AFB 傳染力極高，而且病原孢子又有極強的環境抗逆性，因此最有效的防治 策略是將病徵出現的蜂群連同巢脾及蜂箱全部燒燬（Ratnieks, 1992; Matheson and Reid, 1992），但這方法是要養蜂業者能於疾病初期即偵測發現 AFB 的前提下使 用，否則當 AFB 蔓延整個蜂場時，全蜂場都必須要燒燬，造成養蜂業者莫大的損 失。實際上，AFB 病徵出現初期不易察覺，一旦發現典型 AFB 病徵時，通常疾病 已經蔓延並危害整個蜂場。目前有許多研究者探討蜂群罹病程度與蜂群儲蜜孢子 數之間的關係（Shimanuki and Knox, 1988; Hornitzky and Clark, 1991; Steinkraus and Morse, 1992; Derakhshifar, 1994），希望能提早發現 AFB 的蜂群或建立預警制度。
然而，有些養蜂業者只燒燬或是殺滅成蜂與罹病的巢片，但其餘物品經過滅 菌後還繼續使用，例如蜂箱、蜂具和巢脾等；對於滅菌有很多方法被討論及應用，
例如早期的氧化乙烯（ethylene oxide）的燻蒸（Shimanuki and Lehnert, 1968; Knox et al., 1976; Gochnauer et al., 1979）以及高頻電子束（high velocity electron beams）
和目前技術最為成熟且已商業化的伽傌射線（gamma radiation）的應用，並且可利 Taber,Ⅲ, 1978; Gilliam et al., 1979; Hoopingarner and Nelson, 1988; Hornitzky et al., 1988; Oldroyd et al., 1989）。然而，使用 OTC 會造成病原逐漸產生抗藥性（Shimanuki and Knox, 1994; Peng et al., 1996; Miyagi et al., 2000; Alippi, 2000; Piccini and Zunino, 2001; Antúnez et al., 2004; Alippi et al., 2005; Cox et al., 2005），也會殘留於
蜂產品中（黃， 1989; Wilson, 1974; Lehnert and Shimanuki, 1981; Chiu and Chu, 1990;
Matsuka and Nakamura, 1990; Thompson et al., 2005; Martel et al., 2006）。因此，OTC 藥劑的使用量、藥效持續性及蜂產品中藥劑殘留量，都成為防治 AFB 的參考指標 2000）、酵素免疫分析法（Heering et al., 1998; Sczesny et al., 2003）、分光光度計、
螢光測定法（Chang et al., 1992）、電化學偵測儀、毛細管電泳（Hsiao et al., 2001）
和高效能液相層析儀搭配紫外光（Vinas et al., 2004）、螢光（Pena et al., 2005）及 化學發光偵測方式（Wan et al., 2005）等都能測定蜂蜜裡的殘留量，然而主要是由 於實際運用上缺乏良好的敏感性以及受到蜂蜜裡物質的干擾，導致只有少數幾個
方法能應用於田間樣品的檢測。目前，有報告指出，在測定蜂蜜中 OTC 及四環素 類具有特殊及敏感的分析方法為高效能液相層析儀並搭配螢光偵測儀（Pena et al., 2005）。
