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基因轉殖PFLP 香蕉於促進抗香蕉黃葉病之研究

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Academic year: 2021

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(1)台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 67(2):209–217 (2018) DOI: 10.6156/JTAR.201806_67(2).0006. 研究報告. 基因轉殖 PFLP 香蕉於促進抗香蕉黃葉病之研究 關政平 1 陳柏亨 2 陳涵葳 1,* 馮騰永 3 楊佐琦 4 摘要 關政平、陳柏亨、陳涵葳、馮騰永、楊佐琦。2018。基因轉殖 PFLP 香蕉於促進抗香蕉黃 葉病之研究。台灣農業研究 67(2):209–217。 由 Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) 引起之香蕉黃葉病已被認定為世界性的香蕉病害,目前仍無 化學或殺菌劑可以有效防治。為減少黃葉病所造成香蕉產業損失,利用育種方式找出抗病品種或是藉發展抗 病之基因轉殖香蕉為有效的防治手段之一。本研究旨在探討轉殖基因香蕉之抗病力,以及發展一種葉片分級 評估系統來分析 Foc 對香蕉造成的危害,作為香蕉抗黃葉病之效果評估,試驗對象包括各個具有表現 plant ferredoxin-like protein (PFLP) 基因之各香蕉轉殖株。並利用 PFLP 基因之轉殖系與非 PFLP 基因轉殖之香蕉作 為判斷是否具有抗香蕉黃葉病之效果。試驗過程同時加入等量之 Foc 孢子懸浮液與相同試驗條件感染香蕉, 以評估各處理香蕉罹病情形,並藉由 polymerase chain reaction (PCR) 技術檢測外源基因之存在與否。轉殖系 種植病土後經過不同時期至約 8 wk 左右,利用葉部黃葉率試驗評估法進行香蕉苗之抗黃葉病效果評估,並 挑選出具抗病之香蕉植株。結果顯示,MCPER-3-4 轉殖株為 7 種供試轉殖株中相對最抗黃葉病的植株。由 本研究結果顯示,PFLP 基因的存在似能提高香蕉抗黃葉病罹病率,未來將進行田間抗病的長期觀察做進一 步驗證。 關鍵詞:香蕉、香蕉黃葉病、巴拿馬病、耐病性。. 前言 香 蕉 (Musa spp.) 為 芭 蕉 科 (Musaceae) 芭 蕉屬草本植物,原產於東南亞、馬來群島及澳 洲北部,主要分布在熱帶及亞熱帶。根據農糧 署 統 計 資 料 顯 示,2016 年 台 灣 香 蕉 產 量 為 25 萬 噸, 年 產 值 達 75 億 元, 是 台 灣 重 要 的 經 濟 果樹之一。但台灣地處熱帶及亞熱帶交界處, 海島型氣候導致夏季高溫多雨,容易滋生各種 病害且不易防治。出現在台灣的香蕉病害為真 菌性的黃葉病 (Fusarium wilt)、黑星病 (banana freckle), 以 及 病 毒 性 的 嵌 紋 病 (banana mosaic disease) 和 萎 縮 病 (banana bunchy top virus) 等 (Daniells 2009)。其中,香蕉黃葉病又稱巴馬拿. * 1 2 3 4. 病 (Panama disease),其病原為尖鐮胞菌 (Fusarium oxysporum f. sp. cubenses; Foc),為土傳性病 害 (soil-borne disease),生長型態包含了小孢子 體 (microconidia)、大孢子體 (macroconidia)、厚 膜孢子體 (chlamydospores) 以及菌絲體 (mycelia) (Smith 2007)。1968 年 時 在 屏 東 縣 佳 冬 鄉 首 次 發現黃葉病例,香蕉黃葉病目前共發現有 4 個 生理小種 (races),各生理小種的宿主香蕉品種 亦不盡相同。第一生理小種主要感染「大米七」 (‘Gros Michel’)、「絲蕉」 (‘Silk’) 和「馬尼拉麻」 (‘Abaca’) 等 品 種;「稜 指 蕉」 (‘Bluggoe’) 為 第 二生理小種之主要宿主;第三生理小種感染赫 蕉系 (Heliconia);而第四生理小種則以華蕉系 (Cavendish) 等亞洲主要栽培品種為宿主,亦造. 投稿日期:2017 年 5 月 22 日;接受日期:2017 年 10 月 23 日。 通訊作者:swaychen@tari.gov.tw 農委會農業試驗所生物技術組助理研究員。台灣 台中市。 農委會農業試驗所生物技術組研究助理。台灣 台中市。 前中央研究院植物暨微生物學研究所研究員。台灣 台北市。 農委會農業試驗所生物技術組研究員兼組長。台灣 台中市。.

