行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
中藥柴胡桂枝湯對大鼠急性胃潰瘍之預防與治療的探討
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2313-B-002-382- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學獸醫學系暨研究所 計畫主持人： 郭宗甫 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 10 月 22 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
※ ※
※ 中 藥 柴 胡 桂 枝 湯 對 大 鼠 急 性 胃 潰 瘍 ※
※
之 預 防 與 治 療 的 探 討 ※
※ ※
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
計畫類別：█個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：NSC 91－ 2313 －B － 002 － 382 －
執行期間： 91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
計畫主持人：郭宗甫
電話：02-23661451
傳真：02-23661451
電子信箱：[email protected]
執行單位：國立台灣大學獸醫學研究所
中 華 民 國 92 年 10 月 30 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
NSC Project Reports
計畫編號：NSC 91-2313-B-002-382-
執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
主持人：郭宗甫 國立台灣大學獸醫學研究所
一、中文摘要 本研究藉由水浸潤拘束緊迫法誘導大 鼠急性胃黏膜損傷，評估中藥柴胡桂枝湯 預胃黏膜損傷與抗氧化之效果及對正常大 鼠之影響。結果顯示此藥能預防 WIRS 誘導 胃黏膜病灶的產生，促進胃黏膜及肝臟非 蛋白質硫氫基化合物濃度的增加。在正常 大鼠方面，此藥投藥四小時後，能促進胃 黏膜與肝臟的非蛋白質硫氫基化合物濃度 的增加，血漿脂質過氧化物濃度的降低。 長期投藥三週能促進肝臟的非蛋白質硫氫 基化合物濃度的顯著增加。故可知柴胡桂 枝湯亦俱有促進體內抗氧化的效果。 關鍵詞：胃黏膜損傷、柴胡桂枝湯、活化 氧自由基、水浸潤保定緊迫法、抗氧化 AbstractThe aim of this study was to investigate preventive and antioxidant effects of Chai-hu -gui-zhi-tang on the development of gastric mucosa lesions induced by water immersion restraint stress (WIRS). The result revealed that the medicine could prevent the develo -pment of gastric mucosal lesions and the decrease of gastric and liver nonprotein sulfhydryl groups (NPSH) induced by WIRS. In normal rats, short time administration of the medicine would promote the decrease of plasma lipid peroxidation and the increase of gastric and liver NPSH. Long time administration of the medicine would promote the increase of liver NPSH. Therefore, Chai-hu-gui-zhi-tang extract could also promote the antioxidation of the body. Keywords: gastric mucosal lesions、Chai-hu
