運用大量表現與雙重突變之策略探討阿拉伯芥BPM 基因的功能

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(1)國立屏東教育大學化學生物系研究所 Graduate Institute of Chemical Biology National Pingtung University of Education 碩士論文 Master Thesis 運用大量表現與雙重突變之策略探討阿拉伯芥 BPM 基因的功能 Functional analysis of Arabidopsis BPM genes by over-expression and double mutation. 指導教授：黃鐘慶博士 (Dr. Jong-Chin Huang) 研究生：吳佳娟. (Chia-Chuan Wu). 中華民國一百零二年一月 January, 2013.

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(3) 目錄摘要..................................................................................................3 文獻探討 ..........................................................................................5 開花植物的生殖與花粉的發育 ...............................................5 泛素蛋白質降解系統與BTB/POZ domain 蛋白質之關聯 .....6 材料與方法 ......................................................................................11 阿拉伯芥之種植條件與材料收集 ...........................................11 質體DNA的萃取 ......................................................................11 聚合酶鏈鎖反應(PCR).............................................................11 TA cloning ................................................................................12 DNA回收與純化 ......................................................................12 PCR產物的純化與回收 ...........................................................12 重組DNA之構築 ......................................................................13 勝任細胞的製作.......................................................................13 轉形(transformation).................................................................13 農桿菌勝任細胞的製作 ...........................................................14 農桿菌轉形 ..............................................................................14 阿拉伯芥之基因轉殖 ...............................................................14 阿拉伯芥轉殖株的篩選 ...........................................................14 植物基因組DNA的萃取(genomic DNA extraction) ................15 1.

(4) RNA的萃取 ................................................................................15 RNA於電泳膠片(denatured gel)的觀察 .....................................15 RNA反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR).....................................16 實驗結果 ................................................................................................17 建立鑑定並分析基因大量表現之植株........................................17 阿拉伯芥T-DNA插入突變株鑑定與雙重突變株之建立 ............17 討論........................................................................................................19 實驗圖表 ................................................................................................20 附錄........................................................................................................33 參考文獻 ................................................................................................37. 2.

(5) 中文摘要有性生殖是藉由精卵結合而得以完成，在開花植物中，花粉會藉由不同方式散播並附著於柱頭上，此時花粉管便會開始萌發生長以啟動授粉的程序，故開花植物的繁衍乃是藉由花粉－也就是雄配子體（male gametophyte）的傳播而進行。花粉在整個授粉過程中有著產生精細胞及將精細胞傳送至胚囊以完成雙重授精（double fertilization）之重要任務，所以花粉的發育對於開花植物的有性生殖是很重要的。細胞內蛋白質降解具有不同之機制，近年發現某些含有BTB/POZ 功能區之蛋白質會與跟CUL3 產生交互作用，以單一蛋白質形成另一種不同SCF(Skp1–Cul1–F-box) 以及ECS(ElonginC–Cul2–SOCS box) complex 形式的cullin-based ubiquitin ligase，進而參與Ub/26S proteasome分解蛋白質之途徑以調控發育過程。在實驗室前人針對 AtBPM2基因的突變株(SALK_121270)鑑定分析實驗中，發現阿拉伯芥AtBPM2單一基因突變並未對阿拉伯芥表現型產生顯著影響，突變株仍然可以正常繁衍後代，意味著可能有其它基因互補AtBPM2基因的功能。由於AtBPM2 與AtBPM3在花粉的精細胞有相對高的表現量，因此本研究想藉傳統遺傳學方式，用人工授粉與自花授粉方式，使植株同時帶有AtBPM2 與AtBPM3兩基因突變，以雙重突變的方式觀察當 AtBPM2 與AtBPM3兩基因皆突變後是否會對花粉發育或功能產生影響。同時，再以大量表現之方式將AtBPM2基因於其他部位表現，觀察是否有任何表現型的改變，來推測其可能的功能。結果發現，大量表現AtBPM2基因，導致早開花之現象出現，而雙重突變的結果尚須進一步鑑定。. 關鍵字 : 花粉、雄配子體、蛋白質降解、雙重突變. 3.

(6) Abstract Pollen grain is the male gametophyte of flowing plant and is necessary for successful double fertilization during plant sexual reproduction. Therefore, pollen development is very critical in plant. A cDNA (LLBTB) cloned from lily pollen shows high identity to the Arabidopsis gene family (AtBPM1~6) whose function is unclear. Both deduced amino acid sequences contain BTB/POZ domain which plays important role in protein-protein interaction. AtBPM2 and AtBPM3 express highly in sperm cells. It has been suggested that proteins containing BTB/POZ domain will be involved in protein degradation mechanism of 26S proteasome by interacting with CUL3 protein to form an E3 ubiquitin ligase. Specific protein substrate will be ubiquitined and degraded in 26S proteasome. To investigate the possible function of AtBPM2 and AtBPM3 in sperm cells, overexpression and double mutation strategies are taken to analyze both genes’ function. AtBPM2 overexpression plants show early flowering phenotype, and the result of double mutation (AtBPM2 and AtBPM3) is not confirmed yet.. Keyword : Pollen、male gametophyte 、ubiquitin–proteasome system、double mutation. 4.

(7) 文獻探討開花植物的生殖與花粉的發育花是植物的生殖器官，典型的花有萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊四個部份，雄蕊包括花絲和花藥，花藥內含大量的花粉。雌蕊包括柱頭、花柱、子房，子房內有一或多個胚珠，胚珠內則有卵核，有性生殖是藉由精卵結合而得以完成，在開花植物中，花粉會藉由不同方式散播並附著於柱頭上，此時花粉管便會開始萌發生長以啟動授粉的程序，故開花植物的繁衍乃是藉由花粉－也就是雄配子體（male gametophyte）的傳播而進行。在整個授粉過程中，花粉的生殖細胞（generative cell）會分裂成兩個精細胞（sperm cell），並藉由花粉管的輸送進入胚囊（embryo sac）。一個精細胞與卵細胞進行受精作用（fertilization）形成二套體的接合子（diploid zygote），而另一個精細胞則與胚乳母細胞（endosperm mother cell）內的極核形成三套體（triploid）形式的營養組織。因此，花粉在整個授粉過程中有著產生精細胞及將精細胞傳送至胚囊以完成雙重授精（double fertilization）之重要任務，所以花粉的發育對於開花植物的有性生殖是很重要的。花粉發育的過程如附錄一所示(McCormick 2004)，早期的孢原組織（archesporial cell）在花藥中轉變成花粉母細胞（pollen mother cell），花粉母細胞會進行減數分裂形成具單套體小孢子（haploid microspore）之四分體（tetrad）。小孢子發育期間，花藥藥壁層會發生劇烈變化，尤其是絨氈層（tapetum）。由於絨氈層細胞分泌的創痕糖分解酵素（callase）到藥囊腔中，使環繞在小孢子的創痕糖壁分解，成熟之小孢子因而釋出。小孢子變大而且經歷第一次有絲分裂之後，會形成大小兩個不同的細胞，其中形狀比較小的生殖細胞(generative cell)被包裹在大的營養細胞(vegetative cell)中，營養細胞最後會形成花粉管，生殖細胞會再經過第二次有絲分裂形成兩個精細胞，而依有絲分裂發生的時間，可以分為雙細胞型及三細胞型。約70％的植物，會於花粉管從柱頭向胚珠延伸之際才開始進行第二次有絲分裂而形成兩個精細胞，如百合科即屬於雙細胞型的花粉。而部份的植物會在花粉成熟後且尚未萌發之前即進行第二次的有絲分裂，如十字花科（Cruciferae）及禾本科（Gramineae）等。花粉繼續發育，最後進行自發性的脫水乾燥而成熟(Bedinger 1992; Mascarenhas 1993; McCormick 1993; McCormick 2004) 花粉發育的過程受到許多基因的調控。花粉基因依表達時期的不同大致上可區分為兩類(Mascarenhas, 1990)：一類為早期基因（early gene），始於小孢子形成之前的減數分裂，其mRNA 的累積量至有絲分裂達到高峰，隨著花粉的成熟而遞減； 5.

