利用高效液相層析法對香蕉花中 β-sitosterol 及 stigmasterol

國立台東大學生命科學研究所 碩士論文

指導老師：魏百祿 博士

利用高效液相層析法對香蕉花中 β-sitosterol 及 stigmasterol

的定量研究

研 究 生：張智超 撰

中 華 民 國 九 十 七 年 七 月

國立台東大學生命科學研究所 碩士論文

利用高效液相層析法對香蕉花中 β-sitosterol 及 stigmasterol

的定量研究

研 究 生： 張智超 撰

指導教授：魏百祿 博士

中 華 民 國 九 十 七 年 七 月

謝 誌

本論文能順利完成，由衷感謝恩師魏百祿博士 ，從碩士班入學就時常請教 老師問題，也時常請教許多人生道理，修習碩士研究期間一路走來老師在學業 、 研究、生活及做人處事上給予細心指導及栽培 ，並於撰寫論文期間所給予的指 導，使本研究論文得以順利完成 ，衷心銘感謝意。

另外要感謝本校自然教育學系胡焯淳老師對於某些實驗上的指導以及啟 發，讓我受益匪淺，提點我某些想法及實驗遇到問題處理的方式，在此至上由衷 感謝。

本所的所長李炎老師，對於我生化及分生實驗方面的指教，讓我學會很多，

另外本所的劉炯錫教授、彭仁君教授，自教系林家慶老師，國立中國醫藥研究所 的邱文慧、陳建志、蔡維人、黃鈺玲博士等，諸位師長於在學期間的指導及鼓勵，

本所的助理張惠嵐小姐給予許多協助，同學、學長姊及學弟妹們的友情，一並在 此致上深深的感謝。

要感謝的人很多，無法道盡，感謝曾經幫過我的人，陪伴過我的朋友，我也 希望能夠回饋我的微薄之力為社會做一點事 。

在文章最後，我要感謝心中最親愛的父母辛苦的栽培與教養 ，感謝我的弟 弟，你們的支持與鼓勵是我最大的動力。在我心裡願與你們共同分享我小小的成 果。

最後祝大家一切順利，安好

利用高效液相層析法對香蕉花中 β-sitosterol 及 stigmasterol

的定量研究

作者:張智超

國立台東大學生命科學研究所

摘要

β-sitosterol、stigmasterol 為一個已被證實具有療效的成份 ，可控 制膽固醇、抗癌、促進攝護腺健康、增強免疫力等等。

民間常有用香蕉花食療，香蕉亦為台灣常見之植物，探討香蕉花 中有否 β-sitosterol、stigmasterol，研究其 β-sitosterol、stigmasterol 的 含量是多少，從而可以將香蕉花開發為 β-sitosterol、stigmasterol 的來 源，可提升香蕉花應用價值。

本研究所採用的研究對象為香蕉花 ，確定其含有 β-sitosterol、

stigmasterol 之後，香蕉花中 β-sitosterol、stigmasterol 定量分析是一個 具有研究價值的課題。而實驗方法主要藉由高效能液相層析搭配光二 級陣列偵測器(HPLC/DAD)分析香蕉花中 β-sitosterol、stigmasterol 成 份，此乃利用高效能液相層析對香蕉花中 β-sitosterol、stigmasterol 找 尋適當的分析條件，再進一步去對 β-sitosterol、stigmasterol 做定量分 析。

分析β-sitosterol、stigmasterol ，偵測器波長設在UV 205nm，移 動相以甲醇100%可快速分析此兩種重要之植物固醇 β-sitosterol、

stigmasterol。

平均數值，為定量結果。香蕉花1g中 β–sitosterol 含量 384.00±8.10

（

g/g）

（

g/g）

隨著現代人生活水準的不斷提高，保健意識的不斷增強，對健康 大有裨益的各種功能保健食品越來越受到人們青睞，市場需求日益增 加。因而有機會開發香蕉花為以 β-sitosterol、stigmasterol 成分為標榜 的保健食品。

關鍵字: 香蕉花，β-穀固醇、豆固醇，高效液相層析/光二級陣列偵測器

HPLC quantitative analysis of β-sitosterol and stigmasterol in banana flower

Chih-Chao Chang

Abstract

β-sitosterol 、stigmasterol are the compounds which can control cholesterol, remedy cancer, and promote prostate health, enhance immunity, and so on.

The banana is a very familiar plant in Taiwan. To investigate into the content of the β -sitosterol, stigmasterol in the banana flower can make sure whether the banana flower have β -sitosterol, stigmasterol and can analyze the determination of the abundance of β-sitosterol、stigmasterol in banana flower.

Therefore the object of this study used of the banana f lower. After confirmation that the banana flower have the contents of β-sitosterol and stigmasterol. So that I want to study on quantitative analysis of β-sitosterol、stigmasterol and in banana flower by high performance liquid chromatography with diode arr ay detector (HPLC/DAD).

The quantitative analysis results indicated that there are β-sitosterol 384.00

（

g/g）

（

g/g）

There will be a chance in the future to develope the banana flower as the functional health food with the compositions of β –sitosterol and stigmasterol.

目 錄

中文摘要

……… .

英文摘要

……… ....

目錄

……… ….

表目錄

……… ……

圖目錄

……… ...

第一章 緒論……… 1

一、前言……… .1

二、研究動機……… .2

第二章 背景資料與文獻回顧……… 4

一、香蕉植物之介紹……… 4

(一)香蕉之植物學分類……… .4

(二)香蕉植物形態特徵……… …….5

(三)香蕉開花與繁殖... ... ... 7

二、β-sitosterol、stigmasterol 介紹... ...8

(一) β-sitosterol、stigmasterol的結構... 8

(二) β-sitosterol、stigmasterol 的來源………11

(三) β-sitosterol、stigmasterol的生理功效………11

(四)植物固醇成分的萃取溶劑及條件………... 14

(五)植物固醇分析方法……… ...14

第三章 實驗材料及儀器……… ..16

二、藥品溶劑………..16

三、儀器設備……… ………..16

四、實驗使用之高效液相層析儀器………..………17

第四章 實驗方法……… ..20

一、藥品配製部份……… ..20

二、製作β-sitosterol、stigmasterol之檢量線，求線性方程式、線性 相關係數以及偵測極限……… ..21

三、儀器參數設定以及分析β-sitosterol、stigmasterol基本條件….22 四、香蕉花之樣品前處理………..22

五、移動相與β-sitosterol、stigmasterol保留時間關係探討………25

六、β-sitosterol、stigmasterol之標準添加法………26

七、針對β-sitosterol、stigmasterol精密度之測定……….28

八、針對β-sitosterol、stigmasterol回收率之測定……….28

第五章 結果與討論……… ..30

一、移動相的探討……… ..30

二、移動相與β-sitosterol、stigmasterol保留時間關係探討………34

三、香蕉花樣品前處理實驗探討……… ..37

四、β-sitosterol、stigmasterol之檢量線，線性方程式、線性相關係 數以及偵測極限……… ...42

五、β-sitosterol、stigmasterol標準添加法實驗結果………46

六、β-sitosterol、stigmasterol精密度之測定結果………48

七、回收率之測定結果……… ..49

八、探討真實樣品層析圖中β-sitosterol、stigmasterol………53

十、結論……… ..67

第六章 參考文獻……… ..68

表 目 錄

表5-1. β-sitosterol的保留時間與移動相甲醇及乙氰的配比關係 ….35 表5-2. stigmasterol的保留時間與移動相甲醇及乙氰的配比關係 …36 表5-3. β-sitosterol單獨標準品回收率……… ...49 表5-4.實際樣品β–sitosterol回收率實驗結果(A為β-sitosterol定量結 果)……… ………...50 表5-5. stigmasterol單獨標準品回收率………...51 表5-6.實際樣品stigmasterol回收率實驗結果(A為stigmasterol定量結 果)……… ...52 表5-7.香蕉花真實樣品檢液於檢量線定量結果 ………66

