經 M2a 經 BEB 檢測得到 ω>1 且機率大於 0.95 的胺基酸位點共 4 個，

而 M8 共 6 個，兩模型共同檢測出 50L、477S、484Q、570A 共 4 個 胺基酸位點

ω>1 (M2a: ω=20.73, M8: ω=20.08)。(3) CER5 的 M2a 拒

絕 M1a (2ΔL=62.65, p<0.001)；M8 分別拒絕 M7 (2ΔL=63.08, p<0.001) 及 M8a (2ΔL=62.64, p<0.001)；M2a 經 BEB 分析得到 ω>1 且機率大 於 0.95 的胺基酸位點共 12 個，而 M8 經 BEB 則得到 15 個位點，兩 模型共同檢測出

ω>1 (M2a: ω=9.78, M8: ω=9.61)的位點為 16G、20E、

147I、328I、336W、348Q、367T、399A、504S、554E、648Q、658R 共 12 個胺基酸位點，是 site model 檢測中檢測到最多位點受到正向 天擇(

ω>1)的蠟相關生合成基因。(4) CER7 的 M2a 無法拒絕 M1a

(2ΔL=5.95, p=0.05)；M8 無法拒絕 M7 (2ΔL=5.97, p=0.05)，但拒絕 M8a

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(2ΔL=5.94, p=0.01)；此結果與 T 檢定及迴歸分析結果一致，皆指出

CER7 的演化速率慢且不受正向天擇的壓力。值得注意的是，所有受

到正向天擇的胺基酸位點出現的物種均與葉表上有蠟/無蠟的物種歸 群模式不一致，顯示正向天擇雖作用在蠟相關生合成基因的 3 個不同 功能的基因之特定胺基酸位點上，但非特定演化分支受到正向天擇，

而是在這些基因中仍保有容忍胺基酸置換的彈性。

(II)透過 PAML 中的 branch model 檢測對立假設的演化情境(允許 演化 branch 有兩種或兩種以上不同的速率並分別設為 background 與 foreground，並允許 foreground 的

ω>1)是否拒絕虛無假設的演化情境

( 演 化 branch 僅 有 一 種 速 率 ) ， 分 別 檢 測 以 下 三 種 演 化 情 境 (1) foreground 為有蠟塊物種分別受到獨立演化壓力情境、(2) foreground 為無蠟塊物種的情境、(3) foreground 為有蠟塊物種其祖先受到共同的 演化壓力的演化壓力情境以及後來又出現一次無蠟塊特徵的轉變(圖 五)，分別檢測 CER1、CER3、CER5、CER7 四個蠟相關生合成基因是 否符合特定的演化情境。結果分別顯示：情境(1)在 CER1 的對立假設 模型(foreground

ω=999.0, Ks=0)拒絕虛無假設模型(2ΔL=6.75, p<0.01)，

CER3

(2ΔL=0.34, p=0.56)，CER5 (2ΔL=0.67, p=0.41)、CER7 (2ΔL=0.67,

p=0.21)的對立假設模型皆無法拒絕虛無假設模型；情境(2)在所有基

因含 CER1 (2ΔL=0.01, p=0.92)、CER3 (2ΔL=0.15, p=0.70)、CER5

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(2ΔL=0.01, p=0.92)、CER7 (2ΔL=2.73, p=0.10)的對立假設模型皆無法 拒絕虛無假設模型；情境(3)所有基因含 CER1 (2ΔL=2.69, p=0.26)、

CER3

(2ΔL=0.00, p=NA)、CER5 (2ΔL=0.00, p=1.00)、CER7 (2ΔL=2.73,

p=0.26)的對立假設模型皆無法拒絕虛無假設模型(表九)；綜合 PAML

的 branch model 的檢測結果，僅 CER1 於情境(1)以有蠟塊的物種為 foreground 的情況下偵測到正向天擇(

ω=999, Ks=0)的訊號。

(III) PAML 中的 branch-site model 檢測對立假設的演化情境(允許 兩個或兩個以上的 foreground，並允許 foreground 的

