一、藥品配製部分
(一)配製β–sitosterol標準溶液方式
首先配製β–sitosterol 500 ppm 之標準溶液10mL，利用精密電子天秤 ，精秤 5.00mg 之β–sitosterol標準品，置於10mL定量瓶，加入甲醇8mL 後，於超音波震盪 器震盪3min，達室溫後，加甲醇補至標線，即得500 ppm 之標準溶液，將此溶液以 室溫保存備用。
稀釋此標準溶液，分別配製250、125、100、50、10 ppm，此配製方式容易操 作，不需分次量取標準品，可減少分別配製產生之誤差，原標準溶液配置必須仔細 精密。
(二)配製stigmasterol標準溶液方式
首先配製stigmasterol 1000ppm 之標準溶液10mL，利用精密電子天秤 ，精秤 10.00mg 之stigmasterol標準品，置於10mL定量瓶，加入甲醇8mL 後，於超音波震 盪器震盪3min，達室溫後，加甲醇補至標線，即得1000 ppm 之標準溶液，將此溶 液以室溫保存備用。
稀釋此標準溶液，分別配製350、250、150、50、5 ppm，此配製方式容易操作，
可減少分別配製產生之誤差 。
二、製作β–sitosterol、stigmasterol之檢量線，求線性方程式、
線性相關係數以及偵測極限
(一) 製作 β–sitosterol 標準品之檢量線，求線性方程式、線性相關係 數
準備不同濃度各別為 250、125、100、50、10ppm 之β–sitosterol標準溶液，利 用高效液相層析儀進行分析檢測 ，並求出β–sitosterol之線性範圍、線性方程式及線 性相關係數。
(二) 製作 stigmasterol 標準品之檢量線，求線性方程式、線性相關 係數
準備不同濃度各別為 350、250、150、50、5ppm 之stigmasterol標準溶液，利 用高效液相層析儀進行分析檢測 ，並求出stigmasterol之線性範圍、線性方程式及線 性相關係數。
(三) β–sitosterol、stigmasterol於高效液相層析儀偵測極限測定測定
將β–sitosterol、stigmasterol標準溶液濃度稀釋數次，利用高效液相層析儀去做 偵測，從層析圖訊雜比等於3時，得出偵測極限。
三、儀器參數設定以及分析β–sitosterol、stigmasterol基本條件
實驗之高效液相層析系統中 ，所使用管柱為Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6，
5μm），屬於反相管柱，所使用的移動相，分別為甲醇、乙氰、純水(皆為層析等級) 。 於實驗室操作時移動相 之儲存，具體步驟為，將4公升包裝的層析級甲醇和乙 氰，置入高效液相層析儀器輸送移動相 之管路，利用前端過濾頭達到過濾移動相溶 液的作用。於溶液包裝瓶開口處用parafilm封起來以防止有機相揮發或是細菌及微生 物或其他雜質污染。
所使用的高效液相層析儀為日本 HITACHI之高效液相層析儀器搭配光二極體 陣 列 偵 測 器 (HPLC/DAD) 的 液 相 層 析 儀 器 ， 搭 配 日 本 KANTO CHEMICAL 的 Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6，5μm）高效液相層析管柱進行偵測分析 。
移動相首先用甲醇、乙氰、水(皆為層析級)進行除氣(purge)，以流速9.999mL/min 依序除氣5分鐘，除去移動相經濾頭及管路中產生的氣泡，及除去移動相本身含有的 氣體，若不經除氣，會產生許多雜訊以及其他干擾問題。
至正式分析前，以甲醇進行活化1小時，使用流速1.0mL/min，若基線(baseline) 不穩定，將流速設定0.5mL/min 沖提至基線穩定。再利用流速1.0mL/min 之甲醇為 移動相，進行分析。
光二極體陣列偵測器可同時偵測一個波長範圍，將波長範圍設定在205nm 針對 β–sitosterol、stigmasterol做偵測，得此波長下的層析圖。
四、香蕉花之樣品前處理
實驗對象為香蕉花，針對β–sitosterol、stigmasterol 此欲研究之成分性質，到能
夠分析之待測樣品，需經過樣品前處理步驟，主要可分為幾個方面。
(一)新鮮香蕉花植物處理
新鮮香蕉花將其外層紫色葉片剝除，收集其內層排序之香蕉花，取得後做潔淨 之工作，將取得之香蕉花置於乾燥處陰乾，欲加快乾燥時，可以不超過30 oC低溫加 烘1至數小時不等。
選取乾燥完整形態之香蕉花，將之以粉碎機中磨成粉末，分次打粉，務求粉末 均勻且較顆粒較細，再將粉末徹底均勻攪拌，這樣可以減少香蕉花不同植株造成的 誤差，將之收集50g供高效液相層析儀實驗分析備用 。