(2) 210. 台灣農業研究 第 67 卷 第 2 期. 成嚴重危害 (Sun & Huang 1996)。 近年來的研究顯示,由甜椒 (Capsicum annuum L.) 選殖出的植物類鐵氧化還原蛋白 (plant ferredoxin-like protein; PFLP), 在 植 物 遭 受 病 原 菌 感 染 時 所 產 生 的 過 敏 反 應 (hypersensitive response; HR) 中 扮 演 重 要 角 色 (Dayakar et al. 2003)。研究顯示,PFLP 具有促進植物受感染細 胞中活性氧化物 (reactive oxygen species; ROS) 累積和過敏反應的功能 (Dayakar et al. 2003)。 Tang et al. (2001) 的 研 究 顯 示, 於 水 稻 中 表 現 分離自甜椒的 PFLP 基因,可強化水稻轉殖系 對 Xanthomonas 的 抗 病 能 力; 而 PFLP 過 量 表 現 之 阿 拉 伯 芥 (Arabidopsis thaliana) 轉 殖 系 接 種細菌性軟腐病後,亦顯示轉殖系能提升對軟 腐病的抗性 (Su et al. 2014)。胞外分泌訊號胜肽 (extracellular secretion signal peptide; esp) 為一段 位於蛋白質 N-terminal 的胺基酸序列,具有幫 助於細胞內摺疊、修飾完畢之完整功能的蛋白 質經由囊泡分泌至胞外之功能。Outchkourov et al. (2002) 將 equistatin 蛋白基因序列 N-terminal 加上一段 α-mating factor secretion signal 序列進 行修飾,結果顯示該段修飾過的融合蛋白與未 修飾之 equistatin 蛋白比較,能提高 20 倍以上 的蛋白質累積量。內質網保留訊號 (endoplasmic reticulum retention signal) 為一段由 Lys-Asp-GluLeu 四個胺基酸分子所組成之胺基酸序列 ( 胺基 酸 序 列 縮 寫 為 KDEL),C-terminal 帶 有 KDEL 序列的蛋白質可在完成摺疊與修飾後再次運移 至內質網 (Stornaiuolo et al. 2003)。Wandelt et al.. (A). (1992) 將碗豆球蛋白基因加上 KDEL 序列,並 導入菸草及苜蓿等植物中表現,可見轉殖系中 帶有 KDEL 序列之碗豆重組球蛋白累積量為未 修飾的碗豆球蛋白的 20–100 倍,顯示 KDEL 序 列對蛋白質之運移、穩定構形及儲存具有重要 作用。 本研究嘗試建立香蕉黃葉病快速篩選流程, 並以此篩選系統評估香蕉之抗病能力。研究內 容包含:確認病原菌之病原性、接種方法與條 件、黃葉病發病指標、發病時間等,藉此探討 於香蕉中表現 PFLP 基因是否能增加轉殖系對於 黃葉病之耐性或抗性,並比較未修飾的 PFLP 蛋 白與帶有 esp 及 KDEL 序列之修飾 PFLP 蛋白對 黃葉病抗性能力之差異。. 材料方法 植物材料 本試驗所使用之基改香蕉材料為表現未修 飾 PFLP 蛋白之 MVES-3、MVES-4、MVCS-6、 MVCS-20 轉殖系,以及表現 esp 與 KDEL 修飾 之 PFLP 蛋 白 的 MCPER-3-3、MCPER-3-4 轉 殖 系 (圖 1),香蕉轉殖系植物材料均由中央研究 院馮騰永研究員所提供。轉殖載體構築方式如 Dayakar et al. (2003) 所述,轉殖系能穩定表現 pflp 外源基因,並對黃葉病原 Foc race 4 具有抗 性 (Yip et al. 2011)。本試驗另以 ‘Gros Michelc’ 作為未轉殖 (WT) 之對照品系。本試驗所使用 的香蕉苗均經組培繼代後,挑選大小一致之瓶. P35S. (B). Pflp. esp P35S. TNOS. KDEL Pflp. TNOS. 圖 1. (A) Plant ferredoxin-like protein (PFLP) 與 (B) MCPER 重組載體構築示意圖。esp 為胞外分泌訊號胜肽; KDEL 為內質網保留訊號。 Fig. 1. Construction of the recombinant plasmid (A) plant ferredoxin-like protein (PFLP) and (B) MCPER. esp, extra cellular secretion signal; and KDEL, endoplasmic reticulum retention signal..