許多檢測技術多以檢測蜂蜜中 OTC 殘留量，鮮少提到蜂蜜之外的蜂產品檢測 方法，雖然有部分報告是從蜂花粉或是蜂王乳中檢驗其他成分殘留（Jimenez et al., 2007; Antinelli et al., 2002），但鮮少提到蜂王乳或是蜂花粉中 OTC 的殘留檢測分 析。因此本研究另嘗試建立蜂花粉，以及台灣重要的出口蜂產品－蜂王乳，進行 OTC 殘留檢測的相關研究，此外藉由人工接種孢子來進行田間試驗，以探討 OTC 的防治效果及藥效持續性與蜂蜜中 OTC 殘留量的關係。
參、材料與方法
一、蜂蜜中美洲幼蟲病原孢子的檢測
(一) 蜂蜜樣品的來源
本研究檢測 2006 與 2008 年台灣各地（599 件）及泰國進口（30 件）蜂蜜樣 品，共 629 件樣本，每件樣品約 50 ~ 100 g。台灣本土蜂蜜樣品又分為養蜂場採收 蜜與單群蜜蜂儲蜜等 2 類，而前者是台灣蜂農於 2006 與 2008 年流蜜期採收的蜂 蜜，每處蜂場抽樣約 50 mL 為 1 檢測樣品；單群蜜蜂儲蜜樣品則委請全國各地蜂 農抽樣其飼養蜂群的儲蜜，每處蜂場約抽樣 3 ~ 5 群蜜蜂，以單一蜂群的儲蜜為一 樣品，採樣時以鐵製湯匙擠壓巢片上方的儲蜜區，將流出的蜂蜜收集於 50 mL 塑 膠離心管，每群蜜蜂約取 40 ~ 50 mL 的儲蜜。若依蜂蜜來源的產地區分則包含台 灣與泰國進口，台灣的蜂場採收蜜又可分為委請台灣各地養蜂產銷班採收的蜂蜜 與該年參加苗栗區農改場舉辦全國蜂蜜評鑑比賽通過複賽之評鑑蜂蜜，而單箱儲 蜜的產地則與蜂場採收蜜同為台灣各地；泰國進口的蜂蜜樣本是來自兩家本國進 口商於 2006 年從泰國進口的龍眼蜂蜜，以之與台灣蜂蜜的檢測作為比較。
(二) 檢測病原孢子數與建立分離株
每一蜂蜜樣品秤量 20 g 於 50 mL 塑膠離心管中，加入 20 mL 無菌水並充分震 盪混合，將此均質液於 4℃，6000 xg 離心 40 min，去除上清液，再以無菌水定量 至 1 mL，最後以水浴加熱（80℃，20 min）殺除雜菌。之後取 0.2 mL 分離液，塗 抹於 BHITN（DIFCO，brain-heart infusion supplemented with 0.1 µg/mL thiamine and 9 µg/mL nalidixic acid）平板上，以 1 mm 玻璃珠均勻塗佈。之後培養於 37℃, 5% CO2
恆溫培養箱 72 hr，每一樣品至少塗抹 2 平板。72 hr 後取出，根據菌落形成的時間
（3 日）與形態（圓形，直徑 1 ~ 3 mm，灰白色，扁平狀，菌落周緣不規則）初 步判定為幼蟲芽孢桿菌（Paeniacillus larvae），並計算每克樣品的菌落形成單位
（colony-forming unit, CFU/g）。
每一平板至少挑選疑似菌落進行增殖，增殖後的分離株先以 catalase test 測試 為陰性，再根據 Bakonyi et al. (2003) 的 PCR 檢測法偵測特定 DNA 片段（472 bp）， 以確認分離株是否為 P. larvae，如是則再予以增殖並冷凍保存於 25% glycerol 中。
(三) 幼蟲芽孢桿菌分離株對羥四環素的敏感性測試
1. 標準菌的試驗
將標準菌 ATCC 9545 菌株繼代培養 2 次後，利用無菌棉棒挑取菌體均勻塗佈 於 BHIT（DIFCO，brain-heart infusion supplemented with 0.1 µg/mL thiamine）平板 上，於平板中央放置 1 片含 5 µg 羥四環素的紙盤（DIFO，直徑 6 mm），培養於 37℃, 5% CO2恆溫培養箱 72 hr。3 日後取出，測量 5 µg 羥四環素紙盤所導致的抑 菌圈直徑，並整理出標準菌 ATCC 9545 對羥四環素的敏感性。
