 與 25 ppb。此結果說明餵食 50 mg 與 125 mg OTC 的試驗蜂群，皆必須經過 2 次以上 搖除儲蜜，才能有效將其羥四環素殘留量降低至 25 ppb 以下（表四）。
伍、討 論
一、蜂蜜樣品中美洲幼蟲病原孢子的探討
蜜蜂美洲幼蟲病一直是全球養蜂業防治的重點項目之一，而於抗生素廣泛使 用的年代，羥四環素也成為 AFB 主要的防治藥劑，然而，羥四環素只能抑制幼蟲 芽孢桿菌營養體（vegetative cells）的增殖，無法殺滅病原孢子，使得 AFB 在許多 養蜂場仍不斷爆發疫情。Otten and Otto（2005）報導德國在 1950 ~ 2003 年間每年 約有 100 ~ 400 個養蜂場爆發 AFB 疫情，而且大約 8 ~ 12 年就會出現疫情的高峰。
在台灣，由於缺乏常態性蜜蜂傳染病疫情的監測單位，因此並無完整的 AFB 疫情 資料，但根據本研究室近年來與台灣蜂農接觸的經驗，專業養蜂場近年來很少發 生 AFB 疫情，但業餘養蜂者近年來在台灣日漸增多，而他們對 AFB 的認識程度較 低，也造成這些業餘養蜂場容易出現 AFB 疫情。
目前，限制抗生素的使用已成為世界各國的趨勢，對於發生 AFB 疫情的蜂 群，多數國家的防治方法為燒毀罹病蜂群，台灣也不例外，而監測蜂蜜中的病原 孢子則可以早期偵測 AFB 疫情（Ritter, 2003），再配合適當的蜂群管理措施，便可 以有效防治 AFB 而避免燒毀蜂群。De Graaf et al.（2001）證實於發生 AFB 疫情養 蜂場半徑 5 公里內之鄰近養蜂場所採集的蜂蜜樣品，其被檢出病原孢子的風險高 於非鄰近地區的 3 倍，而且也證實蜂蜜中病原孢子的檢出率與 AFB 的典型病徵具 有顯著的相關性。Ritter（2003）則發現每克蜂群儲蜜的病原孢子數高於 5,000 者，
該群蜜蜂出現典型 AFB 病徵的比例高達 88%，相對的狀況，如果孢子數低於 5,000，則只有 2%蜂群出現 AFB 病徵，如此顯示檢測蜂蜜中的病原孢子數的確可 以在蜂群尚未出現典型 AFB 病徵前，早期偵測 AFB 的疫情。
事實上，近年來已有許多檢測各國蜂蜜 AFB 病原孢子數的研究報告，但檢測 結果卻有很大的變異，例如 De Graaf et al.（2001）廣泛收集了 1,328 件於 1999 年
夏季在比利時採收的蜂蜜樣品，其中 146 件（11.0％）被檢出含 AFB 病原孢子。
Antúnez et al.（2004）於 2001 ~ 2002 年收集 101 件烏拉圭養蜂場採收的蜂蜜樣品，
這些養蜂場均尚未發現典型 AFB 病徵，但卻有 52 件（51.5%）被檢出病原孢子。
在台灣，Chen et al.（2002）也於 1998 年收集 124 件台灣本土蜂蜜樣品，這些樣品 來源蜂場也均未發現 AFB 病徵，但有 31 件（25.0%）被檢出病原孢子。各國 AFB 疫情與防治策略不同，造成檢測結果互異，但 Ritter（2003）直言有些國家使用抗 生素防治 AFB 而造成病原孢子檢出率偏高，Ritter 檢測了 1,520 件德國市售的蜂蜜 樣品，其中 700 件來自非歐盟（EU）地區的進口蜂蜜，AFB 病原孢子檢出率高達 98%；另 200 件來自其他歐盟地區的蜂蜜樣品，檢出率也達 62%，但德國當地的樣 品則僅有 2%檢出病原孢子。