ω>1；並考慮胺

基酸位點有多種不同的 classes，並允許 foreground 的 site 的

ω>1)是

否拒絕虛無假設的演化情境(固定 site 的

ω=1)，同樣依據物種葉片有

無蠟塊的特徵分成與 branch model 相同的三個演化情境進行檢測。檢 測結果分別顯示：情境(1)的所有基因含 CER1 (2ΔL=2.75, p=0.10)、

CER3

(2ΔL=0.00, p=1.00)、CER5 (2ΔL=0.00, p=1.00)、CER7 (2ΔL=0.13,

p=0.72)的對立假設模型皆無法拒絕虛無假設模型；情境(2)的所有基

因含 CER1 (2ΔL=0.00, p=1.00)、CER3 (2ΔL=0.00, p=0.99)、CER5 (2ΔL=0.74, p=0.39)、CER7 (2ΔL=0.00, p=1.00) 的對立假設模型皆無 法拒絕虛無假設模型(表九)；在 branch-site 的檢測中，無任何對立假 設演化模型的 likelihood 顯著的較虛無假設演化模型佳，並無檢測到 與有蠟、無蠟相關的類群上的胺基酸位點有正向天擇(

ω>1)的訊號，

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說明不論有蠟或無蠟的特徵作為 foreground 下，foreground 中的特定 位點皆未檢測出受到正向天擇的位點。

Hyphy 的檢測考慮重組的情況下，亦針對特定的位點進行檢測，

分為 site-model based 的 FUBAR 與 REL，檢測

ω>1 的胺基酸位點發

生的位置；以及 branch-site model based 的 MEME 在考慮各自的演化 分支擁有不同的

ω 及檢測檢測 ω>1 的胺基酸位點發生的位置。總結

檢 測 結 果 ( 彙 整 於 表 五 ) 發 現 ， (1) CER1 以 FUBAR (posterior probability>0.9)檢測到在 112L、208F、266V、309F、372E 共 5 個胺 基酸位點與 PAML 的 site model 同為

ω>1 的位點；REL (Bayes

factor>50)檢測到在 208F、266V、309F、372E 共 4 個胺基酸位點與 site model 同為

ω>1 的位點；MEME 則無檢測到 ω>1 的位點。(2) CER3

僅在 FUBAR 檢測到

ω>1 的胺基酸為點僅發生在 570A，且同時成為

唯一與 PAML 的 site model 共同被檢測到

ω>1 的位點；branch-site

based 的 MEME 並無檢測到

ω>1 的訊號及演化分支。(3) CER5 以

FUBAR (>50)檢測到在 16G、20E、147I、328I、336W、348Q、367T、

399A、504S、554E、648Q、658R 共 12 個胺基酸位點與 PAML 的 site model 同為

ω>1 的位點；REL (Bayes factor>0.9)檢測到在 16G、20E、

328I、336W、367T、399A、504S、554E、658R 共 9 個胺基酸位點與 site model 同為

ω>1 的位點；雖然 19G 在 PAML site model 中的 M2a

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僅獲得 BEB=0.95 (marginally significant)的結果，但在 MEME (p<0.1) 則在 19G 卻檢測到的

ω>1 並在南投石櫟與台灣石櫟的兩個演化分支

檢測到

ω>1 (非同義置換數：1，同義置換數：0)的訊號，以及在 328I

檢測到

ω>1 並在杏葉石櫟的演化分支(非同義置換數：1，同義置換

數：0)與杏葉石櫟、浸水營石櫟、南投石櫟的共祖分支檢測到

ω>1 (非

同義置換數：2，同義置換數：0)的訊號；值得一提的是，在 CER5 中 透過 MEME 檢測到

ω>1 的分支之後皆為有蠟塊的物種。

生理生態的結果與親緣訊息的結果

本實驗針對蠟塊有/無的基本生理生態數值進行量測，測得到酚 酸、光合作用產率(Y(II), 反映光合作用光系統 II 的產率)、δ¹³C (反映 WUE 以及光合作用中的固碳作用)、δ¹⁵N (反映光合作用中，固碳作 用使用 RuBP 酵素的多寡)。酚酸的數值介於 29.82-127.85 mg/mL 之 間；光合作用產率所量測到的數值介於 0.629-0.771 之間；δ¹³C 數值 介於-33.455~-30.451‰之間；δ¹⁵N 的數值介於-2.622~1.125‰之間(表 六)。