圖 目 錄

圖 2.1. β-sitosterol、stigmasterol 及膽固醇之結構………10

圖3-1. 高效液相層析儀器系統示意……… 18

圖3-2. HITACHI光二極體陣列檢測器 (L-2450 DAD) 的光學系統 (optical system ) 示意圖……… .19

圖5-1. 為β-sitosterol第一步萃取時間與面積關係圖 ………40

圖5-2. 為stigmasterol第一步萃取時間與面積關係圖 ………...40

圖5-3. 第二步正己烷萃取物甲醇(M)或乙氰(A)或是甲醇加乙氰(M+A =1:1 v/v)對β-sitosterol成分萃取層析峰面積比較圖 …………41

圖5-4. β-sitosterol檢量線.……… …...43

圖5-5. stigmasterol檢量線……… ...44

圖5-6. β-sitosterol標準添加曲線圖……… ……47

圖5-7. stigmasterol標準添加曲線圖……… ...47

圖5-8. β-sitosterol的標準溶液層析圖之ㄧ………....54

圖5-9. β-sitosterol的標準溶液層析圖之二………....55

圖 5-10. stigmasterol 的標準溶液層析圖………56

圖5-11. β-sitosterol、stigmasterol 2個成分的標準溶液層析圖之 ㄧ……… ….57

圖5-12. β-sitosterol、stigmasterol 2個成分的標準溶液層析圖之 二……… ..58

圖5-13. β-sitosterol、stigmasterol 2個成分的標準溶液層析圖之 三……… ..59

圖5-14. 真實樣品層析圖單獨加入 β-sitosterol 的標準品增加峰高 法……… …………..60

圖5-15.真實樣品層析圖單獨加入 stigmasterol 的標準品增加峰高

法……… ..61

圖 5-16.香蕉花真實樣品檢液層析圖之 ㄧ.………62

圖5-17.香蕉花真實樣品檢液層析圖之二 ……… .63

圖5-18.香蕉花真實樣品檢液層析圖之三 ……… .64

第一章 緒論

一、前言

自然界生物種類繁多，創造出了多種的化合物，好比中草藥的萃取物、某些植 物或真菌類的組織培養萃取物 、微生物的培養液、動物體內的多肽類和特有物種分 泌的毒液、以及某些礦物質，種類可以說是非常的多，從小分子化學單體到大的生 化分子都有各自存在的意義 。

植物本身的系統，使用不同的原料通過不同的酶 ，在植物體內形成符合某種植 物的特定功能化合物，其中某些成分是某種植物含量相對較多的 ，甚至有時候可以 發現新的結構，隨著新的結構發現，也可能發現有獨特的藥理活性的化合物，這些 背後都有脈絡可循，往往有一些有效的藥物就 是來自這些成分。

廣義來說，植物類天然物其實可以稱為植物次級代謝產物 ，有的成分來源其實 至今尚不完全清楚，但是可以知道的是，有特定的代謝路徑而產生某些類別的成分，

這些化合物涵蓋大且廣泛類型化合物 ，通常儲存在細胞的液泡中 ，例如某些植物為 了保護自己不被草食動物吃掉 ，常常會產生一些有強心作用的強心苷 ，或是有神經 毒的生物鹼，有的還會產生不愉快的氣味對某些生物會有驅離的效果 ，使自身得以 保存，可以繁殖下去，而一些植物含有萜類物質，有的萜類成分類似昆蟲激素 ，能 吸引昆蟲幫忙授粉。另外又如同真菌類通常生存於特別的環境 ，因此也有許多特殊 成分。簡單來講，植物和動物一樣是有機體 ，但是系統卻不同，可是一樣是有許多 的生合成步驟，產生出來不管是類似成分或是獨特的成分，也許有部分能夠在人體 內起到很好的作用或是調節 ，就類似成分來說，人體和植物的許多成分結構相近 ， 但不盡相同，就是因為那一點的差別，就能夠產生藥物作用的競爭抑制 ，卻沒有那 些副作用產生，往往就能達到平衡以及治療的效果 。

有的在植物體內產生的成 分，對動物是有毒的，但相對的，有的成分就有強烈 的藥理活性，隨著物種演化。人類在發展，植物也一直在發展，人類某些疾病，正 好被某種植物的某種成分 改善，其中的原因往往需要更多的研究投入才能明白 ，需 要許多對於天然物的研究 ，來找出其關聯，進一步能夠對藥物相關的開發以及藥物 來源有所幫助。

以天然物的研究對象來說，常常是以中草藥為研究對象，台灣有許多的中草藥 相關植物資源，而且也有許多台灣本島的特殊植物 ，或是台灣本土的某類植物卻含 有相對含量不同的成分，因此對台灣本地的天然物有許多研究空間 。

而所謂草藥植物在亞洲國家多指未記載的主流本草 ，多流傳於仿間，百姓口耳 相傳，在醫院不使用，只為民間所使用，且加工炮製以及來源尚欠具 體規範的輔助 藥物。對於西方而言所指的草藥 ，根據歐洲對草藥的定義，是指未經加工的生藥，

常為植物的某一部分，通常僅有一個藥理活性部分 ，如歐美常用草本保健品。

所以開發植物應用於天然物活性成分之研究 ，能夠獲得許多可用於醫藥 、健康 食品、食品添加劑的成分，許多植物化學成分可作為具有經濟價值之醫藥品 。

以應用面來說，目前治療用天然物或是中草藥方面最主要以治療癌症 、改善肝 功能、延緩老化、減肥、改善代謝以及內分泌等用途為主 ，其次為增進健康的機能 性中草藥健康食品，其餘尚有在化妝品、中藥新藥等開發，是近年來研究熱中的應 用領域。以及消費者追求天然食品 、藥品的趨勢，將帶動天然物研究的繼續進步 。

二、研究動機

香蕉是台灣一項重要的經濟作物 ，台灣鄉村田野間常能看到香蕉的蹤影，所以 香蕉在台灣農作物中佔有重要地位，每株香蕉幾乎都會有香蕉花產生 ，當摘採香蕉

果實之後的香蕉植株，包括香蕉花在內，往往一般都被廢棄不保留 ，所以香蕉花來 源廣泛易於取得，目前有關香蕉花方面成分的研究文獻很少，經過仔細評估發現有 不少研究的空間。

香蕉花坊間盛傳有許多療效，有許多患有重病的人會嘗試香蕉花食療，例如癌 症、糖尿病、高血壓等，所以香蕉花是一門研究課題 ，在實驗室研究香蕉花時，發 現許多意外的現象，即為香蕉花分離過程中，有不少白色晶體析出，認定可能為植 物固醇結晶，經過和老師的研究討論後 ，認為香蕉花中 β-sitosterol、stigmasterol 含 量，有値得研究的空間。

而 β-sitosterol、stigmasterol 是屬於植物固醇的主要成分之ㄧ，全世界至目前為 止已有許多研究顯示 β-sitosterol、stigmasterol 在一定程度上可以降低膽固醇 ，從而 預防動脈粥樣硬化、冠狀動脈硬化性心臟病等心血管疾病 ，甚至有其它方面藥理作 用陸續被確定。而植物固醇在預防癌症、防治前列腺疾病、提高免疫力、抗炎、抗 病毒等方面作用的研究也取得了一定進展 。目前，全世界植物固醇的需要量有 逐年 增加趨勢。植物固醇資源可供開發利用 ，植物固醇的來源、提取及其應用研究前景 廣闊。隨著現代人生活水準的不斷提高 ，保健意識的不斷增強，對健康大有裨益的 各種功能保健食品越來越受到人們青睞 。

因此本實驗欲利用高效液相層析儀器分析香蕉花中 β-sitosterol、stigmasterol，

並定量之。探討其含量，也可作為日後研究香蕉花的參考依據 。台灣香蕉種植數量 眾多，對台灣來說有其深遠意義，期待研究結果能夠將香蕉花 更能有效利用，也期 能夠進而造福人群。

第二章 背景資料與文獻回顧

一、香蕉植物之介紹

(一)香蕉之植物學分類

香蕉學名 Musa sapientum Linn.在植物分類學上屬芭蕉科（Musaceae），芭蕉 屬（Musa），根據香蕉的植株形態特徵及經濟性狀 ，香蕉屬一年生之果樹，為目前 臺灣最主要經濟作物之一 ，亦是農作物中外銷金額最大 ，數量最多的作物(邱等，

2007)。香蕉為熱帶及亞熱帶作物，臺灣地處亞熱帶地區，風土氣候均適宜香蕉的生 產，因此，在臺灣各地區都可以周年生產 。而臺灣香蕉品種栽培繁多 ，觀賞用的有 美人蕉、青蕉、千層蕉…等，而可供食用的品種，較普遍的如北蕉、仙人蕉、台蕉 一號、台蕉二號、台蕉三號、寶島蕉、呂宋蕉(鄧，1997)。台蕉一號為改良種，其 可耐黃葉病，屬於北蕉的改良變種，其他品種尚有紅皮蕉、粉蕉及李林蕉，李林蕉 在臺灣南部蕉園，偶有種植，市面上較少見(鄧，2001)。

被 子 植 物 門 M a g n o l i o p h y t a

單子葉植物綱 Liliopsida

薑目 Zingiberales

芭蕉科 Musaceae

芭蕉屬 Musa

(二)香蕉植物形態特徵

香蕉是一年生草本果樹，植株由地下部（球莖、根系、吸芽）和地上部（假莖、

葉、花序和果實）組成。常有側枝，且鬚根粗大。葉大型，葉柄下方之葉鞘相互合 抱成強大假莖，高可達三、四公尺。夏秋兩季開花，花軸頂端向下彎曲，上部生雄 花，基部生雌花，為雌雄同體，有時還有雌雄蕊均退化的中性花 。花序分段開出，

每段均有暗紫色苞片保護 。果實為漿果，果體上彎，成熟時外果皮變為黃色。種子 小，黑褐色。但已全部退化而無發芽能力 。故必須利用地下莖所生出的吸芽進行繁 殖，有時也可截取部分地下莖來育苗 (黃等人，2006)，香蕉主要器官形態茲分述如 下。