2. 本土與進口分離株的試驗
從台灣與泰國進口蜂蜜分離培養的菌落中，每一平板至少挑取單一 P. larva 菌落進行繼代培養 2 次後，利用無菌棉棒挑取菌體均勻塗佈於 BHIT 平板上，於 平板中央放置 1 片含 5 µg 羥四環素的紙盤（DIFO，直徑 6 mm），培養於 37 , 5% ℃ CO2恆溫培養箱 72 hr，每分離株至少進行二重複。3 日後取出，測量 5 µg 羥四環 素紙盤所導致的抑菌圈直徑，以探討分離株對羥四環素的感受性。
二、羥四環素防治 AFB 的效果
(一) 孢子接種源的製備
由上述感受性測試中，選取對羥四環素具有低敏感性本國分離株（抑菌圈直 徑為 21 mm），利用移菌環選取 P. larva 菌落培養於 BHIB（Brain heart infusion
broth），37℃，200 rpm 震盪式恆溫培養箱 48 ~ 72 hr。之後，將此培養液於 25℃，
6000 xg 離心 5 min，去除上清液，再以無菌水定量至 1 mL，利用微量注射器注射 進入 1 日齡工蜂蛹體的第一與二體節之間，注射量約 3 µL，共 100 隻，注射後的 蛹置於恆溫培養箱（34℃）中，約一個月可出現典型 AFB 病徵，收集其中 12 隻 感病蟲體先加入 1 mL D.D.W 磨碎後，再加入 2 mL D.D.W 沖洗 Pellet，將上述液 體注入 50 mL 離心管並震盪混勻，將此均質液低速離心（500 xg, 5 min），取上清 液，再以 6000 xg 離心 40 min，去上清液，以 PBS 定量至 12 mL，最後以水浴加 熱（80 , 20 min℃ ）殺除雜菌，以 PBS 做 10 倍量序列稀釋，之後取 100 µL 稀釋菌 液均勻塗於 BHITN 培養基上，各進行二重覆，培養於 37 , 5% CO℃ 2恆溫培養箱 72 hr，用以估算接種孢子源的濃度。
(二) 田間蜂群的防治試驗
於 2007 年 10 月選取宜蘭大學試驗蜂場內 8 群健壯的西洋蜂，每群蜜蜂其工 蜂族群均滿 9 片且有 1 隻產卵正常的后蜂。試驗蜂群各餵飼 800 mL 含 OTC 的糖 漿（蔗糖：水＝1：1，W/W）1 次，糖漿中分別含有 OTC 50 mg 與 125 mg 二種 劑量，換算 OTC 濃度分別 63 µg/mL 與 156 µg/mL，各劑量均餵飼四群（四重複）； 另為減低藥劑殘留期，所有蜂群均於施藥 10、20、30 日後搖去儲蜜，並檢測蜂蜜 中羥四環素殘留量。為探討 OTC 的防治效果，選取 1 日齡幼蟲接種前述備製之本 土分離具耐藥性的 P. larvae 孢子，分別於餵食 OTC 前 9、6、3 日，餵飼後 0 日、
3 日、6 日、10 日，選取 1 日齡工蜂幼蟲接種 0.01 CFU、 0.1 CFU、10 CFU 和 100 CFU 劑量孢子，每劑量於試驗蜂群各接種 50 隻，對照組則接種無菌水，以探討 OTC 對 AFB 的防治效果及藥效的持續性。
三、蜂產品中羥四環素的檢測法
1.試藥與器材
羥四環素標準品（純度 90%, Sigma, USA），氰甲烷（皓峰，台灣）、甲醇
（Mallinckrodt, USA）均為 LC 級，正己烷（95%, J. T. Baker, USA）、醋酸乙酯
（Mallinckrodt, USA）、檸檬酸（石津製藥，日本）、磷酸氫二鈉（石津製藥，日 本）、鹽酸（FERAK, Germany）、咪唑（Fluka, Germany）、醋酸鎂（J. T. Baker, USA）
