無假設，則代表拒絕中性演化，在特徵轉換的過程中，foreground 檢
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測到正向天擇的訊號；若(2)無法拒絕虛無假設，則表示在特徵轉換的 過程中，僅反映出該分支與背景相比，從選汰壓力中釋放。
由於基因會受到重組的影響，使得原本受到天擇作用的位點提高 異型合子率，也在 LRT 時產生 false positive (Anisimova et al., 2003)，
故利用 HyPhy (by webserver DATAMONKEY)(Pond & Frost, 2005;
Pond et al., 2005; Delport et al., 2010)中的 GARD recombination analysis (Pond et al., 2006)進行序列上可能造成重組的 breakpoint，將轉置後的 序列重新構樹，將原本的基因樹與校正重組後重建的 GARD 推論樹 (GARD inferred tree) 做 樹 型 分 析 (topological test) ， 若 KH-test (Shimodaira & Hasegawa, 1999)檢測的結果為 GARD 推論樹拒絕原始 基因樹的話，那就應該考慮基因演化中有發生重組的可能性。藉由考 慮重組造成的演化歷史，透過校正序列中可能發生重組的區域，重新 建構物種間基因的演化樹(GARD 推論樹)；透過 REL、FUBAR 兩個 site model 及 MEME 一個 branch-site model 的方法檢測可能有
ω>1 的
位點及演化分支。生理生態數值之分析與親緣訊息的檢測
所獲得的生理生態數值與有蠟/無蠟的特徵進行邏輯迴歸，了解 蠟結晶性狀的有/無作為物理性防禦與酚酸作為化學性防禦兩者間是
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否有權衡關係，以驗證假說(2)；另外同時檢測蠟結晶的有/無性狀是 否與光合作用效率的多寡有關，透過兩者的關連性以驗證假說(3)。
另外透過基因的演化或是物種的演化，預測性狀特徵的相似性，
便可以得知基因所對應的性狀或所影響的生理性狀之間的關連性，所 使用的方法是透過親緣訊息(phylogenetic signal)的方法檢測，若演化 樹呈現的演化關係可以預測生態性狀上的相似性，則代表其中有親緣 訊息存在，也代表兩者間有關聯性。其中 Moran’s I (Moran, 1950)、
Abouheif ‘s Cmean (Abouheif, 1999)都是 correlation-based 的方法得知物 種間的演化關係(歸群方式或遺傳距離)或基因間的演化關係與生態 性狀間的關連性。若 I=0，則表示演化樹上的 OTU 歸群結果，是符合 隨機分布模式；若 I<0，則表示演化樹上的 OTU 歸群的結果，不符合 隨機下的分布模式，OTU 在演化樹上的分布是隨機分散的；若 I>0，
則表示彼此歸群較近的 OTU，其特徵就越相似。由於 Cmean的運算是 根據 Moran’s I 的基礎，同樣為 spatial autocorrelation 的運算方式，所 以 數 值 的 解 讀 同 I 值 (Munkemuller et al., 2012) 。 Blomberg’s K (Blomberg et al., 2003)則是 model based 方法，藉由親緣關係預測生態 性狀間的相似程度；首先檢測 K 值是否顯著偏離零(K=0 表示無親緣 訊息)，若顯著偏離零則表示有親緣訊息；接下來若顯著偏離零且 K=1，
則代表有強烈的親緣訊息且特徵的演化是根據 Brownian motion
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model of evolution；K>1，表示近緣的 OTU 其特徵相似的程度遠超過 Brownian motion model of trait evolution 預期(Kamilar & Cooper, 2013)。
上述親緣訊息分析，使用 picante (Kembel et al., 2010)、ape (Paradis et
al., 2004)、adephylo (Jombart et al., 2010)、ade4 (Dray & Dufour, 2007)、
phylobase (Hackathon et al., 2011)、geiger (Harmon et al., 2008)、phytools (Revell, 2012)套件，利用 R (R Core Team, 2013)進行運算。
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結果
殼斗科科內屬間(山毛櫸屬、栗屬、櫟屬、石櫟屬)親緣關係之重建 因形態歸群及過去以分子方式所獲得的石櫟屬、櫟屬、栗屬的演 化關係假說不一致，故為了判斷石櫟屬最有可能的姊妹屬作為外群，