1.根之形態特徵

香蕉之根是地下球莖上所抽生的細長肉質根 ，分為原根及不定根兩種，原根僅 新植蕉發生，很快死亡，一般所見均為不定根，有 200-300 條，多達 500 條以上，

按根系的著生和分佈情況 ，將根系分為平生根和直生根 ，平生根大多數在地下球莖 的上部四周長出，分佈在近地面 10-30 釐米的土層裏，伸展範圍寬度可達 1-3 米，

直生根從地下球莖的下部長出 ，數量較少，幾乎是垂直向下生長 ，入土深度可達 120-150 釐米。新根為白色，老根淡黃色，根表皮是薄壁細胞組織缺乏形成層 ，質 脆易斷，根尖為幼繳的生長點，根末端不斷分生幼根，幼根尾端著生許多根毛，直 接與土壤細粒密接，吸收水分和肥料。

2.莖之形態特徵

香蕉的莖分真莖和假莖。真莖又稱球莖，形狀短圓且呈塊狀，埋沒土中或稍露 地面，呈黑褐色，是養分貯存中心，是整個植株的重要器官，生根、長葉、著生和 萌發吸芽，形成地上假莖。真莖有密集的節，葉痕繞莖成環，每一葉痕有液芽，在

生育期中萌發生長稱為吸芽。假莖即常見長在地上部的幹莖，高度 l.3-3.5 米，系由 葉鞘膨大緊密疊合而成若干同心層的圓柱 ，柔嫩、多汁，是支撐、輸導、保護幼葉 與花梗發育的器官。

3.葉之形態特徵

香蕉葉白葉鞘、葉柄及葉片組成，香蕉一生有 35－45 片葉。葉鞘生於球莖環節 上，內外面光滑，有氣孔，它組成地上部假莖：葉柄是葉鞘上端逐漸縮小形成 ，長 約 30-50 釐米，背面圓形表面溝狀；葉片長大，是光合作用主要器官，新葉本展出 之前，在假莖中心卷成簡狀，由於葉柄和葉鞘伸長形成 ，葉柄伸出假莖外，葉片即 自上而下展開。葉片面積的大小，從第一片葉到第 24 片葉逐步增大，花芽分化後發 生葉片則面積逐步縮小，花蕾抽出前的兩片葉更小 ，最後一片護蕾片幼短而鈍 。蕉 葉生長中極易橫向撕裂，然而中肋與葉緣間的維管束連接仍然完整 ，對發育影響不 大。

4.花序及花之形態特徵

香蕉花為穗狀花序，頂生，大都為雌雄同株，香蕉花是從假莖頂端葉叢中心抽 出一個大穗狀花序，花序軸密被褐色絨毛，花序上有披針狀船形、外面紫紅色白粉 內面桔紅至朱紅色有光澤的苞片，每苞片中有 8-30 朵小花成半環形狀 2 列排列，花 序完全抽出後漸漸下垂。蕉花通常分雌花、中性花及雄花三種類型，雄花長在最尾 端，中段是退化的中性花，而最前端則是雌花，只有著生在穗軸基部的雌花能結成 果實。

5.果實之形態特徵

香蕉果實是白雌花的子房發育而成 。著生於花軸上稱為果房。大多數食用蕉不 需要授粉就能結實，故稱單性結實，正常情況下果實沒有種子 。香蕉單果果柄短，

直或微彎，呈指狀稱果指，屬漿果。未成熟時果皮青綠色，催熟後為黃色。

(三) 香蕉開花與繁殖

香蕉樹幹直立、粗大，是由一層一層的葉鞘重疊圍裹而成。新葉是從假莖中心 抽出，然後在頂部展開。當生長到一定葉數，葉面積達到最大量時，植株便開始花 芽分化，由地下球莖頂端的分生組織突起分化花芽，從假莖中心抽出花軸及花蕾 ， 發育成為果軸和果穗。香蕉雖然是多年生植物，但每株只能開花果一次，而且台灣 的香蕉生命週期為一年。其後母株逐漸枯萎，由地下球莖上萌發吸芽生長接替母株，

繼續生長結果。香蕉依靠地下球莖抽出的吸芽繁殖延續 。在花芽分化前夕，地下莖 頂端分生組織向地面伸長 ，生長發育成長圓柱狀氣生莖 ，連同軸頂端形成的花蕾以 假莖中心抽出，裸露假莖的氣生莖稱為果穗軸 。地下部長有多年生的粗大球莖 ，在 球莖四周著生許多肉質根 ；球莖葉腋下長有一個潛伏芽，在營養生長中後期可能萌 發發育成吸芽，抽出土面，吸芽與母株組成了一蕉叢。當植株生長發育到一定階段 時，生長點停止抽生葉片，轉為生殖分化，形成花芽，花芽分化成熟，便從假莖頂 部中心抽出穗狀花序，先開雌花，後開雄花，雌花逐漸發育成果實。

香蕉花芽之分化，是植株從營養生長轉入生殖生長時的內在生理變化 ，整個花 芽形態分化在假莖內進行 。形態分化初期花芽原始體僅為 1-2.5 釐米，用肉眼還分 辨不出果梳，更看不到雌花。當進入形態分化中期。花芽長至約 15 釐米長時，肉眼 己可識別雌花。果指數目是在最抽蕾前 1 個月發育形成的，只有達到一定的展開的 葉面積與接收到的一定光照時數和積溫 ，才能分化花芽(黃等人，2006)。

香蕉植株一生只開一次花 。香蕉花芽分化後期形成的長卵形花蕾 ，隨地上莖向

上推移，最後從假莖頂部中央抽出現蕾 ，不久花序軸連同花蕾轉彎下垂 ，然後花苞 向上卷，雌花隨即開放。香蕉的花序為穗狀花序，頂生，屬完全花，由萼片，花瓣、

雄蕊、雌蕊組成。花序基部是雌花，中部是中性花，頂端是雄花。香蕉小花著生在 小花苞內，花梗短，花被分 2 片。生長在外側的一花被由 3 萼片、2 花瓣合生而成，

先端作 5 齒裂，淡黃色，厚膜質，稱被瓣；另一花被離生，稱遊離瓣，形狀較小，

位於合生被瓣的對方，白色透明，質較薄。柱頭肥大作拳狀，花柱棒狀白色，子房 大如指，長度是全花的 2/3，可結成供食用的果實。香蕉花的色澤，形態因品種而 異。雄蕊只有極小數品種含有花粉 。苞片一個個地卷起來，長卵形或寬卵形，暗紫 色或紫紅色，通常在開花後 1-2 大脫落，但也有一些品種苞片不脫落 ，從現蕾至斷 蕾過程，夏季需 13 天左右，冬季需 20-25 天。

二、β-sitosterol、stigmasterol 介紹

(一)β-sitosterol、stigmasterol 的結構

β-sitosterol 中 文 名 稱 為 β- 穀 固 醇 ， 而 stigmasterol 中 文 名 稱 為 豆 固 醇 。 β-sitosterol、stigmasterol 屬於植物固醇(phytosterols)的一種，植物固醇是植物某固醇 類的統稱，是一種植物衍生出之固醇類，其結構與膽固醇相似，不同點在於支鏈的 結構，而其作用類似於脊椎動物中的膽固醇。固醇另外一個名稱又叫作甾醇 ，甾這 個字源於中國為一個象形字 ，表示著這類化合物共有的結構 。植物固醇也屬於這類 結構化合物，主要是以環戊烷並多氫菲為骨架的一類物質 ，此特徵即為固醇類的基 本架構。是植物性食物中含有的類似膽固醇的物質 ，在自然界中以游離態或結合態

植物固醇屬於 4-脫甲基固醇、4-單甲基固醇和 4，4-雙甲基固醇這三種固醇中的 4-脫甲基固醇，它們可以遊離形式存在 ，如 β-sitosterol、stigmasterol 等；也可與長 鏈脂肪酸或酚酸形成酯，如米糠油（阿魏酸鹽），也有與葡萄糖之結合態。

植物固醇包括兩種形式，分為不飽和及飽和型式，分別為植物固醇和植物固烷 醇。人體攝入的植物固烷醇的量通常比植物固醇少很多 。植物固醇含量較高，植物 固烷醇含量很少，人體攝入的植物固烷醇的量通常比植物固醇少很多 。

較重要且常見的植物固醇 ，有不飽和的β-sitosterol、stigmasterol、campesterol，

而其飽和的型式為β-sitostanol、campestanol、stigmastanol，人類從日常飲食所攝取 到的植物固醇大約65%為β-sitosterol，30%為菜campesterol，其他主要為stigmasterol。

β-sitosterol、stigmasterol是最重要的植物成分之一，植物固醇類結構與膽固醇相 似，皆為一個六碳烯醇環、二個六碳烷環及一個五碳烷環所組成的固醇類 。