透過邏輯迴歸檢測先前提出的假說關於：假說(2)防禦權衡假說、

以及假說(3)蠟結晶影響光合作用效率假說。透過邏輯迴歸檢測蠟結 晶有無與酚酸多寡(R²=0.07, p=0.24)並無相關性，說明假說(2)並不成

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立，植物葉片的物理性防禦與化學性防禦兩者之間並無權衡關係；分 別檢測 Y(II) (R²=0.05, p=0.35)、δ¹³C (R²=0.46, p=0.35)、δ¹⁵N (R²=0.15,

p=0.10)皆呈現不顯著，說明假說(3)不成立，植物蠟結晶有無並不影響

葉片的與影響光反應速率快慢與固碳作用的效率。

針 對上 述的生 態 性 狀數 值進行 親 緣 訊息 的檢測 ， 分 別利 用 Moran’s I, Abouheif’s Cmean, Blomberg’s K 進行模擬與分析是否生理生 態呈現的特徵是否受演化關係所影響(結果於表七)；而本研究比較目 標基因的演化關係與參考基因的演化關係中是否存在親緣訊息。在由 6 個核基因所重建出的物種樹中，Moran’s I 及 Abouheif’s Cmean均無 顯著偏離零(無親緣訊息)。蠟結晶重建的基因樹中，共檢測 CER1、

CER3、CER5、CER7 共 4 個基因樹(圖六)。在 PAML branch model 檢

測到

ω>1 的 CER1 中，檢測到 Moran’s I 與 Abouheif’s C

mean顯著偏離 零且為正值的數值在 Y(II)的 Moran’s I (I=0.255, p=0.047)及 Abouheif’s

C

mean (Cmean=0.327, p=0.042)，δ¹⁵N 的 Moran’s I (I=0.220, p=0.016)、

Abouheif’s Cmean (Cmean=0.368, p=0.007)，其餘的數值則無；CER3 中檢 測 到 在 酚 酸 的 Moran’s I (I=0.335, p=0.016) 、 Abouheif’s Cmean

(Cmean=0.388, p=0.021)及 Blomberg’s K (K=0.465, p=0.013)及 δ¹⁵N 的 Moran’s I (I=0.235, p=0.009)及 Abouheif’s Cmean (Cmean=0.348, p=0.006) 有親緣訊息，其餘的數值則無；CER7 中，Y(II)的 Abouheif’s Cmean

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(Cmean=0.365, p=0.022)、Blomberg’s K (K=1.122, p=0.005)及δ¹³C 在的 Moran’s I (I=0.256, p=0.023)檢測到親緣訊息，其餘的則無(表八)。說 明在 CER1 基因樹可以預測生態性狀 Y(II)、δ¹⁵N，CER3 基因樹可以 預測生態性狀酚酸、δ¹⁵N，CER7 可以預測生態性狀 Y(II)、δ¹³C。

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討論

殼斗科石櫟屬親緣關係之探討-櫟屬為石櫟屬之姊妹屬

本研究以多基因座重建石櫟屬、櫟屬、與栗屬間的親緣關係，結 果支持 Manos et al. (2001)所推論的假設，即石櫟屬與櫟屬擁有相較 於栗屬與山毛櫸屬較近的親緣關係，與近年做出推論栗屬與櫟屬為單 系群的親緣關係不一致(Manos et al., 2008; Oh & Manos, 2008)。本研 究認為此相異的結果可能是由於所使用之分子標記的不同產生的差 異；Oh and Manos (2008)所使用之 CRC 基因為花部發育相關基因，

