嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告
計畫編號：CN9743
計畫名稱：水芫花的胚胎幹細胞毒性測試
計畫類型：一般個人型研究
執行期間：97 年 1 月 1 日~97 年 12 月 31 日 計畫主持人： 莊一全
執行單位：嘉南藥理科技大學 生物科技系
中華民國 98 年 3 月 20 日
摘要
水芫花為亞熱帶地區的民間傳統用藥，常被用來作為止痛、抑菌、治關節炎、
抗癌、解毒、減重和抗氧化等用途，但世界上卻幾乎沒有相關的毒理和藥理上的研 究。在用藥安全上，為確認水芫花是否有胚胎幹細胞毒性，本研究擬採用胚胎幹細 胞試驗法，在胚胎幹細胞分化成心肌的過程中，使用各種劑量的水芫花抽取物，來 評估是否具有影響老鼠胚胎幹細胞分化變成心肌細胞的能力，也就是模擬母體內的 胎兒發育重要階段，是否會被藥物阻斷的現象；以及伴隨測試未分化的老鼠胚胎幹 細胞與已分化但尚屬早期胚胎時期的老鼠纖維母細胞3T3的細胞毒性作用，被測試 的細胞廣域涵蓋了最原始的胚胎幹細胞、分化中的胚胎幹細胞與已分化的胚胎纖維 母細胞。實測方法上，在影響分化方面，採用鏡檢EB小體的分化成幹細胞的比例，
來計算早期表現心肌蛋白sarcomeric myosin heavy chain的細胞；在細胞毒 性方面，測量胚胎幹細胞和胚胎纖維母細胞對藥物的細胞毒性作用LD50。在本計畫 中，我們已經建立穩定培養老鼠的胚胎幹細胞株的能力，在培養上都能穩定的繼代 幹細胞，並能成功的凍存與解凍。在建立穩定分化老鼠的胚胎幹細胞株方面，我們 形成embryonic body後，大約只有一半的embryonic body會自主分化成心肌 細胞，這可能和細胞的來源原始條件，或培養技術的問題，甚至形成embryonic body的細胞數目，或各種近程的培養時間都會影響，有待未來進一步釐清，以及提 升自動分化的效率。在進行胚胎幹細胞的分化終點分析方面，分化10天候評估形成 跳動心肌細胞的數目，因為心肌跳動必須經由節律點驅動，若缺乏驅動起始點，即 使是心肌也可能不收縮，未來或許能加入刺激引動心跳的物質，才能進一步鑑定是 否真有分化成心肌，或利用染色的方法，看看分化指標有無出現，並比對分子指標 和肉眼觀察間的差異情形，才能有效評估兩者之間的關係。本研究發現高濃度的水 沅花可以促進心肌的分化，而低濃度的水沅花萃取液反而不利於心肌的分化，甚至 引起心肌細胞的死亡，因此水沅花和心肌間的關係值的進一步做研究。在分析ES cells和3T3 cells的細胞毒性方面，ES cells和3T3 cells在低濃度時呈現 不同的現象， 3T3 cells會有兩倍的細胞增值作用，而ES cells數目沒有影響。
在高濃度時，胚胎幹細胞呈現比3T3更耐高濃度的水沅花而得以存活。由於幹細胞 對藥物相當敏感，會以分化抑制或促進的方法呈現；但對水沅花的毒性耐受反而比 體細胞大很多，所以在生存適應上，胚胎幹細胞應是大於體細胞。本研究將建立胚 胎幹細胞毒性測試的平台，可用來大量篩檢藥物；未來將進一步培養人類胚胎幹細 胞，讓藥物影響人類胚胎幹細胞的基因組分化環境，評估是否可用來取代現今採用 老鼠胚胎幹細胞來作幹細胞毒性測試的平台。
中文關鍵詞：水芫花、胚胎幹細胞試驗、胚胎幹細胞、致畸性
前言
水芫花生長在亞熱帶的海岸邊，在台灣人民的習俗裡，Pemphis acidula是 民間的一種傳統用藥，被用來當止痛劑(analgesic)、抑菌劑
(bacteriostati)、治關節炎(antiarthritic) [Hung, 2003]、抗癌、美 白、抗氧化、減肥或解毒劑。在萬那杜共和國，它是婦產科醫院的醫療用藥，使用 在人類生殖系統相關的問題處理。先前有少許的研究顯示，水芫花具有活化老鼠雌 激素的能力[Bourdy, 1992; Bourdy, 1996]。水芫花葉子萃取物含有四種 galloyl flavonol glycosides，其中含有quercetin和kaempferol 6"-O-galloyl-beta-D-glycosides。在抗氧化相關的測試，像DPPH抗氧化活 性上，或抑制methyl linoleate oxidation，或抑制氧化性物質造成細胞死 亡，都顯示水芫花萃取物出有這類的活性[Masuda, 2001]。Pemphis acidula 在用法上有許多的傳奇故事，但多沒有科學上的依據。由於使用的年齡層相當廣 泛，為確定其使用上的安全性，我們想要測定水芫花會不會有影響胚胎發育，或對 幹細胞和較早期分化的細胞產生毒性的現象。