本研究廣泛收集了 2006 與 2008 年台灣地區的蜂蜜樣本共 629 件，其中台灣 本土的樣品達 599 件，採樣的養蜂場以涵蓋台灣本島的養蜂地區，調查的規模與 範圍均明顯大於 Chen et al.（2002）調查者，而且本研究也檢測 2006 年泰國進口 蜜樣品 30 件，檢測結果發現孢子檢出率為 20.0%（表一），而所含有的孢子數多偏 低（圖一），因此泰國進口蜜對台灣蜂群的 AFB 疫情影響有限。在台灣單群蜜蜂 儲蜜部份，本研究檢測結果發現於 103 件樣品中，有 13 件（12.6%）被檢出病原 孢子，檢出率小於 1998 年台灣單群蜜蜂儲蜜 (Chen et al., 2002) 的 24%檢出率（71 件樣品）；在台灣養蜂場採收蜜部分，本研究共檢測 496 件樣品，孢子檢出率達 35.5%，明顯高於 1998 年的 26.4%檢出率（53 件樣品），其中 2006 年的檢出率達 44.2%是造成檢出率偏高的主因，而 2008 年的檢出率（24.77%）明顯低於 2006 年，
可能是蜂農養蜂環境及管理模式的改變而降低蜂群中孢子的散佈。由此結果顯示 AFB 仍亦普遍存在於各蜂群內，值得養蜂業者及政府防疫單位的重視。
二、OTC 對幼蟲芽孢桿菌分離株的探討
由於長期使用抗生素防治 AFB 的結果，Miyagi et al.（2000）首先報導 P. larvae
對羥四環素出現抗性，她們在 1998 年從美國明尼蘇達州養蜂場分離 UCD P-MN-98 的 P. larvae 分離株，在與本研究相近的藥量下（5.0 vs. 5.12 µg /disc），卻未出現 明顯的抑菌圈；隨後 Piccini and Zunino（2001）也針對烏拉圭的 17 個分離株進行 抑菌圈測試，發現在與本研究相同的劑量下（5 µg /disc），抑菌圈直徑範圍為 45 ~ 55 mm；事實上，在烏拉圭也使用羥四環素防治 AFB，但可能使用的時間仍不長，
因此尚未出現明顯的抗藥性。Alippi et al.（2007）則廣泛收集世界各地的 75 個分 離株，同樣測試在 5 µg /disc 劑量下的抑菌圈，他們發現有 4 個分離株（1 個來自 義大利，3 個來自美國）對羥四環素具有明顯的抗性，其抑菌圈直徑為 7.13 ~ 13.25 mm，而且這 4 個分離株都具有 Tet (K)基因，而其餘 71 個分離株都沒有 Tet (K)基 因，抑菌圈直徑則為 19.75 ~ 70.05 mm；很顯然，Tet(K)就是抗性基因，而且位於 細菌的質體（plasmid）上，因此轉形至非抗藥性品系的機率極高。
本研究從 2006 與 2008 年台灣本土蜂蜜樣品中分別取得的本土分離株達 208 及 55 株，對調查本土病原是否對羥四環素出現抗藥性極具參考價值。表二可發現 2006 與 2008 年本土分離株的抑菌圈直徑分別為 43.0 ± 6.2 mm 與 40.2 ± 8.4 mm，
泰國分離株則為 43.3 ± 5.2 mm，兩者顯著小於 P. larvae 模式品系（ATCC 9545）
的 58.2 ± 1.7 mm，顯示台灣本地分離的 P. larvae 尚未出現對羥四環素具抗性的品 系，但值得注意者，其中 2006 與 2008 共有 79 個台灣本土分離株（30％）的抑菌 圈直徑小於 40 mm，其中最小者僅 20 mm，已接近具抗性的臨界值（表三），宜進 一步分析是否具 Tet(K) 抗性基因；泰國進口蜜也有 2 株（18.4%）歸類為低感受性，
值得重視。
綜合而言，本研究廣泛收集並檢測 2006 與 2008 年台灣本土蜂蜜與泰國進口 蜂蜜共 629 件樣品，檢測結果顯示其中約有 1/3 樣品可檢出美洲幼蟲病原孢子，但 大多數樣品的孢子含量不高，推測應處於潛伏感染狀態，如此說明病原孢子仍普 遍存在台灣各地養蜂場，尤其 2006 年台灣養蜂場採收蜜樣品的孢子檢出率與孢子 數含量均大幅增加，建議台灣防疫單位應將本項檢測列為常態性蜜蜂疫情監測項
目，以適時提供蜜蜂美洲幼蟲病疫情資料供台灣養蜂業參考。
三、OTC 的防治效果