(8) 另一類為晚期基因（late gene），其mRNA 於第一次有絲分裂後開始累積，隨著花粉的成熟而累積量遞增。早期基因多表現於發育中的小孢子，其功能可能與花粉壁的形成或澱粉的累積有關；而晚期基因的功能被認為可能與花粉萌發及花粉管發育有關(McCormick 1993)。近年來由於阿拉伯芥及水稻等模式植物基因組相繼完成核酸定序，再加上許多新技術的興起，以往許多不易進行的實驗皆可付諸實行。藉由 microarray、 SAGE 或蛋白質體學技術等方式分析比較阿拉伯芥及水稻花粉與其他器官的不同，得到許多以往未知的花粉基因表達及蛋白質資料 (Becker et al., 2003;Honys and Twell, 2003; Lee and Lee, 2003; Holmes-Davis et al., 2005; Noir et al., 2005; Dai et al.,2006)。. 泛素蛋白質降解系統 (ubiquitin proteasome system) 與 BTB/POZ domain 蛋白質之關聯. BMC Biochem. 2007; 8(Suppl 1): S4. 蛋白質降解系統，就是泛素(ubiquitin)像一種標籤可以去貼在要摧毀的蛋白質上面最後再送入蛋白質分解系統(26S proteasome)中將受損的蛋白質處理回收及再循環利用，主要是由四個步驟形成一個循環。主角泛素(ub)是一種由76種胺基酸所組成的蛋白質，可以經由三種酵素的幫忙將泛素接到要摧毀的蛋白質上面，這三種酵素分別是E1(activated enzyme)，E2(conjugating enzyme)，E3 ligase。首先E1經由ATP 水解得到能量，E1上的半胱胺酸(cysteine)會和泛素(ub)C端上的甘胺酸(glycine)接合 6.

(9) 形成一個硫酯鍵(thioester)，泛素就會被活化。第二個步驟E1把泛素傳到E2上之後， E2扮演一個催化劑的功能，可以去催化和目標蛋白質的結合。第三個步驟再交棒給 E3，由E3去辨識要摧毀的蛋白質，最後再把要摧毀的蛋白質送入蛋白質分解體(26S proteasome )中進行分解，回收再利用(Moon 2004)。. BTB (broad-complex，tramtrack以及bric à brac) domain( Zollman et al., 1994)又稱為POZ (poxvirus and zinc finger) domain(Bardwell and Treisman 1994)，發現在真核和一些病毒中，是一個高度保留的蛋白質，長度有116胺基酸的長度可以折疊為5個β -sheets and 3個α-helices (Zollman et al., 1994; Ahmad et al., 1998)，屬於進行蛋白質交互作用的一種功能區，結構分析顯示BTB/POZ domain應會經由厭水區域所產生的結合力量而以二聚物（dimer）的形式存在(Chen et al., 1995; Ahmad et al.,1998) 。 BTB/POZ domain蛋白質以多種形式存在於生物體中(Aravind and Koonin, 1999)，基本上分別為Kv ion channel (T1 domain)、BTB-C2H2 zinc finger (BTB-ZF)、BTB-kelch 以及單獨只有BTB/POZ domain或是與另一個或多個domain並存的形式，而這些不同形式的蛋白質分別具有不同的功能，例如離子傳導(Kreusch et al., 1998)，基因轉錄之調控(Melnick et al., 2000)，細胞骨架排列(Bomont et al., 2000) 以及細胞凋亡 (apoptosis)(Fu et al., 2003)等。近年來一些發現指出BTB/POZ domain會以adaptor的形式跟CUL3產生交互作用，而在此蛋白質上的另一個domain則會與受質產生交互作用，以單一蛋白質形成另一種不同於SCF以及ECScomplex形式的cullin-based ubiquitin ligase（如上圖；from Pintard et al., 2003），進而參與Ub/26S proteasome分解蛋白質之途徑以調控發育過程 (Furukawa et al., 2003; Geyer et al.,2003; Pintard et al., 2003; Xu et al., 2003)。例如，在C. elegans的胚胎中，MEI-1 蛋白質降解是由減數分裂轉換成有絲分裂所必須的過程，亦即在減數分裂後MEI-1 假如無法正常降解，會造成紡錘絲組合失常，因而影響有絲分裂。藉由RNA interference方式，使CUL3 缺失，會影響早期的發育，結果會使得 microfilament(微絲) 和microtubule(微管)組合異常(Kurz et al., 2002). MEI-1 降解與CUL3 的neddylation及deneddylation有關 (Pintard et al., 2003)，neddylation和deneddylation會形成一個動態平衡，來調控Cullin 蛋白質的穩定性，neddylation簡單來說就是Cullin經由Nedd8蛋白質修飾，結果會使得Cullin活性增加，但是同時也會變的比較不穩定，而走入deneddylation，來進行 Nedd8蛋白質的代謝，deneddylation的過程主要是由CSN(COP9 signalosome)，移除 7.