現今幹細胞的培養技術已日漸成熟，其應用可分為三大類︰(1)組織修復-分化 為特定細胞或組織，作為細胞再生或組織移植；(2) 基因表現、人類發育、疾病發 生、癌症研究等；(3) 新藥開發-以特定幹細胞針對藥物的安全性及有效性分析和
篩選。胚胎毒性測試在活體上常使用懷孕的動物，或體外培養胚體、胚胎組織或細 胞。不管活體或體外測試，都要犧牲懷孕的動物[Doetschmann,1985]。近來有 一種新式的胚胎毒性測試法，利用添加藥物來觀察，胚胎幹細胞在培養的過程中所 具有的分化的潛能是否會受到影響。這種以可分化細胞株來替代老鼠胚胎的使用，
稱為胚胎幹細胞測試(embryonic stem cell test) [Spielmanne,. 1997]。
這個測試方法測定胚胎毒性最重要的參數，可同時考量(1)抑制胚胎幹細胞的分化 力情形。(2)胚胎細胞的細胞毒性效應和(3)胚胎體細胞的細胞毒性效應所造成的 損傷。
在胚胎幹細胞毒性測試裡，主要使用兩種細胞株來獲得影響分化與細胞毒性的 參數。老鼠胚胎幹細胞用ES D3細胞株，可以操作分化和細細胞毒性效應。胚胎纖 維母細胞3T3可以代表已分化的胚胎組織。胚胎幹細胞具有快速分裂繁殖的能力，
在擴增培養時必須使用leukemia inhibiting factor (LIF)來抑制分化，當 我們可以控制胚胎幹細胞的分化時機，胚胎幹細胞毒性測試就漸漸的有基礎可以開 始發展。將胚胎幹細胞當脫離未分化的時期後，胚胎幹細胞會形成EBs小體，並在 適當的條件下開始分化成主要的胚胎組織。
細 胞 毒 性 測 試 數 據 顯 示 ES cells 對 於 有 毒 物 質 的 感 度 高 於 成 體 細 胞 [Laschinskiet, 1991]。抑制 ES cells的分化、抑制ES cells的生長與抑 制3T3 cells的生長，是EST測試裡三個被選用來預測化學物質，是否有胚胎毒性 潛能的測試終點。在實驗設計上，測試終點值ID50和IC50主要用來測定：1.細胞分
化(ID50 ES cells)：用光學顯微鏡測量，計算抑制50%ES cell分化成心肌 myoblasts的待測物濃度。2.細胞存活率(IC50 ES cells和IC50 3T3)：用MTT assay測量3T3和ES cell，存活率被抑制到剩餘50%的待測物濃度。3.細胞增殖 率(IC50 ES cells和IC50 3T3)：用MTT assay測量3T3和ES cell，是否代側 物有助於細胞的增殖。
老鼠ES cell細胞株D3在培養上，必須持續的給予LIF來抑制分化的產生，當 不添加LIF時，ES cells開始自發性的分化。要促進ES cell規則的分化，必須 採用懸浮培養的方法，將含有ES cells的培養液小滴放在10公分細胞培養用培養 皿的蓋子上[Wobus, 1991]，培養三天後ES細胞會聚集結合，此時將這些聚集的 細胞小塊放到培養細菌用書水性的培養皿上，兩天後將EB小體放到24-well plates，這些EB小體會分化成類胚胎的組織。
同一種待測試的化合物被配製成多種濃度，添加進幹細胞的培養液中，用光學 顯微鏡觀察，是否會干擾EB小體在培養的第十天分化成具收縮性的心肌細胞過程。
3T3 cells和ES cells在96孔盤中細胞數目會成指數生長，細胞種植兩個小時以 後，八種濃度的待測物質或待測物質所溶解的溶劑添加到適當的細胞裡面，經過十 天的培養，用MTT法在波長570 nm，參考波長630 nm以ELISA測試細胞生長的情 形。
European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) 曾 經 用 科 學 的 評 估 方 法 ， 評 估 胚 胎 幹 細 胞 試 驗 (EST) ， 和
postimplantation rat whole-embryo culture test (WEC)， 以 及 micromass (MM) test，一同測試20種參考化學物質，來取得對動物和人類高 品質的體內胚胎毒性數據。就評估的正確率顯示，100%的預測正確性以強胚胎毒性 物質對這三種胚胎毒性測試方法進行實驗 [Genschow, 2002; Genschow, 2004; Spielmann, 2004; Piersma, 2004]，當細胞毒性試驗有包含在胚胎 幹細胞實驗時，使用胚胎幹細胞實驗有78%的正確率；Micro Mass test有70%
