本 研 究 利 用 HPLC 方 法 ， 定 量 血 清 中 之 morin 及 morin glucuronides /sulfates。以乙 ：0.2 % 磷酸水溶液 (28:72, v/v) 混合 液為移動相，ethyl paraben 為內標，流速為 1.0 ml/min，層析流程可 在 13 分鐘內完成，分析簡易而快速。血清中桑色素層析圖如 Fig. 1-1 所示。血清檢品之前處理是利用分配原理，以含內標的乙酸乙酯萃取 血清中之 morin 及由 morin glucuronides/sulfates 解出之 morin，此
方法與以甲醇或乙 去蛋白的方法比較六種濃度的血清標準品經三
種方法之前處理過程，結果顯示所得到的 morin 每種濃度的檢品，均 以乙酸乙酯萃取法波峰面積較大。除此之外，此方法處理檢品所花的 時間亦較短。
本研究以口服及靜脈注射兩種途徑投予桑色素，血清中桑色素 的濃度測定，則分別利用兩條檢量線定量。口服桑色素的濃度範圍為 1.56 ~ 25.00μg/ml，檢量線方程式為 y = 0.128χ- 0.723 ( r = 0.997)；
靜脈注射桑色素的濃度範圍為 1.56 ~ 200.00μg/ml，檢量線方程式為
有良好的線性關係。分析系統之精密度佳而準確度也在 20 % 以內，
如 Table1-1 所示。相對於水的回收率為 57.9 % ~ 67.6 %，尚可接受，
如 Table 1-2 所示。LOQ 為 1.56 μg/ml，LOD 為 0.39
µ
g/ml。桑色素具多酚之結構，易被氧化，為較不安定的黃酮類化合物。
經比較不加維生素 C、添加 100.0 mg/ml 維生素 C 與添加 300.0 mg/ml
維生素 C 三種條件，對它在 37℃ 解情況下安定度的影響，發現添
加 300.0 mg/ml 維生素 C 者對血清中桑色素的保護作用最佳，與不加 維生素 C 者及加低濃度者 (100.0 mg/ml) 相較，其差異具統計學上的 意義。根據安定性試驗發現，檢品最好在五天內分析完成，因為五天 之後血清中的桑色素有明顯的降解情形，如 Fig. 1- 2 所示。
解所需的時間之決定，係以兔子靜脈注射桑色素之血清檢品，
加入β-glucuronidase/sulfatase 及維生素 C (300.0 mg/ml) 於 37℃水浴 進 行 反 應 ， 結 果 顯 示 反 應 4 小 時 ， 酵 素 已 能 完 全 水 解 morin glucuronides/sulfates，如 Fig. 1-3 所示，因此本實驗所有血清檢品之
解時間均採 4 小時。
兔 子 靜 脈 注 射 (10.0 mg/kg， 20.0 mg/kg) 與 口 服 投 予 (50.0 mg/kg，100.0 mg/kg) 桑色素後，各隻兔子血清中 morin 及 morin conjugates 之濃度如 Table1-3~1-14 所示。血清中 morin 及 morin conjugates 之 平 均 濃 度 經 時 變 化 圖 如 Fig. 1-4~1-6 所 示 ， 利 用
WINNONLIN 求出 morin 之藥物動力學參數，如 Table1-11~1-18 所示。
兔子靜脈注射桑色素 10.0 mg/kg 與 20.0 mg/kg 兩種劑量後，血藥 濃度分別套入一室及二室型模式，所得之平均血藥面積分別為 2144.3
±321.6 與 19266.5 ±3854.9 nmol· min·ml-1，兩者之間的差異遠超過 兩倍，而達九倍之多；排除半衰期分別為 7.9 ±2.0 與 28.6 ±10.5 min；分佈體積分別為 0.15 ±0.04 與 0.94 ±0.4 L；全身清除率分別 為 0.013 ±0.002 與 0.003 ±0.0005；平均滯留時間為 11.4 ± 2.9 與 512.7 ±275.1 min。兩種劑量間上述參數的差異經 unpaired Student’s t-test 分析，顯示高劑量的排除半衰期、分佈體積與平均滯留時間皆 明顯高於低劑量，而全身清除率遠低於低劑量，皆達統計學上的顯著 意義 (p<0.05)。靜脈注射的結果顯示，個體差異很大，並且 morin 呈 現非線性動力學行為。兩劑量的結合態代謝物分別為 41 %及 23 % (p<0.05)，表示在高劑量情況下代謝過程會被飽和，因此循環於血中 的結合態代謝物比率顯著減少。
兔子口服投予桑色素 50.0 mg/kg 時，只偵測到少數的檢品含有原 型桑色素，因此無法計算其原型桑色素之動力學參數。口服桑色素 100.0 mg/kg 後，經非室性模式計算，其平均血藥面積為 5473.9 ± 415.9 nmol· min·ml-1，平均血峰濃度為 26.5 ±9.4 nmol/ml-1，平均滯留 時間為 128.9 ±11.0 min，兩劑量的結合態代謝物分別為 57 %與 13 %
(p<0.05)。血峰濃度、AUC 和劑量不呈一定的比例，顯示高劑量下有 代 謝 飽 和 的 現 象 發 生 ， 藥 物 代 謝 所 須 之 glucuronyl transferase / sulfotransferase 明顯不足供高劑量 morin 之代謝，而使得自由態的 morin 反而較結合態為多，排除速率變慢，因此口服給藥之桑色素體 內動態亦顯示非線性模式，與靜脈注射之結果一致。
(a) (b) (c)
Retention time (min)