本研究將 OTC 糖漿餵飼正常蜂群，再以 OTC 處理前、後直接接種低和高劑 量孢子於標的幼蟲，因此只要觀察標的幼蟲的存活情形，即可評估羥四環素來防 治本土蜂群 AFB 的適用性與藥效持續的時間。結果可發現蜂群餵飼 1 次 800 mL 含 125 mg OTC 的糖漿後（圖三），立即出現防治藥效，而且可以完全抑制 AFB 的 發生至少達 13 日（施藥前 3 日＋施藥後 10 日），這段期間所有接種孢子的幼蟲皆 未出現 AFB。然而，餵飼 1 次 800 mL 含 50 mg OTC 的糖漿後（圖四），皆與餵飼 125 mg OTC 一樣立即具有防治藥效，但防治效果稍低，提前於施藥後 10 日接種 低和高劑量孢子者分別出現 5.88%和 38.4%的 AFB 罹病體（圖四）。本試驗與陳
（1997）的結果雷同，再次證實無論餵飼 50 mg 或 125 mg OTC 皆能有效的抑制 AFB 的發生，只要給予低濃度羥四環素就能有效防治 AFB 的發生至少達 9 日（施 藥前 3 日＋施藥後 6 日），如果要延長防治天數就須經常給予藥劑，但這可能存在 著會使本土病原產生抗藥性的風險。
四、OTC 殘留檢測法探討
根據 Viñas et al.（2004）的報告可知，利用 DSC-18Lt 和 DSC-Ph 這兩種固相 萃取匣並且利用乙酸乙酯及甲醇的混合溶液進行沖提，對於四環素類抗生素的回 收效果最佳，尤其是羥四環素（Oxytetracycline）、美諾四環素（Minocycline）及 去氧羥四環素（Doxycycline），本研究為瞭解此兩種固相萃取管柱是否適於萃取蜂 產品中 OTC 的殘留，因此針對此方法進行探討，根據研究結果證實，此方法僅適 用於萃取蜂蜜中羥四環素的殘留量並不適用在蜂王乳及蜂花粉上。
根據試驗結果可知，以 DSC-Ph 作為萃取匣來萃取蜂蜜中 OTC 的效果最好，
因為蜂蜜成分較其他兩種蜂產品簡單，而且本試驗所檢測蜂蜜中 OTC 的回收率（圖
七）與 Viñas et al.（2004）報告中的結果雷同，故此方法適用於萃取蜂蜜樣品。然 而，利用此方法來萃取蜂王乳或蜂花粉時，由於此兩種蜂產品的成分複雜，所以 手續更為繁雜，因此必須添加有機溶劑來進行萃取，而操作過程可能會導致 OTC 殘留於萃取液中無法順利的取出。甚至在利用固相萃取管柱進行萃取時，因為蜂 王乳及蜂花粉提取液裡可能具有其他物質堵住萃取管柱內的孔隙或是表面導致萃 取過程中不順利，進而影響 OTC 的萃取，造成回收效果不佳。此外，為了改善蜂 王乳和蜂花粉中 OTC 的回收效果，本研究參考 Samanidou et al. （2007）報告中 的方法，藉由添加 TCA 來破壞蜂王乳和蜂花粉中蛋白質，因為 TCA 具有去蛋白 的作用，想藉由此方法來觀察是否能夠有效提高回收率，結果顯示，其回收效果 與之前使用方法的結果相同並沒有提高回收率。
由於研究蜂王乳及蜂花粉中 OTC 殘留量的報告很少，因此想藉由萃取蜂蜜裡 OTC 的方法來運用於蜂王乳及蜂花粉上是不可行的，可能需要更近一步的去探討 嘗試新的萃取管柱及溶劑，才能有效萃取出這兩種蜂產品中 OTC 殘留。
五、蜂蜜中 OTC 殘留測定探討
就羥四環素殘留量而言，日本等地的殘留容許量為四環素總量 300 ppb，而在 歐盟的規定限制殘留在 25 ppb 以下，本研究已建立蜂蜜中羥四環素殘留的檢測 法，經由固相萃取方式，檢測其蜂蜜樣本的殘留量。從表四可發現餵飼 50 mg 或 125 mg OTC 的試驗蜂群，檢測施藥後 10 及 20 日所搖除的蜂蜜樣本，其平均羥四 環素殘留量分別為 2625 ± 695、6983 ± 4069 及 40 ± 38、99 ± 71 ppb；於施藥 後 30 日所搖除的蜂蜜樣本中，餵飼 50 mg OTC 的試驗蜂群皆未檢測出羥四環素殘 留，而餵飼 125 mg OTC 的試驗蜂群則部分檢測出羥四環素殘留，其殘留量為 25 ppb。此結果顯示無論餵飼 50 mg 或 125 mg OTC 的蜂群均須搖除 1 次儲蜜才可達 到美、日等地的容許量，如果要達到歐盟的規定，須搖除 2 次以上的儲蜜才能有 效將羥四環素檢出率降低至 25 ppb 以下。由上述結果得知，蜂群如施用 OTC 來防