的正確率， postimplantation whole embryo culture test (WEC)有80%
的 正 確 率 。 根 據 ECVAM 的 科 學 顧 問 委 員 會 (Scientific Advisory Committee)，這三種胚胎毒性測試的方法，測試結果在科學上都是有效且可被常 規利用的方法[Hellsten, 2002]。
相對於用顯微鏡觀察的方法，為了能夠及早知道影響分化的結果，以及擴增更 多更明顯的分化終點指標，與應用在高流量的用途，EST可被改良成由分子的表現 來 預 知 分 化 的 情 形 [Spiemann, 2000; Seiler, 2002; Seiler, 2004, Buesen, 2004]。改良式的EST操作方法由The Centre for Documentation and Evaluation of Alternatives to Animal Experiments (ZEBET) 發展，藉由表現α-actinin和sarcomeric myosin heavy chain (MHC)基 因的過程，加入化學藥物到培養液中，以流式細胞計數儀測定予定量是否會影響特 定標的蛋白的表現[Seiler, 2004]。另外一種方法是用TagMan PCR來半定量基 因的表現也重在被發展中[Nieden, 2004]。以有限的化合物當參考物質測試，流
式細胞計數儀在測定致畸性上與傳統方法用顯微鏡觀察分化成會跳動的心肌細胞 數目有相同的感度[Seiler, 2004]。
在本計劃中，我們設計以干擾老鼠胚胎幹細胞的分化和懷孕13天的老鼠胚胎纖 維母細胞來預測胚胎毒性後，未來再輔以人類胚胎幹細胞來測試。人類系統在某些 地方不同於老鼠，例如番木鱉鹼對於天竺鼠、雞、猴子沒效，但是極微量就足以使 人類發生抽搐；胰島素能讓母雞、兔子、老鼠產生畸形，但是對於人類卻不會有類 似的影響。現今培養胚胎幹細胞的技術已相當的成熟，因此若能用人類胚胎幹細胞 來測試校正，並建立hEST，將可能更能代表人類接受到化學物質時的真實反應。本 測試系統建立後，將嘗試著在流式細胞儀上建立更多的marker，來早期預測更多 樣的胚胎幹細胞毒性，並強化其預測效果。再以人類胚胎幹細胞替代老鼠胚胎幹細 胞，並選用人類胚胎纖維母細胞WI-38(lung)或Detroit 551(skin)，來建立 細胞毒性測試的數據。並以所建立的方法，來測試多種濃度與部位的Pemphis acidula抽出物或萃取物，或多重傳統中草藥物，將能更近一步確認這些民間常用 藥材的安全性；也能讓台灣的本土用藥在國際化時，也能報告出最新的胚胎幹細胞 測試數據，證實對人體的胚胎組織是安全的。
材料與方法
本研究主要在建立實驗室具有穩定培養與分化胚胎幹細胞的能力，以及建 立完整的胚胎幹細胞測試流程，並且進行藥品的胚胎幹細胞測試。工作包含：
(1)建立穩定培養老鼠的胚胎幹細胞株的能力。(2)建立穩定分化老鼠的胚胎幹 細胞株。(3)進行胚胎幹細胞的分化終點分析。(4)分析 ES cells 和 3T3 cells 的細胞毒性，(5)預測胚胎幹細胞毒性的潛能計算，以及(6)建立國內通量的胚 胎幹細胞毒性測試藥物的標準操作程序。為取得水沅花植株，需先向墾丁國家公 園管理局提出申請，核准後(圖 1)至墾丁國經公園採集，座標方位為 21.969759, 120.717046。水沅花生長在海邊的珊瑚礁上（圖 2,圖 3），相當的耐鹽分，採 集回來後以熱水烹煮成水沅花萃取液，儲存備用。
胚胎幹細胞毒性測試需要培養幹細胞(圖 4)和飼細胞，以及 3T3 細胞(圖 5)，詳細的準備方法方法描述如下：
(1)建立穩定培養老鼠的胚胎幹細胞株的能力。
a. 購買BCRC Number: 60205的ES-D3 mouse pluripotent embryonic stem cell和BCRC Number:60003的STO fibroblast cell。
b. 培養液配置: ES-D3細胞:85% Dulbecco's modified Eagle's medium with 4 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose and supplemented with 0.1 mM 2-mercaptoethanol + 15% fetal bovine serum ,10 ng/ml of LIF.