(3) 211. 轉殖香蕉對黃葉病抗性評估. 苗, 培 養 於 B3 固 態 培 養 基 (1/2 MS salts, 340 mg L-1 NaH2PO4·H2O, 160 mg L-1 adenine sulfate, 3% sucrose, pH 5.5, 0.7% agar),25℃ ± 2℃、12 h 光照環境,待培植體發根後出瓶,小苗定植後置 於隔離溫室馴化。試驗前蕉苗均以聚合酶連鎖 反應 (polymerase chain reaction; PCR) 檢測是否 帶有外源基因,植物基因體 DNA 的萃取是使用 Plant Genomic DNA Purification Kit (PROTECH, Taiwan),萃取方法依原廠手冊建議。確認帶有 外源基因之香蕉轉殖系,於出瓶後 5 wk 後挑選 整齊一致的植株進行後續接種試驗。. 接種方法與條件 Foc 接種試驗參考 Twizeyimana et al. (2007) 及 Tripathi et al. (2008) 的接種方式,Foc 病原菌 (TBRI-3) 則取自財團法人台灣香蕉研究所 (Taiwan Banana Research Institute; TBRI)。Foc 之 繼 代培養使用 DifcoTM Potato Dextrose Agar (Difco Laboratories, MI) 培養基,栽培介質培養方式為: Foc 菌塊於 DifcoTM Potato Dextrose Broth (Difco Laboratories, MI) 液態搖盪培養 1 wk (28℃, 800× g) 後以 Cheese cloth 過濾去除菌絲,並搜集過濾 後孢子液。利用離心法去除培養基。使用無菌 水回溶孢子,並利用血球計數器計算孢子濃度, 調整孢子液至試驗濃度 106 spores mL-1。所有栽 培介質皆經高溫高壓滅菌處理 (121℃, 20 min), 混合比例為根基旺:玉米粉:Foc 孢子濃度 106 spores mL-1 = 2,500:131:500 (mL) 後密封,於 28℃培養 1 mo。將培養 1 mo 之菌土:無菌根基 旺 = 1:3 混合後使用。接種時,將香蕉幼苗移 植至栽培介質中,培養於溫室 (溫度 25–28℃), 每個處理之香蕉品種為 5 株,並含有未處理之 對照組,重複試驗至少 3 次。為避免 Foc 於土壤 中的含量因環境因素或隨時間逐漸減少,於香蕉 接種黃葉病菌 7 d 後,每週於栽培介質中加入一 次 20 mL pot-1 之 107 spores mL-1 之 Foc 懸浮液, 並在 1 wk 內澆灌適量的逆滲透 (reverse osmosis; RO) 水 3 次。. 黃葉病之病徵判斷 本試驗所使用的香蕉黃葉病的病徵判斷方 法,包括黃葉率、罹病指數以及假莖褐化率, 判定方式分述如下:. 黃葉率 =. 葉片黃化數 × 100% 全株葉片數. 罹病嚴重程度 (disease severity index; DSI), 判定標準與分級如表 1 所列。 假莖褐化率 (corm discoloration %) =. 假莖切面褐化面積 × 100% 假莖切面總面積. 香蕉假莖褐化率材料取樣自試驗 54 d 後之蕉 苗 假 莖 基 部, 拍 攝 假 莖 縱 剖 面 照 片, 並 利 用 Image J 軟體 (http://imagej.nih.gov/ij/) 分析切 面總面積與褐化面積。. 結果與討論 接種用香蕉轉殖株分子驗證 以 PCR 檢 測 擬 轉 殖 株 MVES-3、MVES-4、 MVES-7、MVCS-6、MVCS-20 以及 MCPER-3-3、 MCPER-3-4 基因組是否帶有外源基因,表 2 為 檢測外源基因 P35S::pflp::Tnos 及 P35S::MCPER::Tnos 所使用的引子對。結果顯示,圖 2A 中 MVES3、MVES-4、MVES-7 以及 MVCS-6、MCVS-20 轉 殖 系, 皆 有 545 bp 之 目 標 基 因 條 帶 檢 出。 圖 2B 為 MCPER-3-3 與 MCPER-3-4, 亦 檢 測 出 844 bp 之目標片段,“W” 為不帶有模板 DNA 之 空 白 試 驗 對 照 組;“–” 為 未 轉 殖 ‘Gros Michel’ 香 蕉 負 對 照 組;“+” 則 為 帶 有 PFLP 基 因 之 質 體 DNA 正處理組。結果顯示轉殖株 MVES-3、 MVES-4、MVES-7、MVCS-6、MVCS-20、 MCPER-3-3、MCPER-3-4 之 PCR 結果與正處理 表 1. 黃葉病之罹病指標說明。 Table 1. Disease severity index (DSI) of Fusarium wilt disease. Score. Appearance. 0. No visible symptoms. 1. 0–1/4 leaves wilted or yellowed. 2. 1/4–1/3 leaves wilted or yellowed. 3. 1/3–1/2 leaves wilted or yellowed. 4. 1/2–3/4 leaves wilted or yellowed. 5. All leaves wilted/plant dead.