是被子植物中調控心皮發育的重要調控基因(Fourquin et al., 2005; Lee

et al., 2005)，以此基因做為殼斗的特徵演化為適合的分子標記，有助

於釐清殼斗特徵演化，但若用以推論殼斗科物種間的親緣關係則可能 會因為特徵的適應演化演化與種化的方向不同而得到櫟屬與栗屬為 姊妹屬的推論，而無法忠實地反映出殼斗科物種的演化關係。

葉表蠟適應性的遺傳證據

(I)比較核苷酸置換率之結果

本研究將蠟生合成途徑依照其功能分成三個類群，分別為：脂肪 酸鏈之骨架生合成基因、調節生合成相關基因(CER7)與運輸蠟塊基因

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(CER5)。透過已知的研究得知，蠟生合成途徑中的 alkane-forming pathway 中，最開始的 VLC-alkane 的生成過程是：CER3 (VLC-acyl-CoA-reductase)會先將 VLC-acyl-CoA 還原形成 VLC-aldehyde，之後 則由 CER1 (VLC-aldehyde decarbonylase)將 VLC-acyldehyde 中的羰基 去除，形成 VLC-alkane (C28-C30 的長烷鏈)，成為 alkane-forming pathway 的前驅物(Fu et al., 2015)，VLC-alkane 經過修飾加上官能基 之後，經通道蛋白(eg. CER5)運輸到胞外；更早之前的研究更透過透 過酵母菌雙雜合系統的實驗，證實植物中的 CER1、CER3 有蛋白質 間的協同的作用，acyl-CoA 在 CER3 催化後的中經產物 VLC-acyl 馬上經 CER1 催化為 VLC-alkane (Bernard et al., 2012)；CER3 除 了與 CER1 有協同作用外，CER3 也受 CER7 的調控，CER7 會透過調 控影響 CER3 的 repressor RNA，進而影響 VLC-alkane 的生合成(Lam

et al., 2012; Bernard & Joubes, 2013; Lee & Suh, 2013)。

透過比較 K、Ka、Ks 發現：同為 alkane-forming pathway 中的骨 架型基因 CER1 與 CER3，兩者在與參考基因 K 值相比時發現，CER1 (mean=0.011) 與 參 考 基 因 的 K 值 (mean=0.011, p=0.813) 較 CER3 (mean=0.007)與參考基因的 K 值快(mean=0.011, p=5.18E-19) (表四)，

在骨架生合成基因中會有這樣的結果，可能是因為 CER3 參與較多蛋 白質或基因之間的交互作用，例如與同為骨架生合成基因的 CER1，

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以及調節型基因 CER7 交互作用；在蛋白質互動網絡的研究中，與越 多種蛋白質互動的基因，其演化速率(K)會越慢(Fraser et al., 2002)。

進一步探討 CER1 與 CER3 本身的 Ka、Ks 發現骨架生合成基因 在演化上都相當保守(Ka<Ks,

ω<1, p<0.001, respectively)，可能受到選

汰限制(selective constraint)的結果，由於非同義核苷酸置換，會導致蛋 白質性質改變，所以反映蛋白質演化速率的非同義置換率(Ka)，由於 選汰限制的原因，使得 Ka 較慢。

CER5/WBCG12 是 ATP binding cassette (ABC)基因家族中的基因 之一，最早於 Pighin et al. (2004)進行表現實驗得知 CER5 參與蠟的運 輸的重要功能。由於蠟生合成的過程會將脂肪酸鏈或長碳鏈進行一定 程度的官能基修飾(Samuels et al., 2008; Bernard & Joubes, 2013)，故最 終運輸到表皮的蠟塊(epicuticular wax)在化學結構上是相當多變的 (Samuels et al., 2008; Bernard & Joubes, 2013)。運輸蠟的相關蛋白除了 最早發現的 CER5 外尚有其他三種型式的蠟運輸蛋白存在，如 WBCG11 及 WBCG13 (McFarlane et al., 2010; Li et al., 2016)，可以推 論在蠟生合成之後的長碳鏈或脂肪酸鏈其結構變異較大，具有較多樣 的型式的通道蛋白即可辨認出較多種類與辨識不同官能基的蠟，使得 蠟質得以運輸到胞外形成表皮蠟質。根據本研究結果，CER5 的 K (mean=0.001)相較於參考基因的 K (mean=0.011)顯著來的慢(p=0.003)，