治 AFB，需停止生產蜂蜜一個月並於停產期間搖除 2 次以上儲蜜才能降低其殘留 量，因此本研究的結果是否適用於本省養蜂業者需近一步的思考。
六、美洲幼蟲病的防治策略
美洲幼蟲病是蜜蜂疾病中少數能完全摧毀蜂群的疾病之ㄧ，至今仍嚴重威脅 養蜂業者。病原體 P. larvae 可形成芽孢來抵禦不利的環境，因此當蜂場有發生過 AFB 就無法排除再發生的可能性。此外，養蜂業者欲早期發現 AFB 感染十分不易，
分析其原因，蜂群可能有輕微罹病情形，而藉由蜜蜂清潔行為自行移除罹病體，
因此感病初期不易發現病徵。然而，蜂群儲蜜或是花粉可能含有孢子，當養蜂業 者藉由調換巢脾或是餵飼花粉等行為導致散佈整個蜂場。只要蜂群與病原體的動 態平衡產生改變，一旦蜂場發現 AFB 典型病徵時，疾病往往已嚴重散佈至整個蜂 場。
OTC 是目前唯一被美國農業部核准使用（Hoopingarner and Nelson, 1988）和 部分澳洲地區（Oldroyd et al., 1989）用以防治 AFB 的藥劑，然而台灣農委會並未 許可使用任何藥劑來防治 AFB，目前本省推薦的防治方法為燒毀罹病的蜂群，但 此方法對於本省養蜂業者會造成極大經濟損失，所以大多不使用燒燬的方式寧願 選擇藥劑控制病情，因此 AFB 防治策略的擬定，最重要的是必須根據當地的養蜂 型態特性，訂定最佳的防治策略。
現階段而言，台灣蜂農只能利用蜂群管理的手段防治美洲幼蟲病，建議應定 期檢測蜂蜜中病原孢子數，尤其應將流蜜期最末 1 次的採收蜜送檢，以達到早期 偵測疫情的效果。送檢的蜂場採收蜜，如果被檢測不含病原孢子或孢子數低於 1 CFU/g，則吾人認為在沒有外來污染源的情況下，蜂群於 1 年內應沒有爆發疫情的 風險；如果採收蜜的孢子數介於 1 - 50 CFU/g，則應特別注意飼養蜂群的幼蟲發育 狀況，如果特定蜂群的幼蟲封蓋率低於 90％，則應採樣其蜂群儲蜜檢測病原孢子 數；如果採收蜜的孢子數介於 50 - 500 CFU/g，則蜂群出現 AFB 疫情的風險較高，
應立即針對封蓋率不佳的蜂群進行儲蜜檢測；如果採收蜜的孢子數高於 500 CFU/g，則應仔細調查是否已有蜂群出現少許 AFB 病徵。如果確認受感染蜂群，
應將感染蜂群隔離集中於一處養蜂場，如果蜂群已出現典型病徵，應將巢片全數 燒毀，只保留成蜂，另提供消毒完畢的蜂箱與新巢礎，並應餵飼糖水，讓巢內的 孢子自然減退，此後每月檢測單箱蜂群儲蜜 1 次，直至不再檢出孢子才能解除隔 離措施。如果蜂群未出現典型病徵，則應搖除儲蜜並加強餵糖水，搖出的蜂蜜應 取樣送檢，不可用以餵飼蜂群，之後每月檢測單箱採樣蜜 1 次，直至不再檢出孢 子為止。
表一、以平盤培養法檢測 2006 和 2008 年蜂蜜樣本的病原孢子檢出率
Table 1. The detection rate of AFB spores in honey by agar plate culture methods in 2006 and 2008
Detection rate (%) Source of honey
Negative sample Positive sample
Total sample
Single hive, Taiwan, 2006 87.4 (90) 12.6 (13) 103
Apiary, Taiwan, 2006 55.8 (153) 44.2 (121) 274
Apiary, Taiwan, 2008 75.2 (167) 24.8 (55) 222