(4) 212. 台灣農業研究 第 67 卷 第 2 期. 表 2. 聚合酶連鎖反應使用的引子對序列與產物片段大小。 Table 2. Primer sequence and target size of polymerase chain reaction. Construct. Primer seq.. Target size (bp). P35S::pflp::Tnos. MVES-3, MVES-4, MVES-7, MVCS-6, MVCS-20. Event. 5’-aagggatgacgcacaatcccactatccttc-3’ 5’-cgagctcgttagcccacgagttctgcttct3’. 545. P35S::MCPER::Tnos. MCPER-3-3, MCPER-3-4. 5’-aagggatgacgcacaatcccactatccttc-3’ 5’-cccagtcacgacgttgtaaa-3’. 844. (A). MVES M. 3. 4. (B). MVCS 7. 6. 20 W. -. +. MCPER M. 545 bp. 3-3 3-4 W. -. +. 844 bp. 圖 2. 箭號標示處為目標片段大小。Lane M 為 marker,Lane W 為沒有加入 DNA 的空白對照組,Lane – 為負 控制組的未轉殖 ‘Gros Michel’ 基因組 DNA,Lane + 則為帶有 pflp 基因片段的正控制組,轉殖系 MVES-3、 MVES-4、MVES-7、MVCS-6、MVCS-20、MCPER-3-3、MCPER-3-4 依序標示於圖上。 Fig. 2. Foreign gene detection of transgenic banana lines pflp (A) and MCPER (B). Arrows showed the target size. Lane M, DNA ladder marker; Lane W, the blank control without any DNA templates in the PCR reactions; Lane “–”: non-transgenic ‘Gros Michel’ gDNA as negative control; and Lane “+”: plasmid DNA with pflp gene fragment as positive control. Lane 3: MVES-3; Lane 4: MVES-4; Lane 7: MVES-7; Lane 6: MVCS-6; Lane 20: MVCS-20; Lane 3-3: MCPER-3-3; and Lane 3-4: MCPER-3-4.. 組具有相同片段大小條帶,確定參試之香蕉苗 均帶有目標基因。. 香蕉轉殖株對黃葉病之抗性檢測 參試香蕉品系移植入帶有黃葉病病原菌之 土壤中進行接種,以評估各品系香蕉對於黃葉 病之抗性。圖 3 為接種後 54 d 後之植株於溫室 生長情形,轉殖系 MCPER-3-4 植株不具明顯病 徵,且生長狀態良好,其餘香蕉植株除生長較 緩慢、植株生長勢較弱外,亦出現葉片黃化、 萎凋等情形。圖 4A 為調查香蕉各處理組的葉 片 黃 化 率。 結 果 顯 示,MCPER-3-4 香 蕉 植 株 之葉片黃化率 10%,遠低於其他轉殖系,且已 達 5% 顯著水準,具有顯著差異。感病率第二 低 的 則 為 MCPER-3-3 轉 殖 株 (黃 化 率 30%), 但與其他轉殖系均未達顯著水準。另以罹病嚴 重 程 度 (Disease severity index; DSI) 統 計 感 病. 率, 圖 4B 顯 示 MCPER-3-3 於 接 種 後 32 d DSI 開 始 輕 微 上 升, 接 種 後 46 d DSI 開 始 明 顯 上 升;MCPER-3-4 於 接 種 後 37 d 後 檢 測 到 DSI 的 上 升, 於 46 d 至 54 d 期 間 則 無 明 顯 DSI 變 化,其餘轉殖株則於接種後 32 d 開始出現大量 病徵,致 DSI 急遽上升,DSI 檢測結果與葉片 黃化比率相符。比較兩者並經檢測感病情形, 最 輕 微 者 皆 為 轉 殖 系 MCPER-3-4。 檢 測 香 蕉 假莖之褐化率,比較接種處理組之假莖縱切面 (圖 5),顯示 MCPER-3-4 具有較低之假莖褐化 率 (30.22%), 其 餘 依 次 為 MVCS-6 (33.68%)、 MVES-4 (35.42%)、MCPER-3-3 (39.66%)、 MVES-7 (40.43%)、V215 (41.44%)、MVES3 (53.77%), 假 莖 褐 化 率 最 高 者 為 MVCS-20 (64.52%) (表 3)。 PFLP 蛋白參與光合作用,其 N-terminal 具 有可使 PFLP 蛋白質運移至葉綠體之訊號胜肽。.