STO細胞: 90% Dulbecco's modified Eagle's medium with 4 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose and 10% fetal bovine serum。
c. 飼養層的製備
1. 取6 well的cell culture plate，於每個well中分別加入0.02 % gelatin solution 0.3ml，均勻的潤濕well底部後，把溶液吸出並置 於無菌操作台內風乾plate。
2. 以STO或老鼠纖維母細胞作為飼養層的細胞材料，將已長滿細胞的T75 flask吸出培養基，並加入10 μg/ml的mitomycin C solution，置 於incubator中反應3小時。
3. 反應完後吸出mitomycin C solution，以胰蛋白酶作用取下細胞，經 離心後使用DMEM with 10% FBS調整細胞濃度至105 cells/ml。 4. 吸取體積1ml的細胞液至上述以gelatin處理之cell culture plate
中，即製備出幹細胞培養之飼養層。
d. D3-ES cells的細胞培養
1. 將養有準備繼代的小鼠胚幹細胞群落的培養盤的T75 flask自培養箱中取 出，以DPBS潤洗三次。
2. 再加入5 ml 的Trypsin-EDTA，並移入二氧化碳培養箱中靜置3~5分鐘。
3. 待細胞浮起後，加入10ml的D3culture medium混和均勻，並將細胞液 吸出進行離心，離心後除去上清液並加入新鮮的D3 culture medium 混 和均勻，將其均分至已製備好的飼養層上。
4. 移入二氧化碳培養箱中培養，培養二到三天，就要準備下一次的繼代操作
（實際繼代操作的時間則視細胞群落的狀態決定）（圖4）。
e. D3-ES cells的功能性測試
1. D3-ES cells培養在飼養層上，每隔兩天更換一次培養基。
2. 二週後將培養基吸去，以DPBS清洗3次，加入alkaline phosphotase reagent與細胞作用30分鐘後，再以DPBS清洗之。
3. 使用8% 的 paraformaldehyde將細胞固定10分鐘，於光學顯微鏡下觀 察染色的情形，瞭解幹細胞是否維持未分化前的細胞活性。
f. ES D3的Freezed Medium為93% culture medium + 7% DMSO。
(2)建立穩定分化老鼠的胚胎幹細胞株(圖6、圖7)
a. 分化老鼠胚胎幹細胞
1. 在分化抑制因子LIF存在下，老鼠胚胎幹細胞株D3可被長久的培養。一旦LIF 缺乏時，老鼠胚胎幹細胞會自發性的分化。
2. 將各種濃度的待測化合物加入幹細胞懸浮液。
3. 滴狀培養的老鼠胚胎幹細胞株懸浮在DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)中，放在10 cm Petri dishes的蓋子上懸浮培養 [ Wobus, 1991]。
4. 培養三天後，待聚集成類胚體（embryoid body）團後，轉移到bacterial (非tissue culture treated) Petri dishes。
5. 兩天後將類胚體放到24-well plates (tissue culture treated) 未
來將分化成類胚胎組織。
6. 再過五天以後，用光學顯微鏡檢測培養盤內分化成具收縮性的心肌細胞(圖 8)。
b. ES cell 分化分析 第0天
1. 從未分化的ES cell (60-mm ES cell培養盤)準備ES cell懸浮液(3.75 x 104 cells/mL)，一組濃度範圍的待測化合物，6-8個濃度範圍，溶在 D3 assay medium。每種濃度用2到4倍的倍率稀釋，濃度必須涵蓋具有細 胞毒性的區域。溶劑溶在D3 assay medium。
2. 每種濃度的待測化合物、溶劑控制組和控制組各用一個Petri dishes，使 用60-mm的bacterial Petri dished可避免ES cell的貼附。經常和緩 的振動來保持這些細胞的懸浮。
3. 用trypan blue染色測量懸浮細胞的存活率，90%以上為可接受範圍。
4. 用pipette吸取20µL細胞懸浮液，內部約含有750個細胞，以及適當濃度的 待測化合物或溶劑或D3 assay medium在10 cm的組培用Petri dishes 蓋子上，每種濃度的待測化合物、溶劑控制組和控制組各用一個Petri dishes。