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顯示其相較於參考基因保守。

CER7 與 CER3 之間的交互作用與其機制在這幾年內有許多報導 (Hooker et al., 2007; Lam et al., 2012; Lam et al., 2015)。CER7 為 3’5’

exoribonuclease，已知參與阿拉伯芥中蠟生合成基因的調控，藉由辨 識 並 抑 制 trans-acting small interfering RNA (tasiRNA, CER3 的 repressor)，讓參與 alkane-forming pathway 的 CER3 得以作用(Hooker

et al., 2007)；研究中同時也指出，除了 CER3 的被正向調節外，尚有 ERD14、AUX1、SUI1 及 2 個未知功能共 5 個基因一樣受到 tasiRNAs

與 CER7 的調控(Lam et al., 2015)，顯示 CER7 具有基因多效性 (pleiotropy)的特質，在基因功能限制的情況下，演化上較為保守 (Hoffmann, 2014)。本研究推論(1) CER3 或 CER7 兩者之一若發生胺 基酸的改變，則會造成基因在表現上的變化(Lam et al., 2012; Lam et

al., 2015)，以及(2) CER7 本身具基因多效性調控許多 tasiRNAs，進而

影響包含 CER3 在內的 5 個基因。這幾個因素導致 CER7 功能保守且 推論受到選汰限制。

(II) PAML 與 HyPhy 檢測之結果

在 PAML 的 site model (M2a, M8)與 HyPhy 的 site-based model (REL, FUBAR)檢測中，均都有檢測到正向天擇位點的基因為：CER1

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檢測到 4 個位點、CER5 檢測到 9 個位點。然而這些位點上受到正向 天擇偏好的胺基酸對應到石櫟屬親緣關係上有蠟結晶與無蠟結晶的 物種上發現受天則偏好的位點的物種與有/無蠟結晶的物種兩者間並 無關連，受天擇偏好所保留的位點，可能反映出的是近期所受到的天 擇壓力，而非之前種化或特徵轉變過程中持續的天擇壓力。

進一步檢視 CER1 的 4 個、CER5 的 9 個可能的正向天擇訊號的 位點，雖然這些位點都不是位在重要的蛋白質結構域(protein domain) 中，但胺基酸的改變可能會造成蛋白質性質上或是次級結構上的改變。

例如：在 CER1 胺基酸序列上的第 208、266 個胺基酸位點為平行的 β-sheet，第 309 個胺基酸位點是 random coil，第 372 個胺基酸位點是 α-helix；CER5 胺基酸序列上的第 16、554 個胺基酸位點是 random coil，第 20、399、504 個胺基酸位點是平行的β-sheet，第 328、336、

367、658 個胺基酸位點是 α-helix；α-helix 與 β-sheet 是胺基酸次級結 構的主要構型(Branden, 1999)，其中α-helix 所謂在胺基酸的結構位置 與 整 體 長 度 是 影 響 到 胺 基 酸 性 質 一 個 重 要 的 關 鍵 之 一 (Engel &

DeGrado, 2004)；許多 β-sheet 是由斥水性的胺基酸所構成(Chou &

Fasman, 1974; Williams et al., 1987; Jiang et al., 1998)，因此一旦由胺 基酸的性質由斥水性的胺基酸轉成親水性的胺基酸，恐造成次級結構 的改變，進而影響蛋白質性質的改變。

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在 branch model 的 3 種情境檢測中，首先檢測蠟結晶基因是否在 特徵轉換的演化分支上具有不同的演化速率，結果顯示僅 CER1 在情

在 branch model 的 3 種情境檢測中，首先檢測蠟結晶基因是否在 特徵轉換的演化分支上具有不同的演化速率，結果顯示僅 CER1 在情

在文檔中 石櫟屬物種生理生態性狀親緣訊息與蠟生合成基因正向天擇 (頁 35-49)