-gui-zhi-tang、ROS、WIRS、 antioxidant
二、緣由與目的
一。於緊迫動物實驗，水浸潤拘束緊迫法 （ Water immersion restraint stress; WIRS）誘導大鼠胃黏膜損傷的實驗顯示： WIRS 誘導，會使胃黏膜活性氧自由基（ROS） 生成增加，並造成脂質過氧化物濃度顯著上 升[21]。由 Nishida 等人的研究證實，局部 貧血-再灌流（Ischemia–reperfus ion）會 引 起 能 量 代 謝 異 常 ， 黃 嘌 呤 氧 化 酶 （Xanthine oxidase）活化產生 ROS 於 WIRS 誘導過程中造成胃黏膜損傷。此外，局部貧 血使細胞受損，會使血液循環中的嗜中性球 吸附與活化。釋放大量 ROS，進一步傷害受 損的細胞[10]。 除了 ROS 外，WIRS 誘導時，胃黏膜及肝 臟 的 Glutathione （ GSH ） 亦 有 減 少 情 形 [7,12]。已知 GSH 等硫氫基抗氧化物（NPSH） 對胃黏膜的完整性有其重要性[17]。肝臟則 是體內生成 GSH 的重要器官之一[7]。藉由 藥物抑制 GSH 生成，會使胃黏膜病灶產生。 投予外源性 GSH 則可以減少經由 WIRS 誘導 所產生的胃黏膜病變，並降低胃黏膜脂質過 氧化物的濃度[6,7]。故 GSH 在 WIRS 誘導使 脂質過氧化物產生增加的過程中所扮演的 角色，需加以探討。 臨床上緊迫導致胃黏膜損傷的病例需 予預防藥物預防出血的產生。然而預防投 予抑制胃酸類藥物使胃黏膜 pH 值上升，會 造成細菌感染，進而導致肺炎[4]。故在胃 潰瘍出血的預防上仍需尋找其他替代藥 物。已知抗氧化亦是胃黏膜重要的防禦因 子之一。傳統中藥複方，柴胡桂枝湯已知 是一有效的抗氧化劑，於腦部具有抗氧化 功能[18]，傳統中醫已用於預防胃潰瘍的 產生。然而在胃黏膜抗氧化方面，柴胡桂 枝湯並無文獻報告加以研究探討。故本實 驗將藉由 WIRS 動物模式，檢測胃黏膜 NPSH 濃度、胃黏膜過氧化物濃度的改變，評估 柴胡桂枝湯對胃黏膜局部抗氧化物與活性 氧自由基間平衡之影響。另外檢測肝臟
NPSH 與血漿過氧化物濃度的改變，以評估 柴胡桂枝湯對大鼠系統性抗氧化生理的影 響。此外，並檢測短期投藥(2h、4h)與長 期投藥(3 weeks)對正常大鼠抗氧化之影 響，評估柴胡桂枝湯作為臨床預防胃潰瘍 出血的替代藥物。 三、材料與方法 實驗所用 Wistar 雄性大鼠是取自台灣 大學醫學院實驗動物中心。柴胡桂枝湯是 採用台灣港香蘭藥廠出品的濃縮中藥。 （1）水浸潤拘束緊迫誘導急性胃黏膜損 傷：WIRS 的操作是依據 Takagi 等人的作 法，將已禁食 18 小時的大鼠拘束於拘束籠 中，限制其移動，再將此拘束籠置入 23 ℃ 水中，深度直至大鼠胸骨劍突。藉由 WIRS 的進行，誘導胃黏膜病變產生[19]。 （2）潰瘍指數的檢測：大鼠以 CO2安樂死 後，快速取出大鼠胃臟並置於冰上，延胃 大彎切開胃臟，以 0.15 M NaCl 清洗胃黏 膜表面。以解剖顯微鏡十倍下觀察，記錄 胃黏膜出血病灶的直徑長度總和（cm）。 （3）非蛋白質硫氫化合物濃度之檢測：依 據 Sedlak 等 人 的 方 法 ， 利 用 50 % Trichloroacetic acid 使蛋白質沈澱並分離 後，藉由簡稱為 DTNB 的 Ellaman reagent 與非蛋白質硫氫基化合物反應結合產生黃 色產物，再藉由分光光度計，於波長為 412 nm 測量此黃色產物濃度予以定量[15]。 （4）胃黏膜脂質過氧化物濃度之檢測：根 據 Ohkawa 等 人 所 建 立 之 TBARS （Thiobarbi -turic acid assay）方法，加以改 良後測量。