(10) Nedd8，若CSN功能異常，Cullin就會因為neddylation所造成的不穩定而走入降解的路徑且會經由MEL-26 蛋白質C端BTB/POZ domain連結CUL3 及N端MATH domain 連結MEI-1 的形式進行ubiquitination (Furukawa et al., 2003; Pintard et al., 2003;Xu et al., 2003)。在第一個例子(C. elegans)被報導後，相關研究亦陸續出爐。相關研究大致可分類如下ㄧ、神經傳導相關 AMPARs 及KARs 為神經突觸訊息傳導中相當重要的接受體，線蟲AMPARs 之次單元GLR-1 會被KEL-8/CUL3 形式之E3 ligase 所調控而降解(Schaefer and Rongo, 2006)，而哺乳動物培養細胞內KARs 之次單元Glu-R6 會被Actinfilin/CUL3 形式之E3 ligase 所調控而降解(Salinas et al., 2006)。二、基因轉錄調控相關 Nrf2是一個轉錄因子，為細胞內可引發抗氧化反應之蛋白質，可以使大量的基因轉錄，使基因可以去對抗氧化的刺激，而達到體內的平衡，在正常情況下，Keap1 是 Nrf2和E3 ligase的橋樑，Keap1/CUL3 形式之E3 ligase 可在in vitro 的條件下對 Nrf2進行ubiquitination，而當Keap1 或CUL3 被knock down 時，Nrf2 會在細胞中累積(Cullinan et al.,2004; Furukawa and Xiong, 2005; Lo and Hannink, 2006)。三、細胞凋亡(apoptosis)調控相關 Daxx蛋白質在細胞內可調控許多不同的生理機制，在人類培養細胞中， SPOP/CUL3形式之E3 ligase 可調控Daxx 降解，因而影響Daxx 所負責的功能如細胞凋亡(apoptosis)，可以去調控P53蛋白(腫瘤抑制基因)的表現(Kwon et al., 2006)。 SPOP/CUL3 所形成之E3 ligase亦可針對PcG 蛋白質BMI1及變異性組蛋白 MACROH2A1 進行ubiquitination(Hernandez-Munoz et al., 2005)。四、胚胎發育相關 Dishevelled 為參與Wnt 訊息傳導途徑之蛋白質，在培養細胞（HEK293T）中 Dishevelled 可被KLHL12-CUL3-Roc1 所調控降解，此一動作也造成Wnt-β-catenin 訊息傳導途徑之負調控。KLHL12 所進行之反應也會影響非洲爪蟾胚胎與斑馬魚胚胎的發育(Angers et al., 2006)。Ci/Gli 轉錄因子家族可調控Hedgehog 反應所參與的許多重要發育過程，果蠅中的Ci 可被Rdx 調控而減弱Hedgehog反應(Kent et al.,2006)，而HIB/CUL3 形成之E3 ligase 亦可調控Ci/Gli 轉錄因子之降解，扮演負調控Hedgehog反應的角色(Zhang et al., 2006)，Hedgehog可以透過訊息傳遞來調控果蠅的眼睛及翅膀的發育，如果缺少Hedgehog訊號，Ci的C端就會被磷酸化，促進Ci 的泛素化和降解，因而降低對Hh訊號的調控(Ou, Wang et al. 2007)。Hedgehog也可以 8.

(11) 去調控脊椎動物的發育，轉錄因子Gli可以去調控Hedgehog反應，在核內進行轉錄， Gli2和Gli3可以在纖毛頂端快速累積，可以經由HIB/CUL3 形式之E3 ligase去調控降解(Wen, Lai et al. 2010)。五、植物生長發育相關 ETO1，是阿拉伯芥中的BTB domain蛋白質，可以控制ACS5的穩定性，可以催化乙烯的生合成，在阿拉伯芥中，催化乙烯生成速率決定步驟之ACS5 亦有可能經由此一形式的cullin(CUL3)-based ubiquitin ligase，進行ubiquitination並送至 26Sproteasome分解而調控乙烯生成(Wang et al., 2004a)。乙烯是一種植物氣體荷爾蒙，也是一個很重要的生長調節者，從種子萌發、開花授粉、果實成熟、到植物老化，乙烯都扮演了一個重要的角色，而CUL3可以去調控植物的生長和發育，當CUL3 Knockdown的時候，會使得ACS5累積，而ACS5是乙烯合成的一個酵素，會抑制根部發育(primary root growth)，影響根部分生組織(meristem size)的活性，size變小，和細胞數目減少，使得根變短，同時會有晚開花的現象(Schnable, Thomann et al. 2009)。除此之外，許多具BTB/POZ domain 蛋白質亦經由不同方式被證明其與阿拉伯芥中的CUL3 具有交互作用(Dieterle et al., 2005;Figueroa et al., 2005; Weber et al., 2005)，且CUL3-based E3 ligase系統調控了許多不同的功能包括前述乙烯生成、藍光訊號的傳遞(NPH3)、葉子的發育(BOP1)、abscisic acid signaling (ARIA), auxin signaling (NPY1) 和 salicylic acid signaling (NPR1)(Henriette 2009)，由此可見具 BTB/POZ domain 蛋白質可能藉由降解相關蛋白質之方式調控許多不同的發育或生理機制。在先前針對鐵砲百合花粉於低溫儲存導致花粉管萌發及生長速率顯著降低的研究中，發現許多基因之轉錄物會在低溫儲存一段時間後逐漸降解，而當低溫儲存之花粉粒於液體培養基培養2 小時後，這些mRNA將會重新轉錄(Wang et al., 2004b)。在這些基因當中，有一cDNA選殖體（LLBTB）由其已知核酸序列所推算之胺基酸序列與阿拉伯芥中AtBPM基因家族具相當高之相同度，而此蛋白質序列具有BTB domain。AtBPM基因家族共有六個成員，分別是AtBPM1(At5g19000)，AtBPM2 (At3g06190)，AtBPM3 (At2g39760)，AtBPM4(At3g03740)，AtBPM5(At5g21010) 和 AtBPM6(At3g43700)(Weber 2005)。從TAIR（http://www.arabidopsis.org/）網站基因表現資料庫中分析AtBPM基因在阿拉伯芥中不同部位的表現程度，發現AtBPM2 與 AtBPM3在花粉有相對高的表現量。由於阿拉伯芥成熟花粉屬於三細胞型態，花粉內的生殖細胞已分裂成兩個精細胞，我們進一步從資料庫中分析此兩基因於精細胞之表現狀況，結果發現此兩基因於精細胞有相當程度的表現量（如圖一、二）。在實驗室前人針對AtBPM2基因的突變株(SALK_121270)鑑定分析實驗中，發現阿拉伯芥 AtBPM2單一基因突變並未對阿拉伯芥表現型產生顯著的影響，突變株仍然可以正常繁衍後代，顯示花粉仍可完成發育且進行正常雙重受精的功能，意味著可能有其它基因互補AtBPM2基因的功能。因此本研究將以雙重突變的方式觀察當AtBPM2 與 9.

(12) AtBPM3兩基因皆突變後是否會對花粉發育或功能產生影響。此外，除了以”loss of function”的方式以探討AtBPM2 與AtBPM3基因可能之功能外，由於AtBPM2基因在花粉的表現量遠高於其他組織，因此本研究另以大量表現之方式將AtBPM2基因於其他部位表現，觀察是否有任何表現型的改變，以利協助基因功能的釐清。. 10.