Fig. 1-1 Chromatogram of morin (M) and ethyl paraben as an internal standard (IS) in rabbit serum ; (a) blank serum, (b) after iv administration (20.0 mg/kg), M:
49.6 µg/ml, IS: 10.0 µg/ml (c) after oral administration (100.0 mg/kg), M:
18.1 µg/ml, IS: 2.0 µg/ml
Table 1-1. Intra-day and inter-day analytical precision and accuracy of morin.
Precision Accuracy
Conc.
(μg/ml) Intra-day Inter-day Intra-day Inter-day Mean ±S.D. (C.V.%) Mean ±S.D. (C.V%) Relative error(%) Relative error(%)
25.00 26.01 ±0.07 0.3 25.46 ±0.82 3.2 +4.0 +1.9
12.50 12.06 ±0.49 4.0 11.73 ±0.57 4.9 +1.9 -6.2
6.25 5.74 ±0.15 2.6 5.76 ±0.11 1.9 -8.2 -7.8
3.13 3.04 ±0.06 1.9 3.07 ±0.08 2.6 -2.8 -1.7
2.34 2.26 ±0.02 0.8 2.29 ±0.05 2.2 -3.3 -2.1
1.56 1.70 ±0.07 4.1 1.70 ±0.07 4.1 +8.7 +9.3
n=3
Table 1-2. Recovery (%) of morin from rabbit serum
Conc. (μg/ml) Mean (%) ±S.D.
50.00 57.88 ±0.06
12.50 54.69 ±0.06
3.13 67.64 ±0.14
n=3
Fig. 1-2 Stability of morin in serum at – 30 ℃. (n=3)
Fig. 1-3 Morin concentrations in serum detected at various time points during Incubation with glucuronidase/sulfatase at 37 ℃. (n=3)
Table 1-3. Morin concentrations (nmol/ml) in serum of six rabbits after intravenous administration of morin (10.0 mg/kg=33.1μmol/kg).
ND : not detectable.
Table 1-4. Morin glucuronide/sulfate concentrations (nmol/ml) in serum of six rabbits after intravenous administration of morin (10.0 mg/kg).
Table 1-5. Morin concentrations (nmol/ml) in serum of six rabbits after intravenous administration of morin (20.0 mg/kg=66.2μmol/kg).
ND : not detectable.
Table 1-6. Morin glucuronide/sulfate concentrations (nmol/ml) in serum of six rabbits after intravenous administration of morin (20.0 mg/kg).
Table 1-7. Morin concentrations (nmol/ml) in serum of six rabbits after oral administration of morin (50.0 mg/kg=165.4μmol/kg).
Table 1-8. Morin glucuronide/sulfate concentrations (nmol/ml) in serum of six rabbits after oral administration of morin (50.0 mg/kg).
Table 1-9. Morin concentrations (nmol/ml) in serum of five rabbits after oral administration of morin (100.0 mg/kg=330.9μmol/kg).
ND : not detectable.
Table 1-10. Morin glucuronide/sulfate concentrations (nmol/ml) in serum of five rabbits after oral administration of morin (100.0 mg/kg).
Table 1-11. Individual pharmacokinetic parameters of morin after an intravenous dose of 10.0 mg/kg.
Rabbits Parameters
a b c d e f Mean ±S.E.