我挑選資料庫中 50 個同源基因進行屬內的親緣關係分析，以判斷石 櫟 屬 最 有 可 能 的 姊 妹 群 。 分 析 資 料 庫 中 50 個 對 應 至 阿 拉 伯 芥 (Arabidopsis thaliana)的同源基因，利用 NJ 法、ML 法以及 BI 法進行 親緣關係的重建(詳細的參數設定與 modeltest 的結果列於表三)；其中 有 25 個基因座的屬內種間的歸群方式較為不明確，故挑選剩下可用 於區分屬間關係的基因座作為後續分析，其中有 15 個基因座支持石 櫟屬與櫟屬形成穩定的單系群，6 個基因座支持櫟屬與栗屬形成穩定 的單系群，4 個基因座支持栗屬與石櫟屬形成穩定的單系群。由於能 夠明確且最多基因座支持的呈現方式為石櫟屬與櫟屬，故選用此 15 個基因座做為後續親緣關係重建之候選基因。將 15 個基因座 4 個屬 (共 7 個種)經 BEAST 重建的親緣關係顯示如圖一。起源時間為約距 今 9900 萬年前，爾後栗屬與石櫟屬及櫟屬兩屬分歧的時間為距今 5300 萬年前，而石櫟屬與櫟屬的分歧時間為 2900 萬年前。親緣關係 樹中，栗屬、櫟屬、石櫟屬這三個屬內種間的歸群支持度(posterior probability)均為 1.00，顯示屬內有較高的歸群；而石櫟屬與櫟屬兩個
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屬間的歸群支持度為 1.00；栗屬與石櫟屬及櫟屬兩屬的支持度為 1.00。
台灣產石櫟屬 14 種間親緣關係之重建
台灣產石櫟屬物種間親緣關係重建使用 6 個與蠟生合成基因無 相關的核分子標記，所獲得的基因座長度分別為：CAP (587 bp，含 intron 102 bp)、DGD (536-553 bp，含 intron 387-404 bp)、ESRK (458-460 bp，含 intron 198 bp)、FAD (461 bp)、SAHH (461 bp)、SAM (564-565 bp)；每個分子標記均以 NJ、ML 及 BI 三種親緣關係重建法分別 確認方法間的歸群結果一致，並確認各別物種的基因所重建的親緣關 係，能夠反映出的物種歸群模式。14 種台灣產石櫟屬的親緣關係重建 以 BEAST，其中加入山毛櫸屬、櫟屬、與栗屬的序列加入作為外群，
再以科內屬間重建的親緣關係做為歸群及設定單系群的參考，以殼斗 科的起源時間約距今一億年前、櫟屬與栗屬的分歧時間約距今 5300 萬年前，以及石櫟屬與櫟屬的分歧時間約距今 2900 萬年等三個分子 鐘估算的參考點(calibration points)，推論台灣產石櫟屬內的親緣關係 (圖二)。親緣關係的結果顯示石櫟屬的起源約於距今 2400-2800 萬年 前；歸群的結果顯示，科內屬間的支持度(posterior probability)均為 1.00，台灣產石櫟屬葉表無蠟質特徵的物種在親緣關係樹形成兩個分 支，其中一支為油葉石櫟(L. konishii)、後大埔石櫟(L. cornea)一群(分
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群 支 持 度 >0.999) 另 一 支 為 三 斗 石 櫟 (L. hanceii) 、 短 尾 葉 石 櫟 (L.
brevicaudatus)、大葉石櫟(L. kawakamii)、大武石櫟(L. harlandii)兩群
單系群(分群支持度為 0.45)；而葉表具蠟質表面的物種一樣形成了台 東石櫟(L. taitoensis)、南投石櫟(L. nantoensis)、鬼櫟(L. lepidocarpus)、浸水營石櫟(L. shinsuiensis)、杏葉石櫟(L. amygdalifolius)一個單系群 (支持度>0.56)及親緣關係較葉表其中一支無蠟的類群(三斗石櫟、短 尾葉石櫟、大葉石櫟、大武石櫟)較近的子彈石櫟、柳葉石櫟、台灣石 櫟兩群。
參考基因與目標基因(蠟相關生合成基因)核苷酸置換率比較
參考基因序列結合了 CAP、DGD、ESRK、FAD、SAHH、SAM 六 個基因座合併共計序列長度 3072 bp，其中含 intron 長度 687 bp。CER1 的部分取得台灣產物種除南投石櫟共 13 種，18 條完整 cDNA 單套型 (haplotype)，共計 1701 bp，均為 coding sequence (CDS)，共 567 個密 碼子；CER3 取得台灣產物種共 14 種，18 條完整 cDNA 單套型，共 計 1818 bp，均為 CDS，共 606 個密碼子；CER5 取得台灣產物種共 14 種，22 條完整 cDNA 單套型，共計 2058 bp，均為 CDS，共 686 個 密碼子；CER7 取得台灣產物種共 14 種，14 條完整 cDNA 單套型，
共計 1032 bp，均為 CDS，共 344 個密碼子。
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(I)比較參考基因 K 值與目標基因 K 值(表四)：參考基因的核苷酸 置換率與目標基因的核苷酸置換率在 T 檢定的結果顯示：K 值(平均 0.011)與 CER1 的 K 值(平均 0.01)並無顯著差異(p=0.81)，顯示兩基因 的置換率相似；而參考基因與目標基因 CER3、CER5 的 K 值(平均分 別為 0.006 及 0.009)相比則顯著較快(p<0.001; p=0.003)；而與目標基 因 CER7 的 K 值(平均 0.013)相比則顯著較慢(p<0.001)。從參考基因 的 K 與目標基因的 K 作圖(圖三)可以發現，CER1、CER5 的斜率>1，
表示參考基因相較於 CER1、CER5 有較快的核苷酸置換率，而 CER3、