(13) 材料與方法阿拉伯芥之種植條件與材料收集將阿拉伯芥的種子保存於乾燥箱中，並標明植株代號與收藏時間。T-DNA插入突變株之分析與取得來源為ABRC（Arabidopsis Biological Resource Center； http://www.biosci.ohio-state.edu/pcmb/Facilities/abrc/abrchome.htm）與SIGnAL （http://signal.salk.edu/）。種子種植前先置於4℃冰箱（打破休眠），2-4 天後再播種。播種時將適量種子放至介質中（有機培養土:蛭石:珍珠石=10:1:1），加入適量水後，以保鮮膜（戳幾個小孔）蓋住，置於22℃，16hr /8hr（日/夜）之生長箱中，待5-7 天種子萌發後，即可將保鮮膜去除，當植株長出後每盆留下3-5棵，其餘的剪掉以避免過度擁擠，當長出花序時(約需三個星期)將花序剪掉，以促進更多花序形成，當花序長到約十公分(約一個星期)即可進行基因轉殖。質體 DNA 萃取依 mini-plus plasmid DNA extraction system kit（Viogene）手冊提供的方法進行。將前一晚養好的菌以 5000rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液後倒扣將管子內的液體倒亁，加入 MX1 (200 μl)並用震盪儀使菌塊重新懸浮，將菌液轉到微量離心管中。加入 MX2 (250 μl) 上下翻轉使其混合均勻菌液會由混濁轉為清澈；液態轉為黏稠狀，在此過程中時間不可超過 5 分鐘。加入 MX3 (350 μl)時會出現白色沉澱物，翻轉時需小心不要將白色沉澱物弄散，當混合好時用高速離心 (13000rpm，10 分鐘)，利用微量吸取器將上清液轉到所附送的管柱中，小心不要吸到白色物體會造成濾膜阻塞。離心過濾(13000rpm,1 分鐘)倒掉下層液體，加入 500 μl WN buffer 離心過濾 (13000rpm,1 分鐘)倒掉下層液體，加入 700 μl WS buffer 離心過濾(13000rpm,1 分鐘) 倒掉下層液體，乾離 3 分鐘使膜上殘留液體離下來，將上層管柱(含膜的)換置在新的微量離心管中，於空氣中放置 1 分鐘使酒精揮發完全，加入 50 μl 的無菌水靜置 3 分鐘回溶，以 13000rpm 離心獲得質體 DNA。聚合酶鏈鎖反應（ploymerase chain reaction, PCR）將25 mM的dATP、dTTP、dCTP及dGTP稀釋配製為2 mM/each的dNTP Mix。取適量之DNA作為模板（約10~100 ng genomic DNA, 以及約1 ng plasmid DNA），加入5 μl的10×buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100)、5 μl的 25 mM MgCl2、5μl適當的20 μM引子（兩個引子各取2.5 μl，引子之命名與序列列表於附錄表三）、0.5 μl的Taq DNA polymerase (5 U/μl)，以ddH2O補足至總反應體積 11.

(14) 50 μl。以聚合酵素鏈鎖反應儀（Biometra 3000）進行PCR反應。首先以94 ℃，5分鐘使DNA變性成單股；接著32個循環增幅。每個循環分別以94 ℃，1分鐘使DNA變性，接著以55 ℃（鏈合溫度可視反應狀況加以調整），1分鐘使DNA與引子鏈合，再以72 ℃，1分鐘使DNA增幅（增幅時間可視反應需求加以調整）。循環結束後，以72 ℃，5分鐘來填補最後幾次循環的產物，除此之外，Taq DNA polymerase 的末端轉移酶(terminal transferase)活性會將PCR產物3'端加上幾個額外的腺核甘酸。反應結束後，取10 μl產物進行膠體電泳檢視。 TA cloning 使用適當的引子經聚合酶鏈鎖反應得到目標基因之序列，取 75 ng 的目標基因加入 0.5 μl （25 ng）pGEM-T Easy 載體 (廠牌為 Promega ,序號為 A1360) ，0.5 μl （3 Weiss unit/μl）T4 DNA ligase，2.5μl 2×Rapid Ligation Buffer，最後加入二次水補反應總體積直到 5 μl。放置 4℃，過夜。隔天轉形至勝任細胞中，並將勝任細胞塗在含有 Ampicillin（50 μl/ml）、IPTG（80μg）、X-Gal（140μg）的 LB 培養基，培養皿直徑大小為 90mm。 DNA 之回收與純化當目標基因與 T- easy 質體 DNA 經限制酶作用完全後，跑 Agarose gel 使目標基因與 T- easy 載體分離，取下含目標基因的 Agarose gel，秤重，利用 Geneaid Gel/PCR DNA fragment Extraction kit 純化目標基因。加入 500 μl 的 DF 緩衝液於樣本中，利用乾浴槽加熱 60℃ 15 分鐘，每隔 2-3 分鐘翻轉一次，使樣本均勻混合之後把樣本混合液(不可大於 700 μl)加入以組裝好的 DF column-tube（DF column 放入 DF tube 中），以 13000 rpm 轉速離心 1 分鐘，倒掉澄清液，再把 column 放回到 tube 上，加入 600 μl 的 wash buffer 同樣以 13000rpm 的轉速離心 1 分鐘，倒掉澄清液，再把 column 組回去並以 13000 rpm 的轉速離心 3 分鐘，使 column 中的濾紙能完全移除酒精。離心完，把 DF column 放入乾淨的微量離心管中，加入 50 μl 的無菌水並靜置 2 分鐘使濾紙上的 DNA 能完全溶解在無菌水中，之後以 13000 rpm 的轉速離心 2 分鐘，跑 Agarose gel 檢視結果。. PCR 產物的純化回收依 Geneaid Gel/PCR DNA fragment Extraction kit 手冊提供的方法進行純化載體。加入五倍樣本體積的 DF 緩衝液於樣本中，均勻混合，之後把樣本混合液(不可大於 700 μl)加入已組裝好的 DF column-tube （DF column 放入 DF tube 中），以 13000 rpm 轉速離心 1 分鐘，倒掉澄清液，再把 column 放回到 tube 上，加入 600 μl 的 wash 12.