5. 把蓋子小心的放到正常上方的位置，Petri dish裡面住入5 mL PBS。
6. 培養懸浮再蓋子上的液滴三天，在潮濕的空氣以及5% CO2 和37°C的環境。
第3天
1. 準備和第0天相同的溶液。
2. 每種濃度的待測化合物、溶劑控制組和控制組各用一個Petri dishes。
3. Pipette 5 ml medium內含有適當濃度的待測化合物或溶劑或D3 assay medium到懸浮培養細胞的蓋子上，將蓋子斜放45°，讓EB小體降到底部，
使用無菌的5-mL pipet，和緩的轉移到60 mm bacterial Petri dish。
注意懸滴上的化合物濃度與Petri dish裡的必需要相同。
4. 配養懸浮EB 2天，在潮濕的空氣以及5% CO2 和37°C的環境。
第5天
1. 準備和第0天相同的溶液。
2. 使用24-well plate，每種濃度的待測化合物、溶劑控制組和控制組各備 一個。
3. 移置1 mL的待測溶液到每一個24-well組織培養孔。
4. 用剪頭的黃色tip吸取≦40µL內含一個EB，放到一個24-well孔洞中。若 用flow cytometry，EB可被放再同一個細胞培養盤(50 EB放在100-mm dish)。
5. 培養24-well plates 5天，或100-mm dish 2天，在潮濕的空氣以及 5% CO2 和37°C的環境。
(3)進行胚胎幹細胞的分化終點分析(表1) a. 形態學分析
培養第十天十，用光學顯微鏡可看見ES cell分化成會自發性收縮的心肌 細胞(圖10)。24-well每個孔洞都要做檢測，並記錄下會自發性收縮的細胞 數目及位置。經藥物處理與未處理(溶劑組)的會博動細胞比例，紀錄在EXCEL spread sheet。
b. 獨立的重複實驗
至少重複上述實驗一次，在實驗開始之前製備培養液和測試溶劑，在第二次 實驗時使用完全獨立的製備程序。
c. 細胞品管控制
在分化測試第10天，檢查溶劑測試組的培養盤，24個EB中至少要有21個分 化成會自發性收縮的心肌細胞。根據過去的數據，大約有一半的機會有100% EB 會分化成會自發性收縮的心肌細胞。約有95%的機會有21-24 wells分化成 功。比較只有D3 medium組和溶劑處理組，可以知道溶劑對EB的分化沒有影 響。最高濃度的溶劑如果可被允許使用，那麼溶劑組和純培養液的控制組就已 經被製備出來了。
d. 正反應控制組的分析品管
解凍細胞之後和測試化學物質之前，可用5-FU當成正反應品管的參考物 質。測定ES cell 的ID 50。配置0.09, 0.06, 0.04, 0.026,0.018μ
g/mL的5-FU (0.08 µg/ml optional) 來測試( 2 mg/ml 5-FU stock solution in PBS)。5-FU的ID 50應該落在0.048到0.06 µg/ml。
e. 血清的品質管制
某批號的 FCS 在分化實驗前要先被測試過，在兩個獨立的試驗上，必須 要造成至少 21 到 24 wells 含有自發性收縮的心肌細胞。下一步，正反應 控制組 5-FU 應被上述濃度重覆確認兩次。
(4)分析ES cells和3T3 cells的細胞毒性(圖9)
a. 測試ES D3細胞和3T3細胞的細胞毒性效應
1. 將3T3細胞和不加LIF的ES cells 培養在96孔盤。
2. 細胞種入兩小時後，將八種濃度的待測物質溶在培養液或適當的溶劑中，分 別加入每一個孔洞中。
3. 十天以後，進行WST-1或MTT測試[Mosmann, 1983]。
4. 用ELISA reader在420或570 nm測定吸光值，reference波長為595 nm。
b. ECVAM確定性研究的歷史資料
由四間實驗室都做兩個獨立性的實驗，來測定與評估 20 個強、弱致畸性，
和無致畸性的已知的化合物，所建立的胚胎幹細胞測試 ID50和 IC50的數值 [Scholz, 1999; Genschow, 2002] 。這些數據[Genschow, 2004]可幫
助其他實驗室建立胚胎幹細胞測試的預測性模組(PM)。
c. 分析ES cells和3T3 cells的細胞毒性(圖11) 第0天
1. 準備1x104 cells/mL存在culture medium的細胞懸浮液，細胞採用維持 性培養的D3和3T3細胞，一個維持性培養盤足夠種到96-well盤。