植物固醇常以其環狀主結構上雙鍵的位置來分類 ，大部分植物的植物固醇類在 C-5 和C-6 間含有雙鍵，僅含少部分的植物固醇類雙鍵位置在 C-7 和C-8 之間含有 雙鍵。β-sitosterol、stigmasterol為△ ⁵–sterols中最常見的的兩種植物固醇。△ ⁷–sterols 僅在少數植物中 ，如葫蘆科（Cucurbitaceae ）之南瓜及茶科 （Theaceae）之茶樹

（Breinhölder et al., 2002）。這些化合物含有27-30個碳原子，β-sitosterol、stigmasterol 主要有29個碳原子組成，而β-sitosterol和stigmasterol兩者結構上最大的差異在於其中 接在C-17碳上的側鏈 差了1個雙鍵 ，β-sitosterol 只在C-5 和C-6 間含有雙鍵 ，而 stigmasterol 則 在 C-5 和 C-6 間 含 有 雙 鍵 外 ， 在 C-17 侧 鏈 上 也 有 一 個 雙 鍵 。 β-sitosterol、stigmasterol為最重要的植物固醇種類結構如 圖2.1。

(A)膽固醇(cholesterol)

(B)β-穀固醇(β-sitosterol)

(C)豆固醇(stigmasterol)

圖 2.1.β-sitosterol、stigmasterol 及膽固醇之結構 (A)膽固醇(cholesterol) (B)β-穀固醇(β-sitosterol)

(C)豆固醇(stigmasterol)

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(二)β-sitosterol、stigmasterol的來源

β-sitosterol、stigmasterol屬於植物固醇，植物固醇類在植物中為構成細胞膜的重 要成分，它廣泛存在於植物中，水果和蔬菜中植物固醇含量通常很少，核果類和植 物油的植物固醇含量較高，日常生活中所攝取的植物固醇主要來自於大豆、玉米及 其他一些常見植物油。其中以蔬菜油中含量最為豐富 ，所以植物油及含油食品是植 物固醇的主要天然來源，其次是穀物、穀物製品及堅果（Moreau et al.,1994）。

(三)β-sitosterol、stigmasterol的生理功效

β-sitosterol、stigmasterol 為植物固醇的主要構成分之一 ，植物固醇能夠抑制人 體對膽固醇的吸收、促進膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生合成等，且於動物實 驗上被發現具有抑制心血管疾病的功能 ；植物固醇還具有抗癌、抗腫瘤、消炎、提 高免疫、調節生長、抗病毒等作用，分別於後詳述。

植物固醇亦可用作食品抗氧化劑。由於人體內無法合成植物固醇 ，也不能由膽 固醇轉化而成，只能由食物中攝取。自 20 世紀 50 年代發現植物固醇具有降低血漿 膽固醇作用以來，主要將其作為降膽固醇藥物和功能性食品添加劑使用 。隨著對植 物固醇的深入研究和廣泛應用 ，其他相關藥理作用作用正逐步被研究者所研究出 來。而且美國食品藥品監督管理局也已於 2000 年批准了含植物固醇類物質的功能 性保健食品。

1.對膽固醇的影響

食物中所含的膽固醇，一部分是與脂肪酸結合的膽固醇酯 ，另一部分是游離態

的。胰液和腸液中均含有膽固醇 酯酶，在腸道內催化膽固醇酯水解，產生游離的膽 固醇和脂肪酸。

膽固醇為脂溶性物質，故必須借助膽鹽的乳化才能在腸內吸收 。但是吸收的膽 固醇約有三分之二在腸粘膜細胞內經酶的催化重新酯化 ，形成適合體內需要的膽固 醇酯。再與部分未酯化的游離膽固醇、磷脂、三酸甘油酯及由腸粘膜細胞合成的脫 輔基蛋白一起形成乳糜微粒 ，經淋巴系統進入血液循環 。

β-sitosterol、stigmasterol 可以降低膽固醇，原因在於植物固醇可能改變了脂質 的代謝(Coleman et al.,2002）。植物固醇具有抑制小腸中膽固醇的吸收及內生性膽固 醇的合成，因此降低了血清中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）之含量(Ling et al.,1995）。另外，攝取植物固醇，並未發現會造成血清中低密度脂蛋白（LDL-C）

含量的降低，植物固醇降低血清中膽固醇的機制並不清楚 ，其可能的機制在於小腸 中微溶的膽固醇，因植物固醇的存在而沉澱，形成無法吸收的狀態，因為膽固醇必 須進入 由膽鹽 及磷脂 質所形 成的微 膠體 ， 才能被 小腸細 胞吸收 而進入 血液中

（Piironen et al.,2000）。

然而另一個理論為，其與膽固醇互競爭融入微膠體 ，因而減少了膽固醇的吸收

（Miettinen et al., 1990）。另外，血漿中的 β-sitosterol 的濃度高低，與飲食中吸收 膽固醇有正相關性，而與人體自行合成，以及從膽汁及糞便中排出的膽固醇有負相 關性，因此推論，血液中植物固醇含量應該可以當做膽固醇吸收 ，以及自行合成的 一個明顯指標(Ikeda et al.1988a）。

2. 抗癌活性

植物固醇具有抗大腸或直腸腫瘤的活性 。推論膽固醇經腸道微生 物的作用所產生之代謝物 ，是引發大腸或直腸腫瘤的原因之一 ，而

β-sitosterol、stigmasterol 會促使膽固醇本身直接排出體外 ，而減少腸道微生物對膽 固醇分解時間 ，因此可預防此類疾病的產生 (Ling et al.,1995）。也有文獻指出 β-sitosterol、stigmasterol 具有抗結腸癌、乳癌和前列腺癌的功能（Awad et al., 1998）， 也可降低肺癌發生的機率 （Milgate et al.,1995）。

針對膳食中植物固醇攝入與乳腺癌發生的相關性進行了流行病學研究 ，結果表 明食用高植物性和低動物脂肪性食物 （植物固醇，8～12 µmol/L）的日本人群的乳 腺癌發病率較低。相比之下，食用低植物性和高動物脂肪性食物 （植物固醇，2～6 µmol/L）的西方人群（美國和北歐）的乳腺癌發病率較高；紐約膳食研究機構對西 方婦女卵巢癌發生與 β-sitosterol、stigmasterol 攝入量的相關性進行了研究 ，結果顯 示膳食中 β-sitosterol（478～861 mg/d）、stigmasterol（>23 mg/d）的攝入與卵巢癌的 發生都呈現負相關性(Ling et al.,1995）。

3. 其他生理功能

β-sitosterol、stigmasterol 的生理功能的研究許多都著重於降低膽固醇的效果 。 一些研究指出，β-sitosterol、stigmasterol 可能具有抗發炎（Lembcke et al., 2005）、

防止胃潰瘍（Zhang et al., 2006），但功效侷限於動物實驗 。在動物試驗中發現 β-sitosterol 可以抑制血小板的凝集，因此具有抗動脈硬化的效果（Ju et al., 2004）。

目前大多數天然類固醇具有重要的生理活性 ，已廣泛運用於現代醫學治療用途 上；而許多人工合成之類固醇則以天然固醇的結構為藍本而被製造出來 。目前合成 類固醇主要用於抗荷爾蒙藥物 、麻醉劑、抗發炎藥物、抗癌藥物、治療心血管疾病 藥物等。部分合成類固醇醫藥品的粗原料主要來自數種天然動植物中所抽取的物 質，也包含β-sitosterol及stigmasterol。

(四)植物固醇成分的萃取溶劑及條件

β-sitosterol、stigmasterol 其分析方法是參考膽固醇的分析方法，將樣品以溶劑 萃取出脂質及固醇後，再加入鹼進行皂化，經由衍生，最後以氣相層析儀分析其含 量 。 常 用 來 萃 取 游 離 態 及 酯 化 態 的 植 物 固 醇 的 溶 劑 為 己 烷 (hexane) 而 醣 化 態 (glycoside form)則必須增加溶劑的極性；在萃取玉米纖維(corn fiber)中的植物固醇則 以己烷、二氯甲烷、乙醇、異丙醇等來萃取，萃取率在95﹪以上(Piironen et al.,2000)。

植物固醇的型態，除了與膽固醇相同有游離態 (free form)及酯化態(ester form)另外還 含有醣化態(glycoside form)，醣化態中的acetal bond在鹼的環境下不能進行水解，若 只以鹼皂化則會使所測得的植物固醇含量偏低 ，因此在植物固醇皂化前必須先利用 酸作水解以去除醣基 ，而利用這樣的方法證實 可增加植物固醇的萃取量 ，其中 stigmasterol 增加9-39﹪、sitosterol增加22-42﹪；因此，之後的研究則大都以此方法 作為模式(Jonker et al.,1985)。探討影響植物固醇分析量的因素 ，發現最佳的分析方 法是在皂化進行之後加入內標準品，之後利用氯仿萃取，如此之回收率最高(Toivo et al.,2000)；在酸水解後直接加入鹼進行皂化並以甲苯 (toluene)作萃取溶劑(Jonker et al.,1985)。以酸水解時間為60 分鐘，再以hexane：diethyl ether (1：1，v/v)萃取出自 由及酯化態的植物固醇，配合30 分鐘的皂化，皂化完以環己烷(cyclohexane)萃取的 實驗流程，測得植物固醇含量最高 (Toivo et al.,2001)。