(二)高效液相層析實驗之樣品前處理方式
樣品前處理方式為溶液萃取 ，依據β–sitosterol、stigmasterol的性質﹐分兩步驟 萃取﹐第一步以正己烷萃取初步萃取物 ﹐第二步為正己烷萃取物的 β–sitosterol、
stigmasterol成分萃取。
1.第一步萃取萃取方法：
秤取實驗所需克數香蕉花粉末 ，置於實驗所需100ml血清瓶中，加入正己烷
(hexane)，將之放入超音波震盪器之中萃取，設置實驗所需溫度40oC，待震盪1小時
取出，靜待 5 分鐘，待細微粉末沉澱，將萃取液用濾紙過濾，濃縮至完全除去正己 烷，得第一步之正己烷萃取物。
2.第二步萃取方法：
將所得到之正己烷萃取物於3 ml的乙氰做第二次超音波震盪萃取 ，溫度設定55
oC，萃取時間15分鐘，取出乙氰萃取液，用Millex-HV 0.45 µm, Millipore之濾頭過濾，
反覆兩次，收集於同一10ml的定量瓶中，再加入甲醇補至標線，得前處理完成之樣 品溶液。
(三)針對第一步萃取溶液所做的探討實驗
研究超音波震盪之萃取時間對β–sitosterol 層析圖峰面積的影響。準備同一批香 蕉花粉末，均勻搖散使粉末分佈平均 ，秤取1g香蕉花粉末5分，分別至於5個100mL 血清瓶中，各加入100mL正己烷，分別於40oC以超音波震盪萃取，分別計時1分、5 分、30分、1小時、2小時分待各別震盪萃取時間取出，個別靜待5分鐘，等待超音波 震蕩完香蕉花懸浮粉末沉澱後，將正己烷萃取液用濾紙過濾 ，於濃縮瓶中濃縮至體 積變小，在將之換入50mL樣品瓶中，作最後濃縮，至完全除去正己烷，得到的萃取 物再用3mL乙氰做第二次超音波震盪萃取 ，溫度設定55 oC，萃取15分鐘後，反覆兩 次，取出乙氰萃取液，用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭過濾後，收集於同一個 10mL定量瓶中，再加入甲醇補至標線。以待高效液相層析儀做層析圖 之分析，比較 其不同超音波震盪時間的 β–sitosterol層析鋒面積。
(四)針對第二步正己烷萃取物的 β–sitosterol成分萃取所做探討
針對乙氰和甲醇對於正己烷萃取物之萃取對 於β–sitosterol之層析圖峰面積的 影響，具體方法為，先秤取1g香蕉花粉末，置於100mL血清瓶中，加入100mL正己
烷，在攝氏40 oC以超音波震盪萃取30分鐘後，靜待5分鐘，待超音波震蕩完香蕉花 懸浮粉末沉澱後，將正己烷萃取液用濾紙過濾收集，用100mL分為三分，每分30mL，
換入50mL樣品瓶中濃縮，至完全除去正己烷，得到第一步正己烷萃取物。接著正己 烷萃取物分別用移動相之一的乙氰與甲醇作為萃取溶液 ，對於正己烷萃取物做萃取 所得出之β–sitosterol鋒面積比較，分別用5mL100%乙氰、50%乙氰2.5 mL+50%甲醇 2.5 mL、5mL100%甲醇這三種配比，做第二次萃取，溫度設定55 oC，分別萃取15 分鐘後，取出三種萃取液，用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭過濾後，至於10mL 定量瓶中，在分別用乙氰2mL100%乙氰、50%乙氰1 mL+50%甲醇1 mL、2mL100%
甲醇萃取5分鐘後用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭過濾後再收集於個別之前的 定量瓶中，再加入甲醇補至標線。再用高效液相層析儀去做層析圖的分析 ，比較其 不同萃取方式的β–sitosterol層析鋒面積。
五、移動相與β–sitosterol、stigmasterol 之保留時間關係探討
(一)分析β–sitosterol的保留時間與移動相甲醇、乙氰的配比關係
取β–sitosterol標準品溶液，使用管柱Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6，5μm）為 反向層析管柱，進行偵測分析，調整流動相為甲醇：乙氰 (100：0 v/v) 、甲醇：乙 氰 (80：20 v/v) 、甲醇：乙氰(60：40 v/v) 、甲醇：乙氰.(50：50 v/v) 、甲醇：乙 氰. (30：70v/v) 、甲醇：乙氰. (0：100 v/v)，比較不同比例的乙氰與甲醇為移動相 時，層析圖的β–sitosterol 峰保留時間。
(二)分析stigmasterol的保留時間與移動相甲醇 、乙氰的配比關係