(5) 213. 轉殖香蕉對黃葉病抗性評估. ‘Gros Michel’. MVES-7. MVES-3. MVCS-20. MVES-4. MCPER-3-3. MVCS-6. MCPER-3-4. 圖 3. 參試品種對 Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) 耐受性評估。以 ‘Gros Michel’作為未轉殖對照品系, 與 轉 殖 系 MVES-3、MVES-4、MVES-7、MVCS-6、MVCS-20、MCPER-3-3、MCPER-3-4 皆 於 接 種 後 54 d 進行照片拍攝。 Fig. 3. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) disease tolerance of different banana lines. Non-transgenic ‘Gros Michel’ and transgenic lines MVES-3, MVES-4, MVES-7, MVCS-6, MVCS-20, MCPER-3-3, and MCPER-3-4 were inoculated in greenhouse condition. Photos were taken at 54 d post inoculation.. 表 3. 香 蕉 轉 殖 系 與 未 轉 殖 品 系 接 種 Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) 後假莖褐化率。 Table 3. Discoloration level of Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) inoculated non-transgenic and transgenic banana lines. Line. z. Discoloration (%)z. ‘Gros Michel’ (WT). 41.44 ± 25.84 abc. MVES-3. 53.77 ± 14.00 ab. MVES-4. 35.42 ± 17.36 bc. MVES-7. 40.43 ± 23.18 bc. MVCS-6. 33.68 ± 8.36 bc. MVCS-20. 64.52 ± 25.00 a. MCPER-3-3. 39.66 ± 8.61 bc. MCPER-3-4. 30.22 ± 11.99 c. Discolored region and total area of corm were determined by Image J. Percentage of discolored area = (discolored region/ total corm area) × 100%. Mean ± standard error (n = 5). Means followed by the same letter within each column are not significantly differentat 5% level by least significant difference (LSD) test.. 前 人 研 究 結 果 顯 示, 去 除 PFLP N-terminal 之 葉綠體訊號胜肽,能夠於細胞質中檢測到大量 PFLP 之累積,並且同樣地具有抗菌效果 (Huang et al. 2006)。Lin et al. (2010) 分 別 構 築 去 除 PFLP N-terminal 葉 綠 體 訊 號 胜 肽 之 PFLP 過 量 表現質體 (d-pflp);帶有葉綠體訊號胜肽之 PFLP 過量表現質體 (csp-pflp);以及 N-terminal 帶有 胞外分泌訊號胜肽之 PFLP 過量表現質體 (esppflp),再將上述三質體透過農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) 基因轉殖分別導入阿拉伯芥基因 組中。結果顯示,esp-pflp 阿拉伯芥轉殖株於接 種 Ralstonia solanacearum 病原菌後,其罹病指 標低於未轉殖株及其他轉殖株,且過敏反應檢 測結果亦顯示 esp-pflp 轉殖株具有較高之過敏反 應。經由葉片黃化率和罹病嚴重指數之統計結 果顯示,MCPER-3-4 轉殖株對黃葉病有明顯的 抗性,具有成為抗黃葉病之香蕉品種的潛力, 其次為由同一轉殖母株分離之 MCPER-3-3 轉殖.