Volume 0.35 0.08 0.10 0.10 0.14 0.10 0.15 ±0.04
AUC 0-∞ 1442.9 2357.7 2905.8 1548.5 3193.9 1416.7 2144.3 ±321.6
t1/2 15.4 5.6 7.5 4.0 12.2 2.8 7.9 ±2.0
Cl 0.016 0.010 0.009 0.018 0.008 0.016 0.013 ±0.002
MRT 22.2 8.13 10.8 5.8 17.6 4.1 11.4 ±2.9
Table 1-12. Individual pharmacokinetic parameters of morin after an intravenous dose of 20.0mg/kg.
Rabbits Parameters
a b c d e f Mean ±S.E.
Volume 0.14 0.24 0.76 2.16. 2.17 0.15 0.94* ±0.4
AUC 0-∞ 17721.7 10656.3 14991.4 26013.4 34854.8 11361.5 19266.5 ±3854.9
t1/2 14.4 13.6 14.3 39.1 76.9 13.3 28.6* ±10.5
Cl 0.002 0.004 0.003 0.002 0.001 0.004 0.003* ±0.0005
MRT 58.98 57.88 236.8 1042.9 1641.8 37.9 512.7* ±275.1
* p< 0.05.
Table 1-13. Individual pharmacokinetic parameters of morin after an oral dose of 50.0 mg/kg.
Rabbits Parameters
a b c d e f Mean ±S.E.
Cmax 15.5 0 17.28 11.7 0 16.0 10.1 ±3.3
AUC 0-t 275.3 0 101.8 508.7 0 199.9 180.9 ±79.3
AUMC 5140.5 0 1094.3 14786.8 0 5996.3 4502.9 ±2313.5
MRT 18.7 0 10.8 29.1 0 30.0 14.8 ±5.5
Table 1-14. Individual pharmacokinetic parameters of morin after an oral dose of 100.0 mg/kg.
Rabbits Parameters
a b c d e Mean ±S.E.
Cmax 25.7 23.2 23.8 60.0 21.0 26.5 ±9.4
AUC 0-t 5396.4 5797.35 3945.7 6423.5 5806.8 5473.9 ±415.9 AUMC 623407.0 859563.0 365272.9 886348.3 872635.3 721445.3 ±101389.9
MRT 115.5 148.3 92.6 138.0 150.3 128.9 ±11.0
Table 1-15. Comparison of AUC0-∞ (nmol ⋅ min /ml) between morin and its conjugates after intravenous administration (10.0 mg/kg).
Rabbits Treatments
a b c d e f Mean ±S.E.
Morin+conjugates 4762.2 4316.8 5072.6 2461.8 4211.3 1970.2 3799.1 ±520.3 morin 1442.9 2357.7 2905.8 1548.5 3193.9 1416.7 2144.2 ±321.6 Conjugates 3319.3 1959.1 2166.7 913.3 1017.4 553.5 1654.9 ±420.1 Conjugates
Morin+conjugates 0.70 0.45 0.43 0.37 0.24 0.28 0.41 ±0.07
Table 1-16. Comparison of AUC0-∞ (nmol ⋅ min /ml) between morin and its conjugates after intravenous administration (20.0 mg/kg).
Rabbits Treatments
a b c d e f Mean ±S.E.
Morin+conjugates 28857.5 13653.3 19598.6 27680.3 38175.3 18612.6 24429.6 ±3616.1 morin 17721.7 10656.3 14991.4 26013.4 34854.8 11361.5 19266.5 ±3854.9 Conjugates 11135.8 2997.0 4607.2 1666.9 3320.5 7251.1 5163.1 ±1421.9 Conjugates
Morin+conjugates 0.39 0.22 0.24 0.06 0.09 0.39 0.23 ±0.06
Table 1-17 Comparison of AUC0-t (nmol ⋅ min /ml) between morin and its conjugates after oral
Table 1-18. Comparison of AUC0-t (nmol ⋅ min /ml) between morin and its conjugates after oral administration (100.0 mg/kg).
Rabbits Treatments
a b c d e Mean ±S.E.
Morin+conjugates 5902.1 7102.7 4282.0 8206.5 6154.3 6329.0 ±652.9 morin 5396.4 5797.4 3945.7 6423.5 5806.8 5473.9 ±415.9 Conjugates 505.7 1305. 3 336.3 1783.0 347.6 855.6 ±292.6 Conjugates
Morin+conjugates 0.09 0.18 0.08 0.22 0.06 0.13 ±0.03
Table 1-19. Comparison of pharmacokinetic parameters of morin between intravenous doses of 10.0 mg/kg and 20.0 mg/kg.