(15) buffer 同樣以 13000rpm 的轉速離心 1 分鐘，倒掉澄清液，再把 column 組回去並以 13000 rpm 的轉速離心 3 分鐘，使 column 中的濾紙能完全移除酒精。離心完，把 DF column 放入乾淨的微量離心管中，加入 50 μl 的無菌水於並靜置 2 分鐘使於濾紙上的 DNA 能完全溶解在無菌水中，之後以 13000rpm 的轉速離心 2 分鐘。重組 DNA 之構築取 3μg 的質體 DNA，加入 4 μl（XhoΙ,10 unit /μl）的限制酶和 10 μl 十倍緩衝液（500 mM Tris-HCl, PH7.5 ; 100 mM MgCl2 ; 10 mM Dithiothreitol ; 1000 mM NaCl ）其餘加無菌水，最後體積為 100 μl 於 37℃中反應，過夜。於 DNA 回收後，取 1.2μg 直線型載體加入 5 units（NEW ENGLAND BIOLAB）去磷酸酶與十分之ㄧ總體積的 10 倍 buffer（1×buffer 100 mM NaCl,50 mM Tris-HCl,10 mM MgCl2,1mM DTT,pH 7.9 於 25℃），放置 37℃中 1 小時，以進行去磷酸反應。之後各取適量之載體與目標基因（莫爾濃度比約為 1：6，而載體與目標基因的總量為 200ng 且是用可相容的限制酶切割），加入 0.5 μl（400 unit/μl）（NEW ENGLAND BIOLAB）的接合酶與十分一體積的 10 倍 buffer（1×buffer 50 mM Tris-HCl,10 mM MgCl2,10mM DTT,1 mM ATP pH7.5 於 25℃）放置 4℃過夜以進行接合反應。勝任細胞(competent cell)的製作參考 Sambrook and Russell 編著《molecular cloning》（ 2001. Ed 3 ）一書，將 E.coli(DH5α)的單一菌落培養於 25 ml 的 LB 溶液中，放置 37℃，過夜。取 6 ml 的過夜培養液加入 200 ml SOB 溶液（pH7.0, 2 ﹪（w/v） bacto tryptone,0.5﹪（w/v） yeast extract,10 mM NaCl,2.5 mM KCl,10 mM MgCl2‧6H2O,10 mM MgSO4‧7H2O）中，放置 18℃ 培養直到 OD 值為 0.4-0.6。將培養液放置冰上 10 分鐘，再以 4℃2500 ×g 離心 10 分鐘，移除上清液後再以 80 ml 冰的 TB 緩衝液（10 mM PIPES,15 mM CaCl2‧2H2O,250 mM KCl,55 mM MnCl2‧4H2O）使菌體懸浮，再將培養液放置冰上 10 分鐘，4℃ 2500×g 離心 10 分鐘，移除上清液再以 20 ml 冰的 TB 緩衝液使菌體懸浮，然後加入 1.5 ml 的 DMSO 並均勻混合，分裝成適當的體積，並急速冷凍保存於-80℃冰箱。轉形（transformation）從-80℃冰箱拿出勝任細胞(competent cell)置於冰上回溶，並加入欲轉形之重組 DNA (< 100ng)，再置於冰上 30 分鐘後，將材料轉置於亁浴槽中以 42℃之溫度進行熱休克 90 秒。取出離心管後迅速放在冰上九十秒加入 LB medium 800 μl 於 37℃培養 30 分鐘到 1 小時，低速離心( 5000 rpm, 5~10 分鐘)將上清液取出約 850 μl，利用微量吸取器混合均勻後將菌液移至所需的培養皿，利用玻璃珠或玻棒塗勻，放入 37 ℃培養箱中培養(14~16 小時)。. 13.

(16) 農桿菌勝任細胞的製作將農桿菌(Agrobacteria)種在 5 ml 的 LB 中，於 28-30℃搖過夜。取 2 ml 的菌液接種到 50 ml 的 LB 中(用 250 ml 的 flask)，在 28-30℃搖，直到 OD600 在 0.5-1 之間。將菌液放在冰上冷卻，然後以 3000g，在 4℃離心 5 分鐘。沈澱下來的細菌以 1 ml 冰的 20 mM CaCl2 打散，以每管 0.1 ml 分裝到已冰過的 0.5 ml 管中，加好的就放到液態氮冷凍。農桿菌轉形（Agrobacteria. transformation）. 取一管的農桿菌(Agrobacteria)的勝任細胞(competent cell)放在冰上解凍。加 1μg 的 DNA 到含勝任細胞(competent cell)的管中後就放到液態氮中冷凍。將管子取出後，先開蓋子再蓋起來以防止蓋子爆開，置於 37℃的水槽中 5 分鐘。加 1 ml 的 LB 後放到 28-30℃緩和的搖 2-4 小時。將細胞離心下來並將上清液吸除後，以 0.1 ml 的 LB 將細胞打散並塗在含抗生素的 LB plate 上。置於 28-30℃兩天後就可看到菌落。阿拉伯芥之基因轉殖將含重組基因的轉殖載體(pCAMBIA1390)之農桿菌接種到20 ml含有Kanamycin 的無菌LB液體培養基中，去掉已經授粉的花朵與果莢，轉殖前先讓阿拉伯芥吸滿水，以避免培養土吸收過多的農桿菌液，轉殖時將阿拉伯芥植株倒放入盛有農桿菌之懸浮液之容器中，在真空抽氣的容器內，以幫浦抽氣至400/mmhg2分鐘，真空抽氣後，將植株繼續浸在農桿菌懸浮液1分鐘，使植株至於生長箱中，並以保鮮膜罩住以保持濕度，24小時後取下保鮮膜，三星期收種子。阿拉伯芥轉殖株的篩選種子的重量為10-30/mg/tube，以70%酒精消毒，時間約1分鐘，再以1-2% NaOCl+0.1%Tween-20 (介面活性劑)消毒10-15分鐘，然後以1 ml無菌水清洗至少五次，將種子浸在無菌水中，置於4℃冰箱，2-4天後再播種。播種時，加入8 ml無菌水，搖動培養皿使種子均勻分布於培養基上，然後置於22-24℃，16hr/8hr(日/夜)之生長箱中，約二星期可以觀察篩選結果，其篩選是利用抗生素hygromycin進行，因為抗生素不會去抑制種子萌發，因此播種後非轉殖株也會發芽，非轉殖植株經過抗生素篩選，約一至二週後子葉或整株呈現白化現象，且只長出胚根即停止發育，因轉殖載體上具有抵抗抗生素的基因，所以成功轉殖的殖株會長成翠綠色，而沒有轉殖成功的種子會黃化或不萌發，所以就可以篩選出成功轉殖的植株。. 14.

(17) 植物基因組DNA的萃取（Genomic DNA extraction）取約 2~4 小葉子或 1~2 大葉子（野生型與突變型共 2 種材料，分開萃取），把葉片放置於微量離心管中以研磨棒研磨，加入 800 l 的緩衝液(1 M Tris-HCl 20 ml，2 M NaCl 12.5 ml，0.5 M EDTA 5ml，20% SDS 2.5 ml，加 ddH2 0 至終體積 100 ml)並輕翻混合後，在室溫下以 13000 rpm 離心 5 分鐘，取出 600 l 上清液至新的微量離心管，再加入 600 l 低溫儲存之異丙醇(isopropanol )並輕輕翻轉使溶液充分混合，置於-20℃沉澱 30 分鐘或隔夜。接著在室溫下以 13000 rpm 離心 5 分鐘，然後倒掉上清液，加入 600 l 酒精（70%）進行沉澱物清洗，倒掉酒精後風乾沉澱物，加入適量（約 50 l）ddH20，將微量離心管放置於 65℃加熱槽協助沉澱物溶解，樣本留存於-20℃冰箱待後續以聚合酶鏈鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）及電泳檢測 DNA 產物。 RNA的萃取（RNA extraction）取 0.1 克阿拉伯芥葉片與液態氮一起加入硏缽中磨成粉狀（此過程不可讓材料成液狀）。加入 1 ml super RNApureTM 溶液與粉狀的材料研磨均勻（視情況加入液態氮），回溫後將混合液吸至微量離心管中，加入 50 l DF buffer 上下混勻，再加入 100 l 氯仿徹底震盪，之後將微量離心管放置冰上 15 分鐘分層，並於 4℃下以 12000g 離心 15 分鐘。吸取上清液至新的微量離心管，加入 50 l NC buffer 和 600 l 異丙醇(isopropanol )搖晃均勻，於 4℃下以 12000g 離心 10 分鐘。倒掉上清液，以 600 l 75%酒精(以 DEPC 水配製)清洗兩次，放置大氣中乾燥但不可太乾，再以 30 l DEPC 水回溶（回溶時視情況判斷是否加溫助溶）。以膠片檢視 total RNA，並將 total RNA 置於-20℃暫時儲存或-80℃儲存。. RNA 於電泳膠體（denatured gel）的觀察配製 1％洋菜瓊脂膠體。秤取 0.2 克重的洋菜瓊脂膠粉末加入 14 ml 的二次水，加熱溶解。當溫度降至約 55℃時加入 2 ml 10× MOPS（0.2 M MOPS，20 mM 醋酸鈉， 10 mM EDTA）、4 ml 甲醛，混合均勻倒入製膠容器中，插入齒梳成型。待膠體凝固時，取 3 μl RNA 加入 1 μl 10× MOPS 、1.5 μl 甲醛、4.5 μl Formamide，以 70 ℃ 加熱 10 分鐘，之後馬上置入冰中冷卻。再加入最後總體積的十分之ㄧ體積的 loading dye 跑膠並以 1× MOPS 為 running buffer。. 15.