(6) 214. 台灣農業研究 第 67 卷 第 2 期. 100. 5. (A). MVES-4 MVES-7 MVCS-6. 3.5 50. DSI. Chlorosis (%). MVES-3. 4. 75. *. MCPER-3-3. 3. MCPER-3-4. 2.5. 1.5 1. S6 VC M. M. VE. S7. S4 VE. M. S3 VE. M. s. M. ic. he. l’. 0. ro. MVCS-20. 2. 25. ‘G. (B). ‘Gros Michel’. 4.5. 20. M. VC. -3. -3. S-. P. C. M. ER. -4. -3. P. C. M. ER. 0.5 0. 0. Transgenic and non transgenic lines of banana. 32. 39. 46. 54. DPI. 圖 4. 各轉殖系及未轉殖香蕉黃葉率與罹病嚴重程度。(A) 各品系香蕉植株黃葉率 (54 dpi)。資料經由 ANOVA 和 Tukey’s test 計算後具顯著性差異則標示 * (α = 0.05),試驗進行 5 重複;(B) 各品系香蕉罹病嚴重 程度 (Disease severity index; DSI),調查於接種後第 0、32、39、46 與 54 d。 Fig. 4. Percentage of chlorosis leaves and disease severity index of different transgenic and non transgenic line of bananas. (A) Percentage of yellowing leaves per seedlings were estimated at 54 dpi. Data were analyzed by one-way ANOVA and Tukey’s test. Group with star represents a statistically significant difference among them (α = 0.05); (B) Disease severity index (DSI) of different transgenic and non-transgenic line of bananas were estimated at 0, 32, 39, 46, and 54 d.. 株。另 MVES-4 和 MVCS-6 轉殖株接種後 54 d 之葉片黃化率分別為 MVES-4 57%、MVCS-6 55%,略低於未轉殖株但無顯著差異。由此顯 示,於 PFLP 基因的 N-terminal 及 C-terminal 分 別 接 上 esp 和 KDEL 序 列 之 CPER 轉 殖 系, 確 實提高了轉殖株的抗病性,且與未轉殖株具顯 著差異;然而 CPER 轉殖系之高抗病能力是否 與 PFLP 蛋白質的穩定度和表現量有關,仍須 進一步的比較 PFLP 轉殖系與 CREP 轉殖系中 PFLP 基因表現量及蛋白質含量與轉殖株感病性 之相關性。假莖褐化率檢測結果與葉片黃化率 及罹病嚴重指數不符,假莖褐化率最低之轉殖 株為 MCPER-3-4 (30.22%),其次為 MVCS-6 轉 殖株 (33.68%)。然而,葉片黃化率最低者,同 樣 為 MCPER-3-4, 其 次 卻 為 MCPER-3-3 轉 殖 株,顯示假莖褐化率與葉片黃化率兩檢測方法 之結果不具直接相關性。推測可能原因,為檢 測樣本數量不足。另也必須延長接種時間,讓. 受黃葉病感染之香蕉植株,其假莖褐化情形能 夠有足夠時間反應至地上部的葉片上,使得葉 片黃化與假莖褐化出現較為一致的結果。. 結論 利用接種黃葉病病原篩選轉殖系香蕉試驗, 同時比較基因轉殖香蕉與非轉殖香蕉,綜合使 用黃葉率、罹病率分析及假莖褐化率等做評估, 顯示具表現 PFLP 香蕉,與帶有 esp-pflp 融合蛋 白之轉殖系,具有較佳之抗黃葉病能力,未來 仍將以田間抗病的長期觀察做進一步驗證。. 誌謝 本研究承蒙行政院農業委員會科技計畫 (103–104 農科-6.3.2-農-C1) 經費支援,以及中 研院馮騰永研究員提供香蕉轉殖系作為試驗材 料,謹此致謝。.