原理是利用 Thiobarbituric acid 可與不飽和脂肪酸過氧化後所衍生穩定的 次 要 產 物 ， 如 Malondialdehyde (MDA) 等，加熱反應產生粉紅色產物，使用分光 光 度 計 於 光 源 波 長 為 532nm 予 以 檢 測 [11]。 （5）血漿脂質過氧化物濃度之檢測：依據 Satoh 所 建 立 的 TBARS 方 法 ， 利 用 Thiobarbituric acid 可與不飽和脂肪酸過氧 化後所衍生穩定的次要產物，如 MDA 等， 加熱反應產生粉紅色產物，進而使用分光 光 度 計 於 光 源 波 長 為 532nm 予 以 檢 測 [14]。 （ 6 ） 均 質 液 蛋 白 質 濃 度 之 定 量 ： 依據 Bradford 建 立 的 方 法 ， 利 用 Coomassie Brillant Blue G-250 與蛋白質反應結合為複 合物後，顏色改變為深藍色，藉由分光光 度計於波長為 595 nm 時，予以測量[2]。 （7）統計分析：數據皆以 Mean ± SD 表 示。分析方法上，多組數據，皆以變異分 析 （ ANOVA ） 中 的 完 全 隨 機 設 計 （Completely randomized design）與鄧氏新 多變域測驗法（Duncan’s new multiple range test）予以分析。成對數據以 t-test 分析。P ＜0.05 時，為顯著差異；P＜0.01 時，為極 顯著差異。 四、結果與結論 本實驗結果顯示：預防投予柴胡桂枝 湯能有效的抑制 WIRS 誘導 2h、4h 大鼠胃 黏膜病變的產生。 於 WIRS 誘導前立即投予柴胡桂枝湯 濃縮中藥，能預防 WIRS 誘導過程中，胃 黏膜 NPSH 濃度的減少，同樣於無 WIRS 誘導的正常大鼠實驗結果也顯示，無氧化 壓力的過程中，柴胡桂枝湯濃縮中藥於投 藥兩小時後，能立即促進胃黏膜的 NPSH 增加，維持胃黏膜的完整性。已知大鼠胃 黏膜的 NPSH 中，約 95 ﹪皆為 GSH[1]， 而 柴 胡 桂 枝 湯 的 成 份 中 ， 並 不 含 有 GSH[6] ，故可能藉由γ-glutamylcysteine synthetase、Glutathione synthetase 的作用使 GSH 產生增加。 相對於胃黏膜， 實驗中我們證實，於 柴胡桂枝湯濃縮中藥 250 mg/kg B.W.的劑 量下，於 WIRS 誘導 2-4 小時過程中，能 促進大鼠肝臟非蛋白質硫氫基化合物濃度 的增加。相同劑量於投藥兩小時後，亦能 使正常大鼠肝臟的非蛋白質硫氫基化合物 濃度顯著增加。此外，已知大鼠肝臟的非 蛋白質硫氫基化合物中，約 90 ﹪皆為 GSH[1]。GSH 是生物體內，細胞外最主要 的抗氧化物，經由 GSHPx 催化，可將磷脂 質過氧化物、H2O2與其他有機過氧化物分 解還原為有機醇類、酚類或水[20]。而細 胞外的 GSH 主要由肝臟產生，並分泌至血 液與膽汁之中[18,19]。藉由血液循環，肝 臟產生的 GSH 可用於維持體內各臟器抗氧 化與氧化間的平衡。故由以上可知，柴胡 桂枝湯濃縮中藥除了能用於預防胃黏膜抗
氧化物的流失，也能用於增加體內的抗氧 化能力。 由 Shian 等人藉由投予外源性的 GSH 抗氧化物，顯示能減少 WIRS 誘導過程中 大鼠胃黏膜病灶的產生，並促進胃黏膜脂 質過氧化物的減少[16]。於本研究的結果 顯示： 柴胡桂枝湯濃縮中藥於 WIRS 誘導 過程中，雖然能促進胃黏膜 GSH 抗氧化物 的增加，減少大鼠胃黏膜病灶的產生，但 無法促進胃黏膜脂質過氧化物的降低，於 投藥劑量 100 mg/kg B.W. 並會使胃黏膜脂 質過氧化物顯著增加。於無 WIRS 誘導的 正常大鼠實驗結果也顯示，柴胡桂枝湯濃 縮中藥於投藥兩小時與四小時後，皆無法 顯著的減少胃黏膜脂質過氧化物的濃度， 同樣於投藥劑量 100 mg/kg B.W. 並會使胃 黏膜過氧化物顯著增加。然而胃黏膜脂質 過氧化物的濃度的增加，是否因由於柴胡 桂枝湯濃縮中藥使胃黏膜局部的脂質過氧 化增加，或是因體內脂質過氧化物的濃度 增加? 