(五)植物固醇分析方法

1.氣相層析法(gas chromatography,GC)：

氣相層析法為分析植物固醇最常使用的分析方法 之ㄧ，從充填管柱 (packed

(glass-silica)及熔融矽(fused-silica)兩種，其固定相分別為塗佈式(coated)及化學固定 式(chemically bonded) ；熔融矽毛細管管柱因為耐久性及固定性較好所以應用較廣 泛。

2.高效能液相層析法(high-performance liquid chromatography, HPLC)：

近 幾 年 來 發 展 出 利 用 液 相 層 析 法 通 常 使 用 正 相 (normal-phase) 或 者 逆 相 (reversed-phase)管柱分析固醇類，液相層析法優於氣相層析法在於液相層析法管柱 需加熱的溫度較低，且其偵測器對於樣品沒有破壞性 ，因此適合於熱不安定的固醇 類。

主要說明幾個高效能液相層析法(HPLC)分析 β-sitosterol、stigmasterol 的方式。

取一定量正己烷萃取物溶於 CH3CN 中，以 HPLC 定量分析，分析條件如下：

管柱：Discovery® HS C18（25 cm-4.6 mm,5μm），流動相：CH3CN：MeOH = 50：

50（v/v），偵測器：UV-Visible 205 nm，,流速：1 mL/min，進樣體積：10μL (Moreau et al., 1996)。

實 驗 分 析 β-sitosterol 經 過 皂 化 再 經 正 己 烷 萃 取 ， 使 用 儀 器 ： Agilent1100 (America)，G1314AVWD UV，使用管柱：Hypersil ODS (10mm-4.6mm，5μm)，偵 測波長：210nm，定溫：35 ℃ ，移動相：純甲醇，流速：0.7 mL/min 進樣量：20μL (江等，2004)。

另外，實驗分析 β-sitosterol、stigmasterol、campesterol 時使用儀器： Agilent1100 (America)，G1314AVWD UV，使用管柱： Hypersil ODS (15mm-4.6mm，5μm)，偵 測波長：210nm ，定溫：35 ℃ 流動相：純甲醇,流速：0.7 mL/min^-，進樣量：20μL (許等，2003)。

第三章 實驗材料及儀器

一、植物採集

實驗所使用之香蕉花是採集自台灣屏東的台蕉一號香蕉種，以香蕉花為實驗研 究對象，並收集於實驗室乾燥處保存。

二、藥品溶劑

1.甲醇(Methanol)，HPLC級，Mallinckrodt。

2.乙氰(Acetonitrile)，HPLC 級，Mallinckrodt。

3.水(water)，HPLC級，晧峰。

4.β-sitosterol標準品(S1270-10MG)，SIGMA。

5.stigmasterol標準品(SI-S2424-1G)，SIGMA。

6.樣品過濾器：Millex-HV 0.45 µm, PVDF, 33 mm，Millipore。

三、儀器設備

1.粉碎機：RT-08，榮聰。

2.超音波振盪清洗器︰LEO-803，力鴻。

3.電子分析天平︰Denver instrument。

4.減壓濃縮機︰

主要組成為：旋轉抽器裝置：N-1000，Eyela、數位控溫水浴：SB-1000，Eyela、水

壓抽氣機：Aspirator A-3S，Eyela、冷卻水循環器：CA-2000，Youpro。

5.高效液相層析儀(High-performance Liquid Chromatography ；HPLC)：

儀器主要組成為：液相層析溶劑輸送幫浦(Solvent Delivery Pump)：L-2130，Hitachi、

二極體列陣檢測器(Diode Array Detector)：L-2455，Hitachi、層析管柱Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6mm ,5μm)，KANTO CHEMICAL、手動進樣器：Rheodyne 7725i。

四、實驗使用之高效液相層析儀器

高效液相層析為液相層析法，是一種流動相為液相的層析技術，在經典的液相 層析法基礎上，使用較高效率且精密的儀器 ，而開發出來的一種有別於傳統液相層 析的技術，在技術上採用高壓幫浦、高效固定相管柱和高靈敏度檢測器 ，實現了分 析速度快、分析效率高和操作自動化或半自動化等特點 。

高效液相層析儀器系統，如圖 3-1 所示，主要是用高壓幫浦，將具有不同極性 的溶劑作為移動相，輸送入裝有固定相的層析管柱，再經進樣器注入樣品，由移動 相帶入管柱內，在管柱內各成分被分離後依分離效果不同先後進入檢測器 ，產生的 信號，偵測器系統見圖 3-2。訊號經訊號處理系統處理及放大訊號 ，之後再記錄於 電腦中，經軟體處理呈現。

脫氣裝置 高壓幫浦 手動進樣器 管柱 檢測器 收集器

流動相儲存 控制系統 數據處理系統

圖3-1.高效液相層析儀器系統示意圖

實驗所用儀器系統主要組成主要包括有 ，高壓幫浦(pump)可以抽取移動相，以及使 移動相保持一定壓力進入管柱系統 ，通常幫浦的功能可混合移動相以及達成梯度流 洗功能，幫浦部分附有脫氣裝置(degasser)可以將移動相的氣泡排除。樣品注入部 分，使用手動進樣器(manual injector) ，而手動方式需使用液相層析的進樣針，將樣 品打入手動進樣器。後方則為高效液相層析儀器管柱部 分，管柱之後連接光二極體 陣列偵測器進而紀錄信號，由電腦做數據處理，產生層析圖形。

圖 3-2. HITACHI 光二極體陣列偵測器(L-2450 DAD)的光學系統(optical system )示意 圖(Hitachi High-technologies Corporation,2006)

此圖主要說明二極體列陣檢測器的光學系統 ，首先光線通過試樣池，後由一系列分 光技術，使所有波長的光在接收器上同時被偵 測。其光源部分(light source)，主要是 由兩種燈泡組成，分別為氘燈(D2 lamp)和鎢燈(W lamp)，此外除了這兩種光源偵測 器內部還有汞燈(Hg lamp)，其功能主要是用來效正光源發出的波長是否正確，經過 轉換鏡使得由氘燈或鎢燈的光束得以效正，以確保波長的正確性。而後光源發出的 光線在經由聚焦鏡(converging mirror)聚集光線穿過流通池 (flow cell)，後方有狹縫 (slit)裝置可對光具有選擇性，接著在經過光柵(grating)收集一段範圍的波長光訊號到 達光二極體陣列(photodiode array)後，轉換光訊號為電子信號，再由電腦做訊號處理。

第四章 實驗方法

一、藥品配製部分

(一)配製β–sitosterol標準溶液方式

首先配製β–sitosterol 500 ppm 之標準溶液10mL，利用精密電子天秤 ，精秤 5.00mg 之β–sitosterol標準品，置於10mL定量瓶，加入甲醇8mL 後，於超音波震盪 器震盪3min，達室溫後，加甲醇補至標線，即得500 ppm 之標準溶液，將此溶液以 室溫保存備用。

稀釋此標準溶液，分別配製250、125、100、50、10 ppm，此配製方式容易操 作，不需分次量取標準品，可減少分別配製產生之誤差，原標準溶液配置必須仔細 精密。

(二)配製stigmasterol標準溶液方式

首先配製stigmasterol 1000ppm 之標準溶液10mL，利用精密電子天秤 ，精秤 10.00mg 之stigmasterol標準品，置於10mL定量瓶，加入甲醇8mL 後，於超音波震 盪器震盪3min，達室溫後，加甲醇補至標線，即得1000 ppm 之標準溶液，將此溶 液以室溫保存備用。

稀釋此標準溶液，分別配製350、250、150、50、5 ppm，此配製方式容易操作，

可減少分別配製產生之誤差 。

二、製作β–sitosterol、stigmasterol之檢量線，求線性方程式、

線性相關係數以及偵測極限

(一) 製作 β–sitosterol 標準品之檢量線，求線性方程式、線性相關係 數

準備不同濃度各別為 250、125、100、50、10ppm 之β–sitosterol標準溶液，利 用高效液相層析儀進行分析檢測 ，並求出β–sitosterol之線性範圍、線性方程式及線 性相關係數。

(二) 製作 stigmasterol 標準品之檢量線，求線性方程式、線性相關 係數

準備不同濃度各別為 350、250、150、50、5ppm 之stigmasterol標準溶液，利 用高效液相層析儀進行分析檢測 ，並求出stigmasterol之線性範圍、線性方程式及線 性相關係數。