(7) 215. 轉殖香蕉對黃葉病抗性評估. Mock. Foc inoculated. ‘Gros Michel’. MVES-3. MVES-4. MVES-7. MVCS-6. MVCS-20. MCPER-3-3. MCPER-3-4. 圖 5. 不同香蕉品系假莖縱切檢測。以 ‘Gros Michel’ 作為未轉殖對照品系,與轉殖系 MVES-3、MVES-4、 MVES-7、MVCS-6、MVCS-20、MCPER-3-3、MCPER-3-4,分別接種沒有 Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) 孢子的純水 (mock),與孢子懸浮液,並於接種後 54 d 進行照片拍攝。 Fig. 5. The symptoms of Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) inoculation in different banana lines. Non-transgenic ‘Gros Michel’ and transgenic lines MVES-3, MVES-4, MVES-7, MVCS-6, MVCS-20, MCPER-3-3, and MCPER-3-4 were inoculated with Foc free water (mock) or Foc spore suspension in greenhouse condition. Images of cross-section were recorded at 54 d post inoculation..

(8) 216. 台灣農業研究 第 67 卷 第 2 期. 引用文獻 Daniells, J. W. 2009. Global banana disease management-Getting serious with sustainability and food security. Acta Hort. 828:411–416. Dayakar, B. V., H. J. Lin, C. H. Chen, M. J. Ger, B. H. Lee, C. H. Pai, D. Chow, H. E. Huang, S. Y. Hwang, M. C. Chung, and T. Y. Feng. 2003. Ferredoxin from sweet pepper (Capsicum annuum L.) intensifying harpin (PSS)-mediated hypersensitive response shows an enhanced production of active oxygen species (AOS). Plant Mol. Biol. 51:913–924. Huang, H. E., M. J. Ger, C. Y. Chen, M. K. Yip, M. C. Chung, and T. Y. Feng. 2006. Plant ferredoxin-like protein (PFLP) exhibits an anti-microbial ability against soft-rot pathogen Erwinia carotovora subsp. carotovora in vitro and in vivo. Plant Sci. 171:17– 23. Lin, Y. H., H. E. Huang, F. S. Wu, M. J. Ger, P. L. Liao, Y. R. Chen, K. C. Tzeng, and T. Y. Feng. 2010. Plant ferredoxin-like protein (PFLP) outside chloroplasts in Arabidopsis enhances disease resistance against bacterial pathogens. Plant Sci. 179:450–458. Outchkourov, N. S., W. J. Stiekema, and M. A. Jongsma. 2002. Optimization of the expression of equistatin in Pichia pastoris. Protein Exp. Purif. 24:18–24. Smith, S. N. 2007. An overview of ecological and habitat aspects in the genus Fusarium with special emphasis on the soil borne pathogenic forms. Plant Pathol. Bull. 16:97–120. Stornaiuolo, M., L. V. Lotti, N. Borgese, M. R. Torrisi, G. Mottola, G. Martire, and S. Bonatti. 2003. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum intermediate. compartment and Golgi complex. Mol. Biol. Cell 14:889–902. Sun, S. G. and J. W. Huang. 1996. Plant Disease Caused by Fusarium in Taiwan. Shih Wei Press. Taichung, Taiwan. 170 pp. (in Chinese) Su, Y. H., C. Y. Hong, and Y. H. Lin. 2014. Plant ferredoxin-like protein enhances resistance to bacterial soft rot disease through PAMP-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Eur. J. Plant Pathol. 140:377–384. Tang, K., X. Sun, Q. Hu, A. Wu, C. H. Lin, H. J. Lin, R. M. Twyman, P. Christou, and T. Feng. 2001. Transgenic rice plants expressing the ferredoxin-like protein (AP1) from sweet pepper show enhanced resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Plant Sci. 160:1035–1042. Tripathi, L., J. Odipio, J. N. Tripathi, and G. Tusiime. 