(18) RNA反轉錄聚合酶鏈鎖反應（RT-PCR）取 1 g 的 total RNA，加入 0.2 ml 微量離心管中，補 DEPC 水調整體積到 10 l。將此微量離心管置於 75℃，10 分鐘使 RNA 結構失活後立即放置在冰上，之後在 RNA 溶液中加入 (10X RT Buffer 2 l，10 mM dNTPs2.5 l，20 M Oligo-dT Primer2 l，MMLV RTase1l，ddH2O2.5 l，Total (with step1 RNA solution)為 20 l)，並將微量離心管快速離心並混合均勻後置於 37°C，60 分鐘，進行反轉錄反應，接著 75°C，反應 15 分鐘，使 MMLV RTase 失活。反轉錄反應結束，即可進行後續 PCR 實驗。並設定 PCR 反應條件（可依據實驗所需而調整）：Denaturation：94℃ for 5 分鐘， 30 cycles：94℃ for 30 秒, 55 ℃ for 30 秒, 72℃ for 50 秒，Elongation：72 ℃ for 5 分鐘，將 PCR 管子置入反應器中進行反應。取 10 l PCR 產物進行電泳分析，觀察約 0.5 kb 的產物。. 16.

(19) 實驗結果建立、鑑定並分析基因大量表現之植株為協助 AtBPM2 基因功能的釐清，本研究以 pCAMBIA1390 載體為將 AtBPM2 基因大量表現於阿拉伯芥，實驗流程如圖三。當含有 AtBPM2 基因之 T-DNA 成功被送進植物細胞後，因 hptII 基因的表現，使得轉殖後的植物組織細胞能抵抗 hygromycin 的作用而正常發育；反之，沒成功轉殖的植物組織細胞就會致死。經由篩選後長出的阿拉伯芥為第一代轉殖株(T1)，開始去收集 T1 種子(即為 T2 子代)再以含有抗生素 hygromycin 的培養基來篩選，如果有 75%的存活率，就可以知道 T1 子代只插入一個基因，且為異型合子(heterozygote)。分別去收取不同棵的 T2 子代所結的種子(即為 T3 子代)，再以含有抗生素 hygromycin 的培養基來篩選，來計算存活率，如果 T3 子代有 75%的存活率就可以知道 T2 子代為異型合子(heterozygote)；如果 T3 子代有 100%的存活率，就可以知道 T2 子代為同型合子(homozygote)。以篩選出 T3 子代同型合子十二株不同轉殖植株觀察記錄表現型差異，發現當於阿拉伯芥大量表現 AtBPM2 基因時，不論是從葉片數的多寡與生長日數的數據都指出花序抽出的時程提早（圖四、五、六、附錄表一、表二），代表轉殖株比較快從生長期轉入繁殖期。. 阿拉伯芥T-DNA插入突變株鑑定與雙重突變株之建立實驗室前人針對AtBPM2基因(At3g06190)的突變株/SALK_121270/鑑定分析實驗中，發現阿拉伯芥AtBPM2單一基因突變並未對阿拉伯芥表現型產生顯著的影響，突變株仍然可以正常繁衍後代，顯示花粉仍可完成發育且進行正常雙重受精的功能，意味著可能有其它基因互補AtBPM2基因的功能。花粉內的精細胞為完成雙重授精之核心角色，由於阿拉伯芥成熟花粉屬於三細胞型態，花粉內的生殖細胞已分裂成兩個精細胞，從資料庫中分析AtBPM基因家族於精細胞之表現狀況，結果發現AtBPM2 與AtBPM3兩基因於精細胞有相當程度的表現量（如圖一、二），因此本研究想藉傳統遺傳學方式，用人工授粉與自花授粉方式，使植株同時帶有AtBPM2 與AtBPM3 兩基因突變，以雙重突變的方式觀察當AtBPM2 與AtBPM3兩基因皆突變後是否會對花粉發育或功能產生影響（實驗流程設計如圖七）。建立雙重突變株前，先必須獲得AtBPM3基因突變株。於T-DNA的突變株資料庫(SALK:http://signal.salk.edu/)網站去分析AtBPM3基因（At2g39760）現有的T-DNA插入突變株後，從ABRC網站 (Arabidopsis Biological Resource Center)取得SALK_072848與SALK_100999兩突變株種子，將突變阿拉伯芥各種植數十株，等植株長到一個月時，每一株剪幾片葉子 17.