(三) β–sitosterol、stigmasterol於高效液相層析儀偵測極限測定測定

將β–sitosterol、stigmasterol標準溶液濃度稀釋數次，利用高效液相層析儀去做 偵測，從層析圖訊雜比等於3時，得出偵測極限。

三、儀器參數設定以及分析β–sitosterol、stigmasterol基本條件

實驗之高效液相層析系統中 ，所使用管柱為Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6，

5μm），屬於反相管柱，所使用的移動相，分別為甲醇、乙氰、純水(皆為層析等級) 。 於實驗室操作時移動相 之儲存，具體步驟為，將4公升包裝的層析級甲醇和乙 氰，置入高效液相層析儀器輸送移動相 之管路，利用前端過濾頭達到過濾移動相溶 液的作用。於溶液包裝瓶開口處用parafilm封起來以防止有機相揮發或是細菌及微生 物或其他雜質污染。

所使用的高效液相層析儀為日本 HITACHI之高效液相層析儀器搭配光二極體 陣 列 偵 測 器 (HPLC/DAD) 的 液 相 層 析 儀 器 ， 搭 配 日 本 KANTO CHEMICAL 的 Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6，5μm）高效液相層析管柱進行偵測分析 。

移動相首先用甲醇、乙氰、水(皆為層析級)進行除氣(purge)，以流速9.999mL/min 依序除氣5分鐘，除去移動相經濾頭及管路中產生的氣泡，及除去移動相本身含有的 氣體，若不經除氣，會產生許多雜訊以及其他干擾問題。

至正式分析前，以甲醇進行活化1小時，使用流速1.0mL/min，若基線(baseline) 不穩定，將流速設定0.5mL/min 沖提至基線穩定。再利用流速1.0mL/min 之甲醇為 移動相，進行分析。

光二極體陣列偵測器可同時偵測一個波長範圍，將波長範圍設定在205nm 針對 β–sitosterol、stigmasterol做偵測，得此波長下的層析圖。

四、香蕉花之樣品前處理

實驗對象為香蕉花，針對β–sitosterol、stigmasterol 此欲研究之成分性質，到能

夠分析之待測樣品，需經過樣品前處理步驟，主要可分為幾個方面。

(一)新鮮香蕉花植物處理

新鮮香蕉花將其外層紫色葉片剝除，收集其內層排序之香蕉花，取得後做潔淨 之工作，將取得之香蕉花置於乾燥處陰乾，欲加快乾燥時，可以不超過30 ^oC低溫加 烘1至數小時不等。

選取乾燥完整形態之香蕉花，將之以粉碎機中磨成粉末，分次打粉，務求粉末 均勻且較顆粒較細，再將粉末徹底均勻攪拌，這樣可以減少香蕉花不同植株造成的 誤差，將之收集50g供高效液相層析儀實驗分析備用 。

(二)高效液相層析實驗之樣品前處理方式

樣品前處理方式為溶液萃取 ，依據β–sitosterol、stigmasterol的性質﹐分兩步驟 萃取﹐第一步以正己烷萃取初步萃取物 ﹐第二步為正己烷萃取物的 β–sitosterol、

stigmasterol成分萃取。

1.第一步萃取萃取方法：

秤取實驗所需克數香蕉花粉末 ，置於實驗所需100ml血清瓶中，加入正己烷

(hexane)，將之放入超音波震盪器之中萃取，設置實驗所需溫度40^oC，待震盪1小時

取出，靜待 5 分鐘，待細微粉末沉澱，將萃取液用濾紙過濾，濃縮至完全除去正己 烷，得第一步之正己烷萃取物。

2.第二步萃取方法：

將所得到之正己烷萃取物於3 ml的乙氰做第二次超音波震盪萃取 ，溫度設定55

oC，萃取時間15分鐘，取出乙氰萃取液，用Millex-HV 0.45 µm, Millipore之濾頭過濾，

反覆兩次，收集於同一10ml的定量瓶中，再加入甲醇補至標線，得前處理完成之樣 品溶液。

(三)針對第一步萃取溶液所做的探討實驗

研究超音波震盪之萃取時間對β–sitosterol 層析圖峰面積的影響。準備同一批香 蕉花粉末，均勻搖散使粉末分佈平均 ，秤取1g香蕉花粉末5分，分別至於5個100mL 血清瓶中，各加入100mL正己烷，分別於40^oC以超音波震盪萃取，分別計時1分、5 分、30分、1小時、2小時分待各別震盪萃取時間取出，個別靜待5分鐘，等待超音波 震蕩完香蕉花懸浮粉末沉澱後，將正己烷萃取液用濾紙過濾 ，於濃縮瓶中濃縮至體 積變小，在將之換入50mL樣品瓶中，作最後濃縮，至完全除去正己烷，得到的萃取 物再用3mL乙氰做第二次超音波震盪萃取 ，溫度設定55 ^oC，萃取15分鐘後，反覆兩 次，取出乙氰萃取液，用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭過濾後，收集於同一個 10mL定量瓶中，再加入甲醇補至標線。以待高效液相層析儀做層析圖 之分析，比較 其不同超音波震盪時間的 β–sitosterol層析鋒面積。

(四)針對第二步正己烷萃取物的 β–sitosterol成分萃取所做探討

針對乙氰和甲醇對於正己烷萃取物之萃取對 於β–sitosterol之層析圖峰面積的 影響，具體方法為，先秤取1g香蕉花粉末，置於100mL血清瓶中，加入100mL正己

烷，在攝氏40 ^oC以超音波震盪萃取30分鐘後，靜待5分鐘，待超音波震蕩完香蕉花 懸浮粉末沉澱後，將正己烷萃取液用濾紙過濾收集，用100mL分為三分，每分30mL，

換入50mL樣品瓶中濃縮，至完全除去正己烷，得到第一步正己烷萃取物。接著正己 烷萃取物分別用移動相之一的乙氰與甲醇作為萃取溶液 ，對於正己烷萃取物做萃取 所得出之β–sitosterol鋒面積比較，分別用5mL100%乙氰、50%乙氰2.5 mL+50%甲醇 2.5 mL、5mL100%甲醇這三種配比，做第二次萃取，溫度設定55 ^oC，分別萃取15 分鐘後，取出三種萃取液，用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭過濾後，至於10mL 定量瓶中，在分別用乙氰2mL100%乙氰、50%乙氰1 mL+50%甲醇1 mL、2mL100%

甲醇萃取5分鐘後用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭過濾後再收集於個別之前的 定量瓶中，再加入甲醇補至標線。再用高效液相層析儀去做層析圖的分析 ，比較其 不同萃取方式的β–sitosterol層析鋒面積。

五、移動相與β–sitosterol、stigmasterol 之保留時間關係探討

(一)分析β–sitosterol的保留時間與移動相甲醇、乙氰的配比關係

取β–sitosterol標準品溶液，使用管柱Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6，5μm）為 反向層析管柱，進行偵測分析，調整流動相為甲醇：乙氰 (100：0 v/v) 、甲醇：乙 氰 (80：20 v/v) 、甲醇：乙氰(60：40 v/v) 、甲醇：乙氰.(50：50 v/v) 、甲醇：乙 氰. (30：70v/v) 、甲醇：乙氰. (0：100 v/v)，比較不同比例的乙氰與甲醇為移動相 時，層析圖的β–sitosterol 峰保留時間。

(二)分析stigmasterol的保留時間與移動相甲醇 、乙氰的配比關係

取stigmasterol標準品溶液，使用管柱Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6，5μm）為 反向層析管柱進行偵測分析，調整流動相為甲醇：乙氰 (100：0 v/v) 、甲醇：乙氰 (95：5 v/v) 、甲醇：乙氰(90：10 v/v) 、甲醇：乙氰.(80：20 v/v) 、甲醇：乙氰. (75：

25v/v) 、甲醇：乙氰. (70：30v/v) 、甲醇：乙氰. (60：40v/v)，比較不同比例的乙氰 與甲醇為移動相時，層析圖的stigmasterol峰保留時間。

(三)香蕉花真實樣品中β–sitosterol、stigmasterol成分之分析

採用前處理之第一步萃取方法，秤取1g香蕉花粉末，收集在100mL血清瓶中，

搖散使之均勻分佈，加入100mL正己烷於裝有樣品粉末的血清瓶中，以超音波震盪 處理1hr，取出後將正己烷萃取液和殘渣用濾紙過濾分離，將之濃縮得正己烷萃取物。

得到之正己烷萃取物再用 3mL乙氰做第二次超音波震盪萃取 ，溫度設定55 ^oC，

萃取15分鐘後，反覆兩次，取出乙氰萃取液，用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭 過濾後，收集於同一個10mL定量瓶中，再加入甲醇補至標線。利用高效液相層析儀 進行分析檢測成分及定量探討。

六、β–sitosterol、stigmasterol之標準添加法

當樣品基質可能影響欲分析之成分，或其影響為未知時，可使用標準添加法。

首先必需製備一分香蕉花真實樣品溶液，秤取1g香蕉花粉末，收集在100mL血清瓶 中，搖散使之均勻分佈，經前處理正己烷萃取步驟，得正己烷萃取物，得到之正己

烷萃取物再用3mL乙氰做第二次超音波震盪萃取，溫度設定55 ^oC，萃取15分鐘後，

反覆兩次，取出乙氰萃取液，用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭過濾後，收集於 同一個10mL定量瓶中，再加入甲醇補至標線。得到實驗之香蕉花真實樣品溶液，供 後續實驗使用。