Treatments Vd AUC0-∞ t1/2 CL MRT
iV (10.0 mg/kg) 0.15±0.04 2144.3±321.6 7.9±2.1 0.013±0.002 11.4±2.9 iV (20.0 mg/kg) 0.94 ±0.4* 19266.5±3854.9 28.6 ±10.5* 0.003±0.0005* 512.7±275.1*
* P < 0.05
Time (min) conjugates (ο) in six rabbits after intravenous administration (10.0 mg/kg).
Time (min)
Fig. 1-5 Mean (±S.E.) serum concentration-time profiles of morin (l) and its conjugates (ο) in six rabbits after intravenous administration (20.0 mg/kg).
Time (min)
0 50 100 150 200 250 300 350
Serum concentration (nmol/ml)
0 10 20 30 40
Free form Conjugates
Fig. 1-6 Mean (±S.E.) serum concentration-time profiles of morin (•) and its conjugates (ο) in six rabbits after oral administration (100.0 mg/kg).
二、 桑色素於大白鼠體內對環孢靈吸收之影響
本實驗以大白鼠為模型，探討桑色素對 cyclosporin 吸收的影響。
血 中 cyclosporin 的 濃 度 採 用 螢 光 偏 極 免 疫 法 (Fluorescence Polarization Immuno Assay; FPIA) 分析，此方法為一種抗原抗體競 爭結合的免疫反應，利用待測藥物濃度與螢光偏極程度的反比關係，
通過測定樣品的偏極度大小，TDX 儀器會將此關係精確地換算出藥 物濃度單位。
本實驗以 7 隻大白鼠，單服 cyclosporin (10.0 mg/kg) 或併服桑 色素 (50.0 mg/kg) 後，定量血液中 cyclosporin 之濃度，結果顯示單 服 cyclosporin 於各隻大白鼠體內的吸收變異很大。經 WINNONLIN 之 非室體模式 (noncompartment model) 計算出動力學參數，並以 paired Student’s t- test 統計兩種給藥方式之間的差異。結果可分成兩子群，
其中四隻大白鼠併服 morin 後，血中 cyclosporin 之濃度如 Table 2-1~2-2 及 Table 2-5 所示。血藥經時變化圖如 Fig. 2-1~ 2-4 及 Fig. 2-8 所示。單服 cyclosporin 之平均 AUC 0-t為 2105. 8 ±1349.0 ng· hr· ml-1， 變異係數為 52.9 % ,Cmax為 249.5 ±66.3 ng· ml-1；併服桑色素之平均 AUC 0-t為 8422.3 ±749.9 ng·hr·ml-1， 變異係數為 17.8 %， Cmax為
變小的現象，以 paired Student's t-test 比較二者之曲線下面積 (AUC
0-t)，結果併服桑色素 AUC 0-t增加 65.1 %，達顯著差異 (p < 0.05)；
而另外三隻大白鼠併服 morin 後，血中 cyclosporin 濃度如 Table 2-3~2-4 及 Table 2-6 所示。血藥經時變化圖如 Fig. 2-5~ 2-7 及 Fig. 2-9 所 示 。 血 液 中 cyclosporin 之 平 均 AUC 0-t 為 13190.0 ± 556.9 ng·hr·ml-1，變異係數為 7.3 %，，Cmax為 553.5 ±64.9 ng·ml-1，併服 桑色素時平均 AUC 0-t為 8933.6 ±426.1 ng·hr·ml-1，變異係數為 8.3 %，
Cmax為 445.6 ±53.3 ng·ml-1。以 paired Student's t-test 比較二者之曲線 下 面 積 (AUC 0-t) ， 結 果 併 服 桑 色 素 者 面 積 明 顯 減 少 了 32.3 % (p<0.05)。因此當 cyclosporin 併服 morin 時，cyclosporin 的血中濃度 須要小心監測，以供劑量調整之參考。
近年來研究指出，控制 cyclosporin 之首渡代謝有二步驟，口服 給藥時，先受腸腔表面 P-glycoprotein 排除[54~57]，未被排除者再受腸 與肝之 CYP3A4 代謝[26,58]，因此影響 P-gp 與 CYP3A4 活性的藥物，
都可能造成 cyclosporin 吸收與代謝的改變。
本實驗結果顯示 morin 會造成 cyclosporin 之 AUC0-t及 Cmax增加 或減少。其中四隻單服 cyclosporin 時濃度偏低的大白鼠，於併服 morin 後，血中 cyclosporin 濃度顯著增高，此可能與體內 P-gp 及/或 CYP3A4 較多有關；另外三隻單服 cyclosporin 時血中濃度偏高的大白鼠，於
併服 morin 後，血中 cyclosporin 濃度卻顯著下降，此可能與體內 P-gp 及/或 CYP3A4 較少有關。根據體外翻腸實驗發現 morin 為 P-gp 之抑 制劑，這可解釋 morin 使 cyclosporin 血中濃度增加之部分原因，然而，
另外三隻大白鼠併服 morin 後濃度顯著減少，推測應有其他機轉存 在，或許與 MRP (multidrug resistance protein) [59~61]有關，值得進一步 探討。
Table 2-1.Cyclosporin blood concentrations (ng/ml) of four rats after oral administration of cyclosporin (10.0 mg/kg )alone.