(20) 用以分離基因組DNA，待後續以PCR來分析突變種阿拉伯芥的基因為同型合子 (homozygous)或是異型合子(heterozygous)，同時將每個植株標示清楚，以便種子的收集。將萃取好的基因組DNA各取30ng加入加入三種不同引子(SALK_072848所加入的引子分別是LBP1、SALK_072848 5＇及SALK_072848 3＇，SALK_100999所加入的引子分別為LBP1、SALK_100999 5＇及SALK_100999 3＇)，引子之命名與序列列表如附錄表三，經聚合酶鍊鎖反應後(PCR)，由於利用LBP1、LP、RP這三種引子 (其相關位置參考圖八突變種阿拉伯芥TDNA位置示意圖)，同時去控制PCR反應的循環時間，使其只能合成1kbp左右的長度(或者不超過3kbp)。由於在突變種阿拉伯芥核酸序列插入的T-DNA長度為4485bp，所以突變株中LP、RP引子不會有PCR產物出現，所以就可以知道阿拉伯芥基因型為同型合子或者是異型合子。圖九的結果顯示經篩選鑑定後，已獲得兩突變株之同型合子，且藉由RT-PCR分析基因表現狀況，也確認突變株基因不表現（圖十，07F代表分析樣本取自於SALK_072848），外表型與野生型相比無明顯差異，與單一AtBPM2基因的突變株(SALK_121270)結果相近。本研究後續實驗AtBPM3基因突變株選擇以SALK_072848進行。完成AtBPM3基因的突變株/SALK_072848/的鑑定後，本研究即開始進行雙重突變株的建立。由於本研究所使用之阿拉伯芥授粉形式為自花授粉，自花授粉無法形成雙重突變，故雙重突變之建立需以AtBPM2 與AtBPM3兩基因突變株進行異花授粉。進行異花授粉時，需對花粉接受者在雌蕊尚未成熟前進行解剖，以去除雄蕊（此時雄蕊內的花粉尚未成熟，且雄蕊位置低於雌蕊，尚未進行自花授粉，如圖十一所示），待花粉接受植株之雌蕊成熟後，將另一突變株之成熟花粉授於其上（圖十一），以棉繩做記號等待種子收成，以進行後續雙重突變同型合子植株的篩選（流程如圖十二所示）。種子收成後所種植的第一代兩突變基因的型式為異型合子，待其自交後即有機會獲得兩突變基因的同型合子。針對第一代植株進行基因型 PCR分析可得知其兩基因突變確為異型合子（圖十三），而同型合子的獲得與鑑定則有待實驗室工作夥伴後續的努力。. 18.

(21) 討論本研究主要的工作有二，其一是以大量表現之方式將AtBPM2基因於其他部位表現，觀察是否有任何表現型的改變，其二是以雙重突變的方式觀察當精細胞內高表現量的AtBPM2 與AtBPM3兩基因皆突變後是否會對花粉發育或功能產生影響。如同前文所述，AtBPM2基因表現量在花粉內的精細胞表現量相當高，而在植株其他位置 AtBPM2基因表現量遠低於在精細胞，故大量表現之策略主要是想藉此觀察是否會讓植株出現不正常之表現型，以此推敲基因可能的功能。如同結果所示（圖四、五、六、附錄表一、表二），在AtBPM2基因大量表現的植株中，花序抽出的時程明顯提早，也就是突變株為早開花植株。開花時程的調控在阿拉伯芥中為一相當複雜的反應，與溫度、光照、營養等諸多原因相關。由於AtBPM2為一具BTB domain與MATH domain的蛋白質，此兩domain都與蛋白質交互作用有關，且AtBPM蛋白質也已被證實藉由BTB domain可與AtCUL3a及AtCUL3b結合形成複合體，若依據本研究結果推測，AtBPM2蛋白質以BTB domain與AtCUL3結合，而與MATH domain結合的蛋白質則可能為降解受質，此受質在正常植株中可能執行與開花時期調控相關之功能，當在不正常的大量表現背景下，此可能受質存在之平衡度被不正常之AtBPM2基因表現所破壞，導致早開花之現象出現。此蛋白質受質存在與否尚需後續實驗證實。本研究另一主軸是建立雙重突變株以觀察AtBPM2 與AtBPM3兩基因皆突變後的表現型。如前所述，AtBPM2 與AtBPM3兩基因單獨突變時，在表現型上並無明顯的差異，故推測AtBPM基因家族具冗餘 (redundant) 的特性，亦即單一基因的突變會被基因家族中的其他成員因功能互補之關係，使得表現型與野生型相比無明顯之差異。由於整個AtBPM基因家族在Affymetrix基因表現資料庫中，只有AtBPM2 與 AtBPM3兩基因在花粉中的精細胞具相當大量的表現，故本研究選擇此兩基因進行雙重突變。在進行兩單一突變株之異花授粉後，其下一代植株（F1）確為具兩基因突變之異型合子植株（圖十三），如同預期，在表現型上與野生型相比較無明顯之差異。現F1植株種子已收成，待進行後續同型合子之篩選與鑑定。. 19.

(22) 圖一，由Affymetrix基因表現資料庫中分析AtBPM2基因(At3g06190)在阿拉伯芥各部位的表現情形。. 20.

(23) 圖二，由Affymetrix基因表現資料庫中分析AtBPM3基因(At39760)在阿拉伯芥各部位的表現情形。. 21.

(24) 圖三，AtBPM2 基因大量表現之轉殖植株建立與篩選之流程示意圖。本研究使用之載體為 pCAMBIA1390，農桿菌菌株為 GV3101。將重組 DNA 構築完成後，送入農桿菌，並用以感染阿拉伯芥。待受感染阿拉伯芥種子收成後，以含抗生素培養基篩選轉殖植株。轉殖植物篩選確定後，自交至獲得同型結合體以觀察期表現型。. 22.

(25) 圖四，轉殖植物（T3 世代）花序生長之時間點與葉片數目的柱狀圖。縱座標植代表不同之轉殖株，WT 代表野生種。橫座標代表每一轉殖株花序生長時的平均葉片數目及標準差。本柱狀圖之統計數據為第一批種植轉殖植物之觀察統計結果。. 23.

(26) 圖五，轉殖植物（T3 世代）花序生長之時間點與葉片數目的柱狀圖。縱座標代表不同之轉殖株，WT 代表野生種。橫座標代表每一轉殖株花序生長時的平均葉片數目及標準差。本柱狀圖之統計數據為第二批種植轉殖植物之觀察統計結果。. 24.

(27) 編號:Oe 8. 編號:Oe 9. 編號:Oe 10. 編號:Oe 11. 編號:Oe 12. 編號:Oe 13. 圖六，轉殖植物（T3 世代）與野生種植株（WT）之表現型比較。右邊六張圖片分別為不同轉殖株之生長情形，編號:Oe 8 (PCAM1390 AtBPM2-myc 7-3 T3 homo) 編號:Oe 9(PCAM1390 AtBPM2-myc 7-6 T3 homo) 編號: Oe 10 (PCAM1390 AtBPM2-myc 9-2 T3 homo) 編號: Oe 11 (PCAM1390 AtBPM2-myc 9-4 T3 homo) 編號: Oe 12 (PCAM1390 AtBPM2-myc 9-5 T3 ) 編號: Oe 13( PCAM1390 AtBPM2-myc 9-6 T3 homo)左邊圖片為野生種，兩者種植日及生長環境相同。. 25.

(28) 圖七，建立阿拉伯芥 AtBPM2(At3g06190)及 AtBPM3(At2g39760)基因雙重突變之實驗流程圖。方框內 AtBPM2(At3g06190)基因突變株之鑑定已由實驗室前人完成。. 26.

(29) 圖八，（上圖）突變種擬南芥T-DNA 位置及相關引子之示意圖（圖片摘自於SIGnAL 網頁http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html），LP, RP 為Left, Right genomic primer. BP 為T-DNA border primer，LB - the left T-DNA border primer. （下圖）推測瓊脂膠體電泳分析突變株PCR鑑定的可能實驗結果。. 27.