(一) β–sitosterol標準添加實驗

將製備得之香蕉花真實樣品溶液 分為6分，分別置入10mL定量瓶，分別於6個 10mL定量瓶中加入1mL香蕉花檢品溶液，取其中5個裝有1mL香蕉花真實樣品溶液 之定量瓶，分別加入1mL不同濃度之β–sitosterol標準品溶液，濃度分別為 250、125、

100、50、10ppm，及一個未添加標準品溶液之香蕉花 真實樣品溶液1mL之定量瓶，

最後將全部的6瓶處理好的定量瓶，加入甲醇至標線定容之。偵測後以添加濃度對反 應峰面積做圖，算出標準添加線性方程式，依標準添加曲線得出β–sitosterol之濃度。

(二)stigmasterol標準添加實驗

將製備得之香蕉花真實樣品溶液分為 6分，分別置入10mL定量瓶，分別於6個 10mL定量瓶中加入1mL香蕉花檢品溶液，取其中5個裝有1mL香蕉花真實樣品溶液 之定量瓶，分別加入1mL不同濃度之stigmasterol標準品溶液，濃度分別為 350、250、

150、50、5ppm，及一個未添加標準品溶液之香蕉花真實樣品溶液 1mL之定量瓶，

最後將全部的6瓶處理好的定量瓶，加入甲醇至標線定容之。偵測後以添加濃度對反 應峰面積做圖，算出標準添加線性方程式，依標準添加曲線得出stigmasterol之濃度。

七、針對β–sitosterol、stigmasterol 精密度之測定

實驗採手動進樣方式，分別取100 ppm 之β–sitosterol、stigmasterol標準溶液，

各別進樣注射β–sitosterol、stigmasterol 標準溶液，待注射完成，利用高效液相層析 儀進行分析其β–sitosterol、stigmasterol 層析峰面積，並於同一濃度之同一個樣品標 準液，重複上述實驗步驟5次，每次間隔平衡時間5分鐘。

八、針對β–sitosterol、stigmasterol 回收率之測定

(一)β–sitosterol標準品回收率之測定

分別取1.50、1.00、0.75mg 之β–sitosterol標準品，進行樣品前處理之第一步及 第二步萃取。經過前處理的第一步及第二步萃取步驟後 ，得到樣品溶液，再用高效 液相層析儀去做層析圖的分析 ，計算β–sitosterol標準品回收率。

(二) β–sitosterol實際樣品回收率測定

分別秤取2.00、1.30、0.50、0.20mg β–sitosterol 標準品，再分別秤取1g香蕉花 粉末各4分，將秤取之不同量β–sitosterol 標準品分別加入秤取1g香蕉花粉末之中，

收集於100mL血清瓶中，搖散使之均勻分佈，利用高效液相層析儀進行分析，計算 β–sitosterol標準品回收率。

(三) stigmasterol標準品回收率之測定

分別取2.50、1.50、1.00mg之stigmasterol標準品，進行樣品前處理之第一步及 第二步萃取。經過前處理的第一步及第二步萃取步驟後 ，得到樣品溶液，再用高效 液相層析儀去做層析圖的分析 ，計算stigmasterol標準品回收率。

(四) stigmasterol實際樣品回收率測定

分別秤取3.00、1.50、1.00、0.50mgβ–sitosterol 標準品，再分別秤取1g香蕉花 粉末各4分，將秤取之不同量β–sitosterol 標準品分別加入秤取1g香蕉花粉末之中，

收集於100mL血清瓶中，搖散使之均勻分佈，利用高效液相層析儀進行分析 ，計算 stigmasterol標準品回收率。

第五章 結果與討論

高效液相層析方法適用於分離非揮發性及熱不穩定性分析物 ，對分析植物成分 而言有較廣的應用。高效液相層析由於靈敏度高 ，因此可用來對植物固醇較準確定 量及分析。儀器系統條件或參數以及成分化合物的相對關係，是層析實驗裡面很重 要且需要探討的因素。

要考量 香蕉花中樣品 β–sitosterol 、stigmasterol 結構，香蕉花前處理方式 ， β–sitosterol、stigmasterol 於高效液相層析之分析條件 ，以及相關之移動相探討，而 香蕉花含有之其他不同性質基質成 分，會和β–sitosterol、stigmasterol 互相干擾，因 此對於香蕉花分析β–sitosterol、stigmasterol，必須掌握香蕉花β–sitosterol、stigmasterol 的分析條件。

另外，實驗分析條件會隨成分性質及所使用儀器之差異，以導致於參考條件不 見 得 適 用 ， 因 此 必 須 針 對 實 驗 所 使 用 之 高 效 液 相 層 析 儀 器 ， 和 β–sitosterol 、 stigmasterol 之間利用實驗找尋最適條件。而且必須考量到儀器測量的精密度及靈敏 度，整體實驗的準確性。

一、實驗系統之移動相探討

(一)移動相條件的找尋以及探討

實驗之高效液相層析儀其使用方式為，將分析樣品利用手動進樣之方式 ，注入 進樣器中，利用高壓幫浦使移動相進入管柱前通路，而使分析樣品進入管柱部分，

藉由不同性質的移動相及固定相 ，而進行分離。因分析物通過偵測器之時間不同，

故可由分析之層析圖中依保留時間來判斷成分 。

通常移動相的選擇是分析時必須確認的 ，找尋良好的移動相條件是很重要的，

分析的條件要能夠讓之後的 分析成分定量順利進行。其實植物的成分有基原物質會 干擾分析成分，時常無法找尋絕對理想之移動相條件，只能夠找尋相對較理想之移 動相條件，所以適合於香蕉花的分析條件不一定適用於其他植物 。

用於反相管柱C-18 之移動相，最常使用為甲醇，乙氰以及水，這三種極性最高 是水，最低為乙氰，於C-18 之高效液相層析分析型管柱，常使用三者的搭配去找尋 最適條件。

(二)移動相的壓力方面探討

實 驗 使 用 之 Hitachi高效液相層析儀 ， 高壓壓力可以到達

150~300kg/cm²。實驗時，若是乙氰單獨使用管柱壓力較低，可達三種移動相最低，

不會高於100 kg/cm²。

管柱內承受的壓力，會根據有機溶劑的種類或混合比率的不同而有差別 ，若是 使用水/乙氰，水/甲醇混合液的比率與管柱壓力的升高有很大的關 聯性，而水/甲醇 混合，壓力會變的較高，水/乙氰混合同樣會增高壓力但不會 如水/甲醇那麼高。所 以，相同之流速下使用乙氰/甲醇管柱內壓力不會上昇太多。找尋理想分析條件又不 讓柱壓上升過高，實驗時常會使用乙氰/甲醇分析。

(三)甲醇與水配比情形

實驗操作時，因有機溶劑移動相和水配比會使柱壓上升 ，尤其在水比甲醇50：

50(V/V)時，分析β–sitosterol、stigmasterol 實驗時，有數次瞬間超過儀器設定的上限

值200kg/cm²。

分析β–sitosterol、stigmasterol時，用水去作移動相保留時間大增，純水為移動 相結果為未出峰，若水和甲醇配比使用甲醇/水98：2時β–sitosterol、stigmasterol保留 時間足足晚了20分鐘，水提升到5%β–sitosterol、stigmasterol保留時間就超過一小時 了，所以以水為移動相並不理想 。

(四)乙氰與水配比情形

因為水會讓柱壓上升，尤其是在水比乙氰50：50(V/V)時，壓力仍有數次瞬間 超過管柱設定的上限值200kg/cm²。而且當用水比乙氰50：50(V/V)時未滯留性物質 的無感時間延長2分鐘左右，尤其是分析β–sitosterol、stigmasterol時，只要用到配比 到水或乙氰時，分離的β–sitosterol、stigmasterol 保留時間會增加，這是植物固醇一 種較奇特的現象，分析β–sitosterol、stigmasterol使用水為移動相或和乙氰或甲醇配 比保留時間及不確定因素皆增大。

(五)三種移動相對β–sitosterol、stigmasterol的流洗能力探討

一般而言，移動相流洗力有一定的規則，C-18 管柱是屬非極性填料，理論上來 說乙氰流洗力較強。乙氰和甲醇分別用同樣的比率與水混合時 ，一般情況下，乙氰 的洗脫能力會比較強。

然而β–sitosterol、stigmasterol 或是真實樣品分析實驗，以單一有機溶劑作為移 動相時，移動相不和水配比，分析β–sitosterol、stigmasterol 實驗結果顯示，純甲醇 為移動相時保留時間最短 ，可推測甲醇的流洗能力最強。另外若增加和水配比，誤 差變大，保留時間變長，平衡時間也較長。