取stigmasterol標準品溶液，使用管柱Mightysil RP-18 GP (250mm-4.6，5μm）為 反向層析管柱進行偵測分析，調整流動相為甲醇：乙氰 (100：0 v/v) 、甲醇：乙氰 (95：5 v/v) 、甲醇：乙氰(90：10 v/v) 、甲醇：乙氰.(80：20 v/v) 、甲醇：乙氰. (75：
25v/v) 、甲醇：乙氰. (70：30v/v) 、甲醇：乙氰. (60：40v/v)，比較不同比例的乙氰 與甲醇為移動相時，層析圖的stigmasterol峰保留時間。
(三)香蕉花真實樣品中β–sitosterol、stigmasterol成分之分析
採用前處理之第一步萃取方法，秤取1g香蕉花粉末，收集在100mL血清瓶中，
搖散使之均勻分佈，加入100mL正己烷於裝有樣品粉末的血清瓶中，以超音波震盪 處理1hr，取出後將正己烷萃取液和殘渣用濾紙過濾分離，將之濃縮得正己烷萃取物。
得到之正己烷萃取物再用 3mL乙氰做第二次超音波震盪萃取 ，溫度設定55 oC，
萃取15分鐘後，反覆兩次，取出乙氰萃取液，用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭 過濾後，收集於同一個10mL定量瓶中，再加入甲醇補至標線。利用高效液相層析儀 進行分析檢測成分及定量探討。
六、β–sitosterol、stigmasterol之標準添加法
當樣品基質可能影響欲分析之成分，或其影響為未知時，可使用標準添加法。
首先必需製備一分香蕉花真實樣品溶液，秤取1g香蕉花粉末，收集在100mL血清瓶 中，搖散使之均勻分佈，經前處理正己烷萃取步驟，得正己烷萃取物，得到之正己
烷萃取物再用3mL乙氰做第二次超音波震盪萃取，溫度設定55 oC，萃取15分鐘後，
反覆兩次，取出乙氰萃取液，用用Millex-HV 0.45 µm, Millipore濾頭過濾後，收集於 同一個10mL定量瓶中，再加入甲醇補至標線。得到實驗之香蕉花真實樣品溶液，供 後續實驗使用。
(一) β–sitosterol標準添加實驗
將製備得之香蕉花真實樣品溶液 分為6分，分別置入10mL定量瓶，分別於6個 10mL定量瓶中加入1mL香蕉花檢品溶液，取其中5個裝有1mL香蕉花真實樣品溶液 之定量瓶，分別加入1mL不同濃度之β–sitosterol標準品溶液，濃度分別為 250、125、
100、50、10ppm，及一個未添加標準品溶液之香蕉花 真實樣品溶液1mL之定量瓶，
最後將全部的6瓶處理好的定量瓶，加入甲醇至標線定容之。偵測後以添加濃度對反 應峰面積做圖，算出標準添加線性方程式，依標準添加曲線得出β–sitosterol之濃度。
(二)stigmasterol標準添加實驗
將製備得之香蕉花真實樣品溶液分為 6分，分別置入10mL定量瓶，分別於6個 10mL定量瓶中加入1mL香蕉花檢品溶液，取其中5個裝有1mL香蕉花真實樣品溶液 之定量瓶，分別加入1mL不同濃度之stigmasterol標準品溶液，濃度分別為 350、250、
150、50、5ppm，及一個未添加標準品溶液之香蕉花真實樣品溶液 1mL之定量瓶，
最後將全部的6瓶處理好的定量瓶，加入甲醇至標線定容之。偵測後以添加濃度對反 應峰面積做圖，算出標準添加線性方程式，依標準添加曲線得出stigmasterol之濃度。
七、針對β–sitosterol、stigmasterol 精密度之測定
實驗採手動進樣方式，分別取100 ppm 之β–sitosterol、stigmasterol標準溶液，
各別進樣注射β–sitosterol、stigmasterol 標準溶液，待注射完成，利用高效液相層析 儀進行分析其β–sitosterol、stigmasterol 層析峰面積，並於同一濃度之同一個樣品標 準液，重複上述實驗步驟5次，每次間隔平衡時間5分鐘。
八、針對β–sitosterol、stigmasterol 回收率之測定
(一)β–sitosterol標準品回收率之測定
分別取1.50、1.00、0.75mg 之β–sitosterol標準品，進行樣品前處理之第一步及 第二步萃取。經過前處理的第一步及第二步萃取步驟後 ，得到樣品溶液，再用高效 液相層析儀去做層析圖的分析 ，計算β–sitosterol標準品回收率。
(二) β–sitosterol實際樣品回收率測定
分別秤取2.00、1.30、0.50、0.20mg β–sitosterol 標準品，再分別秤取1g香蕉花 粉末各4分，將秤取之不同量β–sitosterol 標準品分別加入秤取1g香蕉花粉末之中，
收集於100mL血清瓶中，搖散使之均勻分佈，利用高效液相層析儀進行分析，計算 β–sitosterol標準品回收率。
收集於100mL血清瓶中，搖散使之均勻分佈，利用高效液相層析儀進行分析，計算 β–sitosterol標準品回收率。