(30) 圖九，瓊脂膠體電泳分析AtBPM3(At2g39760)突變株PCR鑑定的實驗結果 (a) SALK_072848 (b) SALK_100999。萃取阿拉伯芥突變株的genomic DNA後加入三種不同引子(SALK_072848所加入的引子分別是LBP1、SALK_072848 5＇及 SALK_072848 3＇，SALK_100999所加入的引子分別為LBP1、SALK_100999 5＇及 SALK_100999 3＇)，可以預期1kb是WT野生種，0.5kb是突變株，經PCR反應，以檢驗植株是同型合子或是異型合子。. 28.

(31) 圖十，RT-PCR 瓊脂膠體電泳分析 AtBPM3(At2g39760)突變株 SALK_072848 同型合子之基因表現情形。G 為 cDNA 的 PCR 對照組，WF 為野生種花器的 RT-PCR 結果， 07F 為突變株花器的 RT-PCR 結果。. 29.

(32) SALK_072848(At2g39760). SALK_121270(At3g06190). 圖十一，手工異花授粉示意圖。(a) 於花器成熟前將雌蕊留下，其餘部分切除。待雌蕊成熟後（約等待 24 小時，可觀察柱頭之變化），取另一突變株 AtBPM2 之成熟花粉(SALK_121270)以手工方式授於已部分解剖之花器柱頭(SALK_072848)上，並等待以收取種子。(b) 部分解剖之阿拉伯芥花器顯示不同發育時期各部位相關位置之變化。. 30.

(33) 圖十二，異花授粉雙重突變株之同型合子鑑定流程示意圖。. 31.

(34) 圖十三，異花授粉雙重突變株之鑑定。本實驗分別以(a)SALK_121270 引子組 (LBP1、SALK_121270 5＇及 SALK_121270 3＇)與(b) SALK_072848 引子組(LBP1、 SALK_072848 5＇及 SALK_072848 3＇)進行 PCR 分析，WT 為野生種樣本，(a)(b) 兩圖中同號碼之樣本來自同一植株。. 32.

(35) 附錄. 圖一、花粉發育的過程花粉母細胞經減數分裂形成小孢子，再經由第一次的有絲分裂，產生生殖細胞及營養細胞，再經由第二次有絲分裂，花粉繼續發育，最後進行自發性的脫水乾燥而成熟。. 33.

(36) 植物名稱. 編號. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 1-4 T3 homo. Oe1. 9. 9. 10. 7. x. 11. x. 10. 12. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 1-7 T3. Oe 2. 9. 9. 12. 10. 11. 10. 9. 10. 10. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 3-5 T3 homo. Oe 4. 8. 9. 10. 9. 10. 10. 10. 10. 10. 7. PCAM1390 AtBPM2-myc 3-6 T3 homo. Oe 5. 8. 11. 9. 10. 8. 8. 8. 9. 9. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 6-3 T3 homo. Oe 6. 10. 10. 11. 9. 11. 11. 11. 11. 10. 11. PCAM1390 AtBPM2-myc 6-6 T3 homo. Oe 7. 10. 10. 10. 11. 10. 10. 12. 9. 12. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 7-3 T3 homo. Oe 8. x. 11. 11. 10. 13. 10. 11. 10. 9. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 7-6 T3 homo. Oe 9. 11. 10. 7. 9. 11. 9. 11. 9. 11. 9. PCAM1390 AtBPM2-myc 9-2 T3 homo. Oe 10. 9. 11. 9. 8. 10. 10. 10. 9. 10. 9. PCAM1390 AtBPM2-myc 9-4 T3 homo. Oe 11. 10. 9. 9. 9. 10. 10. 10. 11. 11. 11. PCAM1390 AtBPM2-myc 9-5 T3. Oe 12. 9. 9. 10. 10. 10. 10. x. 11. 10. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 9-6 T3 homo. Oe 13. 9. 9. 10. 9. 9. 10. 10. 11. 11. 10. 12. 11. 12. 14. 13. 12. 10. 13. 11. 11. WT. 表一，轉殖植物（T3 世代）花序生長之時間點與葉片數目的統計表格。植物名稱代表不同之轉殖株，WT 代表野生種。每一轉殖株分別種植 10 個（編號 1-10）以觀察統計表現型，數字代表花序生長時的葉片數目。本表格之統計數據為第一批種植轉殖植物之觀察統計結果。. 34.

(37) 植物名稱. 編號. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 1-4 T3 homo. Oe1. 8. 8. 10. 8. x. 9. 9. 8. 10. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 1-7 T3. Oe 2. 10. 10. 10. 9. 10. 8. 9. 8. 8. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 3-5 T3 homo. Oe 4. 9. 9. 10. 11. 9. 10. 10. 10. 9. x. PCAM1390 AtBPM2-myc 3-6 T3 homo. Oe 5. 11. 8. 9. 9. 9. 8. 8. 9. 11. 8. PCAM1390 AtBPM2-myc 6-3 T3 homo. Oe 6. 9. x. 9. 9. 9. 10. 10. 10. 9. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 6-6 T3 homo. Oe 7. 10. 10. 9. 9. 11. 10. 11. 10. 9. x. PCAM1390 AtBPM2-myc 7-3 T3 homo. Oe 8. 11. 10. 10. 11. 9. 10. 9. 10. 9. 9. PCAM1390 AtBPM2-myc 7-6 T3 homo. Oe 9. 10. 8. 8. 10. 9. 9. 8. 10. x. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 9-2 T3 homo. Oe 10. 10. 10. 9. 9. 11. 8. 11. 10. 9. 11. PCAM1390 AtBPM2-myc 9-4 T3 homo. Oe 11. 10. 9. 8. 9. 9. 9. 10. 10. 9. 9. PCAM1390 AtBPM2-myc 9-5 T3. Oe 12. 9. 10. 10. 9. 8. 8. 8. 10. 10. 10. PCAM1390 AtBPM2-myc 9-6 T3 homo. Oe 13. 9. 10. 10. 9. 9. 10. 9. 8. 9. 9. 11. 13. 12. 12. 11. 14. 10. 12. 11. 14. WT. 表二，轉殖植物（T3 世代）花序生長之時間點與葉片數目的統計表格。植物名稱代表不同之轉殖株，WT 代表野生種。每一轉殖株分別種植 10 個（編號 1-10）以觀察統計表現型，數字代表花序生長時的葉片數目。本表格之統計數據為第二批種植轉殖植物之觀察統計結果。. 35.

(38) 表三引子名稱及序列引子名稱. 核酸序列. LBb1. 5’-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3’. SALK_072848 LP. 5’-TTCTGCAAATGATTGCACTACC-3’. SALK_072848 RP. 5’-CTACAGTTTTGCTGACTCGGG-3’. SALK_100999 LP. 5’-GTGTTGGACCGGTTTTGATAG-3’. SALK_100999 RP. 5’-GCACTTGAAACAGAGCTGTCC-3’. T-DNA RP. 5’-AGTTGCAGCAAGCGGTCCACGC-3’. T-DNA LP. 5’-CCATTGCCCAGCTATCTGTCAC-3’. 36.

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