Imported from Thailand, 2006 80.0 (24) 20.0 (6) 30
Total 69.0 (434) 31.0 (195) 629
表二、利用含 5 µg 羥四環素紙錠檢測幼蟲芽孢桿菌不同分離株的抑菌圈
Table 2. Zones of inhibition of Paenibacillus larvae isolates from different sources exposed to disc containing 5 µg oxytetracycline
Diameter of inhibition zone (mm) Source of isolates n
Mean ± s.d. Range Taiwanese honey, 2006 208 43.0 ± 6.2b* 21 - 60 Thai honey, 2006 11 43.3 ± 5.2b 31 - 49 Taiwanese honey, 2008 55 40.2 ± 8.4b 20 - 59 Type strain (ATCC9545) 20 58.2 ± 1.7a 53 - 63
*Means in the same column followed by different letters are significantly different by LSD multiple range test (p < 0.05).
表三、幼蟲芽孢桿菌分離株對 5 µg 羥羥羥羥四環素紙錠的敏感性分類
Table 3. Categories of susceptibility of Paenibacillus larvae isolates from different sources exposed to disc containing 5 µg oxytetracycline
Number of Paenibacillus larvae isolated from Taiwanese honey Thai honey ATCC 9545 Categories
2006 2008 2006 High
(diameter ≧ 50 mm)
34 (16.35%)
8 (14.6%)
0 20
(100%) Moderate
(diameter ＜50 mm,
≧ 40 mm)
124 (59.62%)
18 (32.7%)
9 (81.82%)
0
Low
(diameter ＜40 mm)
50 (24.04%)
29 (52.7%)
2 (18.18%)
0
Total 208 55 11 20
表四、餵飼 50 mg 及 125 mg OTC 糖水後，各蜂箱 10、20 及 30 日蜂蜜的 OTC 殘 留量
Table 4. OTC residues in honey after medicating honeybee colonies with 50 and 125 mg OTC sugar syrups
OTC residues post-treatment (ppb) Hive no. OTC dose
(mg) Day 10 Day 20 Day 30
A5 50 2,800 33 ND*
A6 50 3,100 8 ND
A7 50 1,600 95 ND
A8 50 3,000 25 ND
Mean 2,625±695a** 40±38a -
A9 125 5,480 33 ND
A10 125 5,120 200 25
A11 125 13,040 90 8
F11 125 4,290 74 ND
Mean 6,983±4069b 99±71a -
* ND, non-detectable (OTC < 5 ppb).