2008. A rapid technique for screening banana cultivars for resistance to Xanthomonas wilt. Eur. J. Plant Pathol. 121:9–19. Twizeyimana, M., P. S. Ojiambo, A. Tenkouano, T. Ikotun, and R. Bandyopadhyay. 2007. Rapid screening of Musa species for resistance to black leaf streak using in vitro plantlets in tubes and detached leaves. Plant Dis. 91:308–314. Wandelt, C. I., M. R. I. Khan, S. Craig, H. E. Schroeder, D. Spencer, and T. J. V. Higgins. 1992. Vicilin with carboxy-terminal KDEL is retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants. Plant J. 2:181–192. Yip, M. K., S. W. Lee, K. C. Su, Y. H. Lin, T. Y. Chen, and T. Y. Feng. 2011. An easy and efficient protocol in the production of pflp transgenic banana against Fusarium wilt. Plant Biotechnol. Rep. 5:245–254..

(9) 轉殖香蕉對黃葉病抗性評估. Improving Resistance to Fusarium Wilt Disease in PFLP Transgenic Bananas Cheng-Ping Kuan1, Po-Heng Chen2, Han-Wei Chen1,*, Teng-Yung Feng3, and Tso-Chi Yang4. Abstract Kuan, C. P., P. H. Chen, H. W. Chen, T. Y. Feng, and T. C. Yang. 2018. Improving resistance to Fusarium wilt disease in PFLP transgenic bananas. J. Taiwan Agric. Res. 67(2):209–217.. Fusarium wilt disease of banana (Panama disease), caused by Fusarium oxysporium f. sp. cubense (Foc), is considered as one of the most important banana diseases in the world and no chemical control or fungicides are available so far. To decrease the damages of Fusarium wilt on banana industry, planting resistant cultivars and breeding the transgenic bananas expressing resistant genes against pathogens are best strategy in the Foc-infected field. Here, we developed a foliar rating system to assess the disease-development of Fusarium wilt in several transgenic banana plants expressing the ferredoxin-like protein (PFLP) gene. The responses of the PFLP transgenic and non-transgenic banana cultivars were evaluated on their susceptibility or tolerance against the pathogen in pots in the greenhouse. The PFLP gene in transgenic bananas were monitored by PCR to confirm its existence. Several transgenic lines of plantlets were challenged by the infection with the conidia suspension of Foc. Leaves yellowing or wilting symptoms of banana seedlings appeared over 8 weeks after Foc-inoculation. The results showed that the ‘MCPER3-4’ was the more resistant line among seven transgenic lines. This fast and space-effective bioassay may be used to evaluate as screening of Musa spp. against the disease. Key words: Banana, Fusarium wilt, Panama disease, Tolerance.. Received: May 22, 2017; Accepted: October 23, 2017. * Corresponding author, e-mail: swaychen@tari.gov.tw 1 Assistant Research Fellows, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 2 Research Assistant, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 3 Former Research Fellow, Institute of Plant and Microbial Biology, Academia Sinica, Taipei, Taiwan, ROC. 4 Research Fellow and Director, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC.. 217.

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參考文獻

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