2. 用trypan blue染色測量懸浮細胞的存活率，90%以上為可接受範圍。
3. 使用multi-channel pipette分配50 µL medium到96-well組織培養 盤的周邊區域當成blank。
4. 其他的小孔分配1x104 cells/mL 50µL，大約每孔含有500個細胞。
5. 在潮濕的空氣以及5%CO2和37°C的環境培養兩小時，培養期間允許細胞做貼 附。
6. 製備小稀釋係數7種濃度的劑量反應物，包含與劑量反應相關的正反應控制 組與實驗組。
7. 培養兩小時後，加入150 µL 分析培養液，內含適當濃度的測試化學物質。
Blanks組加入150µl 不含化學物質的分析培以液。
8. 培養在5%CO2和37°C的環境3天。
第3天
1. 用顯微鏡檢察細胞.
2. 用multichannel pipette移走測試區(columns 3-10)和溶劑控制組 (columns 2和11)的液體，小心不要破壞下面的細胞層。
3. 加入200 µL新鮮的測試液體，每個孔洞的最終濃度和第0天的相同。
4. 培養在5%CO2和37°C的環境2天。
第5天
1. 將multichannel Pasteur-pipette 貼在底部移走測試溶液，加入200 µL新鮮的測試液體，每個孔洞的最終濃度和第0天的相同。
2. 培養在5%CO2和37°C的環境5 天。
第10天
1. 在第10天測試生長抑制的情形。
d. 顯微鏡鏡檢
1. 在相位差模式檢查。
2. 紀錄化學物質的細胞毒性所造成的型態改變，這個檢查可以排除實驗上的誤 差，顯微鏡鏡檢沒有用在分析終點的決定上。
f. 獨立的重複實驗
1. 至少重複上述實驗一次，以兩次重複的實驗增加可信度。
2. 在實驗開始之前製備培養液和測試溶劑。
3. 在第二次實驗時使用完全獨立的製備程序。
g. 細胞品管控制
細胞毒性分析一定要有正常生長的細胞，再測定生長被抑制的行為。然而在 第10天，MTT assay測定過後，檢查溶劑控制組(96-well盤columns 2和 11, 圖3)的OD550-570吸光值。
h. positive control分析的品質管制
1. 冷凍後的細胞和測試有興趣的化合物之前在分析品管上，使用
5-fluorouracil當positive control，Penicillin G當negative control。
2. Penicillin G和5-fluorouracil可從冷凍的庫存製備(2 mg/ml stock in PBS)，採兩倍的系列稀釋。
3. ES和3T3細胞都會測定IC50，5-fluorouracil的IC50範圍對為0.048 - 0.086 µg/mL，對3T3 cells為0.12 - 0.5 µg/mL。
4. 1000µg/ml的Penicillin G也同步被加入column 3測定，因為
Penicillin G被認為對增殖中的細胞沒有任何副作用，所以要確定對細胞 的存活率應沒有任何影響。
i.同步進行MTT assay
I將同一種濃度的強胚胎性的5-fluorouracil(positive control) 加到column 3測定，同時測定待測物的七種濃度。5-fluorouracil的添加 濃度來自於ES和3T3的IC50測定值，5-fluorouracil(positive control)
對ES為0.06 µg/mL，對3T3細胞為0.29 µg/mL，再這個濃度範圍，抑制率應 有20-80%。
(5). 胚胎幹細胞毒性潛能的預測 a. General remarks:
1. 胚胎幹細胞毒性潛能的預測，要有2種細胞株於三個實驗的end points數 據，分別為ID50 D3、IC50 D3和IC50 3T3。ID50 反應出抑制50%的ES cell 分化，IC50反應出抑制50% ES cells (IC50 D3)和3T3 cells (IC50 3T3) 的生長。半抑制濃度可由回推化合物濃度和細胞的反應所繪製的曲線來取 得，而不是很武斷的由有反應或無反應來做判斷。除非濃度犯影曲線非常陡 峭，且濃度梯度反應無法取得，此時宜縮小濃度梯度的間隔，來加強判斷。
b. 計算end points
顯微鏡評估ES cell differentiation assay
1. 第10天計算24-well裡，溶劑控制組收縮心肌的數目。
2. 設定這些數目為100%.