為試藥級，真空固相萃取裝置包括矽膠過濾層析管柱（DSC-PH 和 DSC-18LT cartridge, SUPELCO），真空減壓濃縮裝置包括冷凝機（Water bath D-606）、抽氣 幫浦（BUCHI Vac® V-500）、控制器（BUCHI Vacuum Controller V-800）、旋轉濃 縮器（BUCHI Rotavapor R-215）、加熱器（BUCHI Heating Bath B-491）。
2.分析方法：
(1) HPLC 操作條件
高效能液相色層分析儀（HPLC, Agilent 1200）包括多溶液輸送系統
（Multisolvent delivery system）、螢光檢測器（fluorescence detector）
與紫外光檢測器（UV detector）。
層析管：ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm, 5µm, Agilent）。前置 Frit Filter 的 Guard-Pak holder，以延長層析管之使用壽命。
移動相：咪唑（imidazole）緩衝溶液 / 甲醇（77：23, v/v），流速 1.0 ml/min，進樣量 100 µL，螢光檢測器的激發波長 380 nm，發散波長 520 nm。
(2) 檢量線
精秤 10 mg 羥四環素標準品，置於 100 mL 定量瓶中，加甲醇至刻度，
均勻混合，即為 100 ppm 原液。取適量原液以 0.5 N 鹽酸稀釋成 5、1、0.5、
0.1、0.05、0.01 ppm，注入高效能液相色層分析儀，分別測定各濃度波峰 面積，以製作檢量線。
(一) 蜂蜜樣品的分離與淨化
取 2.9 g 蜂蜜並人為添加濃度 50 µg/mL 羥四環素，添加量為 100 µL，之後加 入 6 mL 0.01M Na2-EDTA pH 4.0 MacIlvaine 緩衝溶液並震盪混勻。再以 3000 rpm 轉速下離心 15 min，取上清液，分別使用 DSC-PH（phenyl, 7% C）及 DSC-18LT
（octadecyl, 11% C）兩種固相萃取管柱進行淨化，先分別用 5 mL 乙晴、10 mM 草 酸、飽和 Na2-EDTA 進行活化管柱，接著注入蜂蜜樣品，再用 5 mL 之 10 mM 草 酸進行清洗的步驟，最後用 5 mL 乙酸乙酯與甲醇的混合比例（90：10）進行沖提，
將沖提液利用真空減壓濃縮機進行濃縮的步驟至沖提液完全乾為止，再用 10mM 草酸定量至 1 mL，最後用 0.22 µm 濾膜來過濾，之後取 100 µL 的樣品過濾液注入 HPLC 並測定波峰面積進行羥四環素殘留分析。
(二) 蜂王乳樣品的分離與淨化
取 0.9 g 蜂王乳並人為添加濃度 50 µg/mL 羥四環素，添加量為 100 µL，之後 加入 6 mL 0.01M Na2-EDTA pH 4.0 MacIlvaine 緩衝溶液並震盪混勻。再以 12,000 xg 轉速下離心 15 min，取上清液，分別使用 DSC-PH（phenyl, 7% C）及 DSC-18LT
（octadecyl, 11% C）兩種固相萃取管柱進行淨化，先分別用 5 mL 乙晴、10 mM 草 酸、飽和 Na2-EDTA 進行活化管柱，再用 5 mL 之草酸（10 mM）進行清洗的步驟，
最後用 5 mL 乙酸乙酯與甲醇的混合比例（90：10）進行沖提，將沖提液利用真空 減壓濃縮機進行濃縮的步驟至沖提液完全乾為止，再用 10mM 草酸定量至 1 mL，
最後用 5 mL 乙酸乙酯與甲醇的混合比例（90：10）進行沖提，將沖提液利用真空 減壓濃縮機進行濃縮的步驟至沖提液完全乾為止，再用 10mM 草酸定量至 1 mL，