若使用乙氰去分析，不如甲醇分析時保留時間快速，可以推測流洗能力較甲醇 弱，所以以純甲醇為較佳之分析條件。

所以有關影響分離效果的因素，三者有所差異，乙氰和甲醇在分離的選擇性上 不同 。 由於有 機溶劑 分子的 化學性 質和樣 品性質 不同所 致 ， 尤 其植物 固醇類 β–sitosterol、stigmasterol最顯著的就是極性端OH基以及側鏈的非極性端為其主要 性 質，雖然乙氰對於β–sitosterol、stigmasterol 萃取率較佳，但甲醇對於極性端OH基 親合力較大，對於β–sitosterol、stigmasterol的保留時間會較短，至於水則因和管柱 產生之壓力效應，造成分析β–sitosterol、stigmasterol 較不理想。

(六)液相層析使用移動相溶液的 紫外(UV)吸收探討

高效液相層析儀器偵測器是光二極體陣列偵測器 是紫外(UV)吸收偵測器的一 種，有時候必須考慮到使用溶液的 UV吸收，通常乙氰及最大吸收值為190 nm，甲醇 為205nm。

另外層析實驗需使用層析級溶劑，其必須是除去具UV吸收的其他雜質，在特定 的波長範圍內，吸光度限制不影響太多分析成分 之樣品為前提，在UV偵測時，產生 的雜訊小，因此在進行UV短波長上的高靈敏度分析時乙氰層析級最適合 。

另外，在UV檢測中的基線上是甲醇層析級產生雜訊較少，或是轉換極性時產生 的信號變化較少。另外甲醇的層析級，雖然所得的光譜相差不大 ，但是甲醇最大吸 收值在205nm，甲醇除了主要在205nm有主要吸收外，210也能看到較強的甲醇吸收 信號，而乙氰主要吸收在 190nm，200nm以上吸收度不高。所以對於β–sitosterol、

stigmasterol的UV之偵測影響不大，另外，檢測成分時，對於一個未知物的分析，特 別針對天然物而言的話，一般會使用一個檢測波長在 254nm，參照上方的兩種溶液 在254nm吸收度很低，幾乎沒有影響，也看不太到所謂的溶液峰 。但是對於實驗研

究的β–sitosterol、stigmasterol 對象而言，甲醇雖然會影響，但因現今儀器已進步許 多，對於移動相的信號可以歸零 ，作為移動相經過偵測器的抵消其實對高效液相層 析影響不大，反而對測單獨UV分光光譜影響較大，而經過光二級陣列調出UV圖時 已經經過規零抵消移動相的吸收所以並不影響 。

(七)其他流流動相影響因素

實驗時隨著乙氰/甲醇配比的乙氰比例逐漸升高到 75%以上時，常觀察到有不明 類似雜訊之信號，相對乙氰少於70%的基線來說，比較有許多雜訊狀的小矮峰出現，

推測可能是因為乙氰在管柱中造成的某些空隙或體積產生的氣泡被偵測到 ，或者可 能是乙氰本身由於吸熱冷卻 ，隨著慢慢回到室溫會產生氣泡 ，所以要避免雜訊的話 就進量不考慮純乙氰為單一移動相 。

(八)層析圖的無感時間

層析圖之無感時間又稱為未滯 留時間，實驗所使用為25公分管柱長度，各種條 件下經過分析，無感時間為五分鐘，五分鐘以前樣品中的成分 和管柱形成無法滯留 的作用情形，所以會在短時間內被流洗出系統 ，若是有UV吸收則可測到5分鐘前的 峰，非實際欲分析之樣品，可忽略不計。

二、移動相與β–sitosterol、stigmasterol保留時間關係探討

(一)分析β–sitosterol 的保留時間與移動相甲醇及乙氰的配比關係

將 β–sitosterol 標 準 品 溶 液 ， 使 用 反 向 層 析 管 柱 Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6,5μm）進行偵測分析，調整流動相，比較不同比例之乙氰與甲醇為移動 相時，層析圖的β–sitosterol 保留時間。結果見表5-1，可以得知甲醇比例100%時保 留時間為最短，乙氰增加保留時間變長，以下

保留時間並非絕對，如室溫等某些其他條件之不同 ，會有些許不同。

表5-1.β–sitosterol的保留時間與移動相甲醇及乙氰的配比關係 β-sitosterol 保留時間(min) 移動相(乙氰：甲醇v/v)

26.4 0：100

27.9 5：95

32.5 10：90

35.5 20：80

45 40：60

52.02 50：50

62.5 70：30

未出峰 100：0

(二)分析stigmasterol的保留時間與移動相甲醇乙氰的配比關係

將 stigmasterol 標 準 品 溶 液 ， 使 用 反 向 層 析 管 柱 Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6,5μm）進行偵測分析，調整流動相，比較不同比例的乙氰與甲醇為移動 相時，層析圖的stigmasterol峰保留時間。結果見表5-2。

表5-2.stigmasterol的保留時間與移動相甲醇乙氰的配比 關係

stigmasterol保留時間(min) 移動相(乙氰：甲醇v/v)

21.2 0：100

22.5 5：95

24 10：90

29.75 20：80

32.5 25：75

35 30：70

41 40：60

46.8 50：50

未出峰 100：0

(三)管柱與保留時間探討

實驗時可能會出現保留時間之飄移，因此對於管柱與保留時間 ，發現有有簡要 之關聯性。實驗使用的管柱長度為25公分，屬於相對較長之分析管柱，保留時間通 常會隨管柱長度而改變，管柱越長，成分保留時間相對於短的 管柱則會越長，短的 管柱保留時間也比較短，但是分離率較差，無感時間也會受到干擾。

就樣品成分來說，保留時間越長(超過20分鐘以上)，就比較會造成偏移現象，

保留時間越長之成分越不穩定，如果保留時間在20 分鐘內常常差不到半分鐘。保留 時間和管柱長度有關外，和分析溶液的濃度也有某些關 聯，這與柱子的負載量有關，

若是上一針進樣濃度較高就會連帶影響到下一針注入的樣品 ，濃度越高影響則會越 大，所以手動注射樣品時，會增長其平衡時間。

三、香蕉花樣品前處理實驗探討

(一)樣品前處理原則

不同之分析對象於前處理有不同做法，一般來說在分析的工作中，通常包含了 定性、定量這兩大部分，以決定偵測樣品中所含各成 分之性質與含量。實驗的主要 架構分為前置的樣品前處理和之後的分析樣品樣品步驟 。前處理的好壞往往影響分 析結果與成敗。樣品前處理可減少基質干擾 、提高偵測靈敏度、增強分析物呈現的 儀器信號。

樣品前處理時要有一個觀念 ，具備足夠知識，瞭解要分析的方向，思索欲分析 的成分的性質，從做好樣品前處理。而分析方式，如高效液相層析和其他層析方法

的前處理也有不同，只要對於所分析目的，及所分析的樣品性質足夠瞭解就會簡單 許多。

植物裡面的成分有的通常是超微量或超低濃度 ，雖然目前高效液像儀器非常先 進、靈敏度相當高，可快速偵測極微量之分析物 ，若要分析其中某成分往往受限於 樣品基質的複雜，使其分析檢測不易完成，故常利用樣品前處理技術去除基質 ，增 強分析成分的層析圖信號 。

通常實際分析的植物樣品中基質往往會比較複雜 ，對大多數植物樣品都需要進 行前處理將樣品轉化可測定的型式 。在測定中最大的誤差往往來源於前處理的過 程，有時候前處理的好壞直接影響到分析結果的正確性。樣品前處理的方式有很多，

但是並不是每個方法都適用 ，原理脫離不了分離成分這個概念，分離的用意就是要 在分析中可以達到消除干擾 ,保證分析結果的準確性,擴大分析應用範圍。

而 本 實 驗 採 取 的 方 法 主 要 為 溶 劑 萃 取 輔 以 超 音 波 震 盪 ， 從 香 蕉 花 中 萃 取 β–sitosterol、stigmasterol 之成分，方法為將香蕉花植物粉碎或研細 ，放在容器裏，

加入適當溶劑萃取。可根據β–sitosterol、stigmasterol在溶劑中的溶解性質 ，選用對 β–sitosterol 、 stigmasterol 溶 解 度 大 ， 對 不 需 要 溶 出 成 分 溶 解 度 小 的 溶 劑 ， 而 將 β–sitosterol、stigmasterol 從香蕉花內萃取出來的方法 。當溶劑加到香蕉花原料中 時，溶劑本身由於擴散、滲透作用逐漸通過細胞壁透入到細胞內 ，溶解了欲分析物 質，而造成細胞內外的濃度差 ，於是細胞內的濃溶液不斷向外擴散 ，溶劑又可進入 藥材組織細胞中，直至細胞內外溶液濃度達到動態平衡時 ，將此飽和溶液濾出，就 可以把所需要的成分近於完全溶出或大部溶出 。

另外，關於香蕉花樣品前處理之萃取，以超音波震盪輔助，超音波在傳遞過程 中存在著的正負壓強交變週期 ，在正相位時，對介質分子產生擠壓，增加介質原來 的密度；負相位時，介質分子稀散，介質密度減小，能加速上述之濃度差反應，加 快萃取效果，節省時間，也能加速細胞的物質的均勻分布 。