3. 計算不同濃度的待測定物質，孔洞中會收縮細胞的數目。
4. 計算溶劑控制組抑制分化的百分比。
5. 紀錄數據。
6. 使用這些數據計算ID50。
ES cells和3T3 cells的毒性分析
1. 測定空白組與基質組在OD 550-570的平均吸光值。
2. 測定沒處理試劑組的控制組平均吸光值。設定這些數值為細胞存活率100%。
3. 測定columns 4到10含有帶側化學物質的孔盤，在OD 550-570的平均吸光值。
和未被化學物質處理的細胞吸光值比較，以細胞存活的%的比例表示。
Classification
預測待測化學物質胚胎幹細胞毒性的潛能的模型(PM,表1)，被推薦以生物 統計為基礎所算出的EST的測定法表示 [Spielmann, 1997]，這個方法被 ZEBET實驗室精確的評估與廣泛的研究[Scholz, 1999]。如果functionＩ 的結果超過function II與function III，這個化合物會被歸類為沒有毒性；
如果function II的結果超過function I與function III，這個化合物會 被歸類為弱胚胎毒性；如果function III的結果超過function I與
function II，這個化合物會被歸類為強胚胎毒性。這三種end points必須 要先用已知結果的標準品測試評估過[Schoz, 1999; Genschow, 2004 ]。
表一: 預測胚胎幹細胞性的公式與分類標準(from A. Seiler, Reproductive Toxicology 18 (2004) 231)
(6)建立國內通量的胚胎幹細胞毒性測試藥物的標準操作程序
由於國內目前尚無胚胎幹細胞毒性測試藥物的標準操作程序，以供致畸 毒性測試，在實驗技術的建立與驗證上，必須先用已知結果的標準品(表 2) 測試評估過，都能符合現有以之技術的結果，再行測試新的藥品，如此才能 符合準確度與精密度的要求。
表 2：ZEBET 所建議的 16 種測試致畸強度的物質以及結果 (from ECVAM EST protocol, Spielmann et al., 1995)
結果與討論
水芫花 (Pemphis acidula)是民間的一種傳統用藥，被用來當止痛劑
(analgesic)、抑菌劑(bacteriostati)、治關節炎(antiarthritic) [Hung, 2003]、抗癌、美白、抗氧化、減肥或解毒劑。Pemphis acidula 在用法上有 許多的傳奇故事，但多沒有科學上的依據。由於使用的年齡層相當廣泛，為確定其 使用上的安全性，我們想要測定水芫花會不會有影響胚胎發育，或對幹細胞和較早 期分化的細胞產生毒性的現象，並應用所建立的平台，測定其他種類的藥物或中草 藥。
在本計畫中，我們已經建立穩定培養老鼠的胚胎幹細胞株的能力，在培養 上都能穩定的繼代幹細胞，並能成功的凍存與解凍。在建立穩定分化老鼠的胚胎 幹細胞株方面，我們形成 embryonic body 後，大約只有一半的 embryonic body 會自主分化成心肌細胞，這可能和細胞的來源原始條件，或培養技術的問 題，甚至形成 embryonic body 的細胞數目，或各種近程的培養時間都會影響，
有待未來進一步釐清，以及提升自動分化的效率。在進行胚胎幹細胞的分化終點 分析方面，分化 10 天候評估形成跳動心肌細胞的數目，因為心肌跳動必須經由 節律點驅動，若缺乏驅動起始點，即使是心肌也可能不收縮，未來或許能加入刺 激引動心跳的物質，才能進一步鑑定是否真有分化成心肌，或利用染色的方法，
看看分化指標有無出現，並比對分子指標和肉眼觀察間的差異情形，才能有效評
估兩者之間的關係。本研究發現高濃度的水沅花可以促進心肌的分化，而低濃度 的水沅花萃取液反而不利於心肌的分化，甚至引起心肌細胞的死亡，因此水沅花 和心肌間的關係值的進一步做研究。在分析 ES cells 和 3T3 cells 的細胞 毒性方面，ES cells 和 3T3 cells 在低濃度時呈現不同的現象， 3T3 cells 會有兩倍的細胞增值作用，而 ES cells 數目沒有影響。在高濃度時，胚胎幹 細胞呈現比 3T3 更耐高濃度的水沅花而得以存活。由於幹細胞對藥物相當敏 感，會以分化抑制或促進的方法呈現；但對水沅花的毒性耐受反而比體細胞大很 多，所以在生存適應上，胚胎幹細胞應是大於體細胞。