由本研究的結果得知： 預先投予柴 胡桂枝湯濃縮中藥於 WIRS 誘導四小時 後，各劑量皆會使大鼠血漿脂質過氧化物 顯著增加。於無 WIRS 誘導的正常大鼠實 驗結果則顯示，柴胡桂枝湯濃縮中藥於投 藥四小時後，血漿脂質過氧化物為顯著減 少的情形。故由以上得知胃黏膜脂質過氧 化物濃度並不隨血漿脂質過氧化物濃度的 改變而改變，顯示兩者無直接的關係。 已知 WIRS 誘導過程中，抗氧化酵素 如 SOD、Catalase 與 GSHPx 的活性並不會 改變。因此胃黏膜脂質過氧化物濃度的顯 著增加可能是因 ROS 的生成增加所致。由 無 WIRS 誘導的正常大鼠實驗結果顯示， 無局部貧血-再灌流黃嘌呤氧化酶的作用 下，柴胡桂枝湯濃縮中藥於投藥兩小時 後，投藥劑量 100 mg/kg B.W.會使胃黏膜 過氧化物顯著增加。故我們推測柴胡桂枝 湯濃縮中藥可能會促進胃嗜中性球等炎症 細胞的活化與吸附，進而使胃黏膜的脂質 過氧化物濃度增加。 於 Hiramatsu 等人的實驗結果顯示：低 劑量 1 ﹪的柴胡桂枝湯具有自由基的性 質，但於肝臟仍具有抗氧化的功能[6]。於 Hamada 等 人 使 用 黃 芩 成 份 之 一 ， Baicalein，作為腦部自由基清除劑的研究報 告指出，Baicalein 於大腦不同部位分別顯 示降低與增加脂質過氧化物濃度的不同結 果[3]。已知柴胡桂枝湯是由柴胡、桂枝、 黃芩、半夏、人參、芍藥、生薑、大棗與 甘草共 9 味藥材組成。然而柴胡桂枝湯複 方中確實的抗氧化藥物、成份與作用機制 皆仍尚不明。柴胡桂枝湯中是否俱有自由 基性質的成份而直接造成對胃黏膜的傷 害，皆需更多研究加以釐清。 由此研究結果可知：投與柴胡桂枝湯 濃縮中藥能預防胃黏膜病灶的產生，促進 抗氧化物的增加，但於胃黏膜脂質過氧化 物方面，則無顯著的降低。故可知柴胡桂 枝湯濃縮中藥並非直接藉由減少胃黏膜脂 質過氧化來達到預防胃潰瘍的效果。雖然 於細胞與老鼠大腦的研究指出柴胡桂枝湯 具有抗氧化之功能，能減少過氧化物的產 生，促進維生素 E 氧化產物 Tocopheroxyl radical 的 還 原 ， 並 可 用 於 清 除 O2 -與·OH[5,6]。於小鼠內毒血症過程中，成 份類似藥物的小柴胡湯亦能活化肝臟 SOD 與 GSHPx 等抗氧化酵素，並增加維他命 E 與非蛋白質硫氫基化合物等抗氧化物的濃 度[13]。然而在有嗜中性球浸潤等炎症反 應因素的胃黏膜，柴胡桂枝湯似乎有不同 的作用與效果。由以上可知，柴胡桂枝湯 可能藉由活化其他胃黏膜防禦因子來達到 預防潰瘍的效果。 相較於投藥 2 至 4 小時，柴胡桂枝湯 濃縮中藥可能造成大鼠胃黏膜及血漿脂質 過氧化物濃度的增加，於本研究的結果顯 示： 長期投藥三週對於正常十週齡與正常 十月齡大鼠的胃黏膜及血漿脂質過氧化物 濃度並不會有太大影響。於正常十週齡大 鼠，柴胡桂枝湯濃縮中藥亦能促進肝臟的 非蛋白質硫氫基化合物濃度的增加。因此 柴胡桂枝湯濃縮中藥可利用於長期投予， 預防大鼠胃黏膜潰瘍與出血的產生，並能 維持大鼠體內活化氧自由基的生成與抗氧 化機制間的平衡。 五、參考文獻
1. Boyd SC, Sasame HA, Boyd MR. High concentrations of glutathione in glandular stomach: Possible implication for carcinogenesis. Science 205: 1010-1012, 1979.
quantification of microgram quantities of -protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254, 1976.
3. Hamada H, Hiramatsu M, Edamatsu R, Mori A. Free radical scavenging action of baicalein. Arch Biochem Biophys 306: 261-266, 1993.