** Group means in the same column followed by different letters are significantly different (P < 0.05).
( A )
( B )
圖一、2006 年與 2008 年台灣地區蜂蜜樣本中美洲幼蟲病原孢子數含量（CFU/g）。
( A ) 2006 年檢測結果( B ) 2008 年檢測結果。
Fig 1. Spore number (CFU per gram honey) of Paenibacillus larvae in honeys sampled from Taiwan, 2006 and 2008( A )results of 2006 ( B ) results of 2008.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Contest Apiary
0
<1
1 to 50
50 to 500
>500 CFU / g 0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Single hive Contest Apiary Thai honey
0
<1 1 to 50 50 to 500
>500 CFU / g
圖二、1 日齡蛹體注射 Paenibacillus larvae 的孢子，1 個月後蟲體呈現乾癟狀美洲 幼蟲病徵。
Fig 2. Injecting 1-day-old worker pupae with Paenibacillus larvae spores, the pupae showing American foulbrood sign of scale at 1 month post-inoculation.
圖三、蜂群餵飼 125mg OTC 糖水處理前後接種 P. larvae 孢子幼蟲的發病率。
Fig 3. Honeybee colonies were medicated with 125mg OTC syrup processing to vaccinate Paenibacillus larvae spore inoculums larvae disease incidence rate.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-9 -6 -3 0 3 6 10
day
AFB sign(%)
control 0.01 CFU 0.1 CFU 10 CFU 100 CFU
OTC 125 mg extracted honey
圖四、蜂群餵飼 50mg OTC 糖水處理前後接種 P. larvae 孢子幼蟲的發病率。
Fig 4. Honeybee colonies were medicated with 50mg OTC syrup processing to vaccinate Paenibacillus larvae spore inoculums larva disease incidence rate.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-9 -6 -3 0 3 6 10
day
AFB sign(%)
control 0.01 CFU 0.1 CFU 10 CFU 100 CFU
OTC 50 mg
extracted honey
圖五、接種 Paenibacillus larvae 孢子於田間蜂群，12 天後蟲體呈現腐爛狀美洲幼 蟲病徵（箭頭處）。
Fig 5. The pupae showed American foulbrood sign (arrows) of rotten in 12 days after inoculation Paenibacillus larvae spores in bee colony.
圖六、濃度 5.0µg/mL OTC 於高效能液相色層分析儀所呈現的圖譜, 所使用的管柱 為 ZORBAX SB-C18, 4.6×250mm，5µm, 移動相為咪唑緩衝溶液 / 甲醇 ( 77 ： 23,v/v)，檢測器為螢光檢測器，檢測波長分為激發波長 380 nm，發射波長 520 nm 流速 1.0 mL/min，進樣量 100µL。
Fig 6. High performance liquid chromatography Chromatograms of oxytetracycline with 5.0µg/ml concentration using C18 column and a mobile phase containing imidazole buffer / methanol ( 77：23, v/v), with fluorescence detection at 380 nm excitation and 520 nm emission. flow rate, 1mL/min；injected sample 100µL.
圖七、不同蜂產品含濃度 5.0µg/mL OTC 於高效能液相色層分析儀所呈現的圖譜，
所使用的管柱為 ZORBAX SB-C18 4.6×250mm，5µm，移動相為咪唑緩衝溶液 / 甲 醇 ( 77 ：23,v/v )，檢測器為螢光，檢測波長分為激發波長 380 nm,發射波長 520 nm，流速 1.0 mL/min，進樣量 100µL，(A) 羥四環素標準品；(B) 蜂蜜；(C) 蜂花 粉；(D) 蜂王乳。
Fig 7. High performance liquid chromatography Chromatograms of oxytetracycline with 5.0µg/ml concentration in different bee product using C18 column and a mobile phase containing imidazole buffer / methanol ( 77：23, v/v), with fluorescence detection at 380 nm excitation and 520 nm emission. flow rate, 1mL/min；injected sample 100µL.
(A) OTC standard；(B) Honey；(C) Pollen；(D) Royal jelly.
A . OTC Standard B. Honey 1. OTC
C. Pollen 1 D. Royal jelly 1
1 1
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