在本計劃中，我們設計以干擾老鼠胚胎幹細胞的分化和懷孕13天的老鼠胚胎纖 維母細胞或STO來當飼細胞，以預測胚胎毒性。由於人類系統在某些地方不同於老 鼠，例如番木鱉鹼對於天竺鼠、雞、猴子沒效，但只要極微量就足以使人類發生抽 搐；胰島素能讓母雞、兔子、老鼠產生畸形，但是對於人類卻不會有類似的影響。
未來若能以人類胚胎幹細胞替代老鼠胚胎幹細胞，並選用人類胚胎纖維母細胞 WI-38(lung)或Detroit 551(skin)，用人類胚胎幹細胞來建立幹細胞毒性測 試的數據，建立起hEST，將可能更能代表人類接受到化學物質時的真實反應。未來 在分析胚胎幹細胞毒性的速度上，可嘗試利用流式細胞計數儀來分析心肌分化的指 標，或建立更多種分化位置的的marker，來早期預測更多樣器官分化上的胚胎幹 細胞毒性，加強其預測的種類與效果。未來也可以所建立的方法，來測試多種濃度 與部位的Pemphis acidula抽出物或萃取物，或應用在重傳統中草藥物、食品、
毒物、環境賀爾蒙、抗氧化物質、孕婦忌服類藥物等，將能更近一步確認這些民間 常用物質或藥材的安全性。
參考文獻
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圖 1 墾丁國家公園管理局頒發的保育類植物水沅花合法採集證
圖 2 水沅花生長在海岸潮間帶邊的珊瑚礁岩地形
圖 3 水沅花的植株近照
（A） （B）
（C）
圖 4 胚胎幹細胞 ES-D3 和 STO 飼細胞共同培養，ES-D3 具有團塊的形狀，和 STO 飼細胞間具有明顯的邊界（A）40X（B）100X（B）200X
(A) (B)
(C)
圖 5 BALB/3T3 Clone A1 細胞的生長情形（A）40X（B）100X（B）200X
（A） （B）
（C） （D）
（E）
圖 6 ES-D3 胚胎幹細胞在低貼附性培養皿上，以懸滴式培養培養三天後聚集成類 胚體（embryoid body）團（A）40X（B）100X（C）200X （D）製備懸滴式培 養小滴（E）懸滴式培養胚胎幹細胞
（A） （B）
(C)
圖 7 類胚體（embryoid body）團貼附在培養皿後，幹細胞開始遷移並繼續分化 的情形（A）第 1 天（B）第 3 天(C)第 5 天
圖 8 以光學顯微鏡檢測由胚胎幹細胞分化出來，具有膊動性特性的心肌細胞
（A） （B）
圖 9 以 WST-1 分析水沅花萃取物對 3T3 細胞和胚胎幹細胞的生長影響情形與毒性 效應（A）3T3 細胞（B）胚胎幹細胞
圖10 水沅花萃取液添加到細胞培養液中，高濃度的水沅花萃取液會促進 ES-D3 胚胎幹細胞分
化成心肌細胞，低濃度責反而會抑制心肌細胞的分化。
圖11 水沅花萃取液添加到細胞培養液中，ES 和 3T3 細胞種植密度為 1*104/mL，取 100uL 種
在96 wells，培養十天後以 WST-1 進行細胞毒性試驗，結果顯示低濃度的水沅花具有增殖體細胞
的作用，高濃度卻有毒殺幹細胞和體細胞的作用。
表1 水沅花影響胚胎幹細胞分化的配置方法與結果記錄
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 水沅花萃
取液（uL） 50uL=x/20 x/21 x/22 x/23 x/24 x/25 x/26 x/27 0 0 PBS 0 50-25/20 50-25/21 50-25/22 50-25/23 50-25/24 50-25/25 50-25/26 50 uL
medium 950 950 950 950 950 950 950 950 950 1000 uL 心肌分化
率（％） 90 95 100 85 60 60 70 10 40 50 跳動強度 強 強 強 強 中 中 中 中 微弱 微弱
結構 平貼 平貼 平貼 稍立體 較立體 高聳 高聳 腔室狀 平貼 平貼