4. Heyland DK, Mandell LA. Gastric colonization and nosocomial pneumonia: evidence for causation. Chest 101: 187-193, 1992.
5. Hiramatsu M, Edamatsu R, Kohno M, Mori A. Scavenging of free radicals by Sho-saiko-to-go-keishi-ka-shakuyaku-to (TJ-960). In: Hosoya E, Yamamura TY, ed. Recent advances in the pharmacology of KAMPO (Japanese Herbal) Medicines. Excerpta Medica, Amsterdam, 127, 1988.
6. Hiramatsu M, Velasco RD, Packer L. Vitamin E radical reaction with antioxidants in rat liver membranes. Free Radic Biol Med 9: 459-464, 1990. 7. Hirota M, Inoue M, Ando Y, Hirayama K, Morino
Y, Sakamoto K, Mori K, Akagi M. Inhibition of stress-induced gastric injury in the rat by glutathione. Gastroenterol 97: 853-859, 1989.
8. Inoue M, Ando Y, Hirota M. Role of oxygen radicals in the pathogenesis of cellular injury caused by circulatory disturbance. In: Tsuchiya M, Asano M, Mishima Y, Oda M, eds. Microcirculation-an update, Volume 1. Elsevier, Amsterdam, 685-686, 1987.
9. Inoue M, Nobukuni Y, Ando Y, Hirota M, Hirata E, Morino Y. Interorgan metabolism of glutathione as the defence mechanism against oxidative stress. In: Tanabe T, Hook JB, Endou H, ed. Nephrotoxicity of antibiotics and immunosuppressants. Elsevier, Amsterdam, 51-60, 1986.
10. Nishida K, Ohta Y, Kobayashi T, Ishiguro I. Involvement of xanthine oxidase system and neutrophils in the development of acute gastric mucosal lesions in rats with water immersion restraint stress. Digestion 58: 340-351, 1997.
11. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbitric acid reaction. Anal Biochem 95: 351-358, 1979.
12. Ohta Y, Kobayashi T, Nishida K, Nagata M, Ishiguro I. Therapeutic effect of Oren-gedoku-to extract on stress-induced acute gastric mucosal lesions in rats. Phytother Res 13: 588-592, 1999. 13. Sakaguchi S, Tsutsumi E, Yokota K. Preventive
effects of a traditional Chinese medicine (sho-saiko-to) against oxygen toxicity and membrane damage during endotoxemia. Biol Pharm Bull 16: 782-786, 1993.
14. Satoh K. Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders determined by a new colorimetric method. Clinica Chimica Acta 90: 37-43, 1978.
15. Sedlak J, Lindsay RH. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent. Anal Biochem 25: 192-205, 1968.
16. Shian WM, Sasaki I, Kamiyama Y, Naito H, Matsuno S, Miyazawa T. The role of lipid peroxidation on gastric mucosal lesions induced by
water-immersion-restraint stress in rats. Jpn Surg Today 30: 49-53, 2000.
17. Stein HJ, Hinder RA, Oosthuizen NMJ. Gastric mucosal injury caused by hemorrhagic shock and reperfusion: Protection role of the antioxidant glutathione. Surgery 108: 467-474, 1990.
18. Sugaya E. Introduction. In: Hosoya E, Yamamura TY, ed. Recent advances in the pharmacology of KAMPO (Japanese Herbal) medicines, Excerpta Medica, Tokyo , 51-55, 1988.
19. Takagi K, Okabe S. The effects of drugs on the stress ulcer in rats. Jpn J Pharmacol 18: 9-18, 1968. 20. Urisini F, Maiorino M, Valente M, Gregolin C.
Purfication from pig liver of a protein which protects liposomes and biomembranes from peroxidative degradation and exhibits glutathione peroxidase activity on phosphatidylcholine hydroperoxides. Bichem Biophys Acta 710: 197-205, 1982.
21. Yoshikawa T, Miyagawa H, Yoshida N, Sugino S, Kondo M. Increase in lipid peroxidation in rat gastric mucosal lesions induced by water immersion restraint stress. J Clin Biochem Nutr 1: 271-277, 1986.