Time
Table 2-2. Cyclosporin blood concentrations (ng/ml) of four rats after oral administration of cyclosporin (10.0 mg/kg) with morin (50.0 mg/kg).
Time
Table 2-3. Cyclosporin blood concentrations (ng/ml) of three rats after oral administration of cyclosporin (10.0 mg/kg) alone.
Time
Table 2-4. Cyclosporin blood concentrations (ng/ml) of three rats after oral administration of cyclosporin (10.0 mg/kg) with morin (50.0 mg/kg).
Table 2-5. Comparison of pharmacokinetic parameters of cyclosporin in rats between receiving cyclosporin alone and coadministration with morin.
Cyclosporin+morin
14.9 18.0 17.5 17.1
Table 2-6. Comparison of pharmacokinetic parameters of cyclosporin in three rats between receiving cyclosporin alone and coadministration with morin.
Cyclosporin+morin
14.3 19.3 17.9
Fig. 2-1 Whole blood concentration-time profile of cyclosporin after oral administration of cyclosporin (10.0 mg/kg) alone and coadministration with morin (50.0 mg/kg) to rat a.
Fig. 2-2 Whole blood concentration-time profile of cyclosporin after oral administration of cyclosporin (10.0 mg/kg) alone and coadministration with morin (50.0 mg/kg) to rat b.
time (hr)
Fig. 2-3 Whole blood concentration-time profile of cyclosporin after oral administration of
cyclosporin (10.0 mg/kg) alone and coadministration with morin (50.0 mg/kg) to rat c.
Fig. 2-4 Whole blood concentration-time profile of cyclosporin after oral administration of
cyclosporin (10.0 mg/kg) alone and coadministration with morin (50.0 mg/kg) to rat d.
Fig. 2-5 Whole blood concentration-time profile of cyclosporin after oral administration of cyclosporin (10.0 mg/kg) alone and coadministration with morin (50.0 mg/kg) to rat e.
Fig. 2-6 Whole blood concentration-time profile of cyclosporin after oral administration of
time (hr)
Fig. 2-7 Whole blood concentration-time profile of cyclosporin after oral administration of cyclosporin (10.0 mg/kg) alone and coadministration with morin (50.0 mg/kg) to rat g.
time (hr)
0 10 20 30 40
cyclosporin concentration (ng/ml)
100 200 300 400 500 600
700 cyclosporin
cyclosporin+morin
Fig. 2-8 Mean (±S.E.) blood concentration-time profiles of cyclosporin after administration of cyclosporin alone (l) and coadministration with morin (¡) in four rats.
Fig. 2-9 Mean (±S.E.) blood concentration-time profiles of cyclosporin after administration of cyclosporin alone (l) and coadministration with morin (¡) in three rats.
time (hr)
三.
黃酮 元對 P-gp 活性之影響Rhodamine 123 為 P-gp 的專一受質，本研究以 rhodamine 123 之螢光為指標，定量由漿膜層運送到黏膜層的 rhodamine，以瞭解黃 酮 元對 P-gp 活性之影響。檢量線係以螢光強度為 y 軸，rhodamine 123 濃度為 x 軸，作線性迴歸，並求出檢量線方程式及相關係數，所 得 rhodamine 123 之檢量線方程式為 y =132.3χ- 2.6 (r =0.997)。檢品 依檢量線定量 rhodamine 123，結果如表 3-1~3-10 所示。再由 ANOVA 比較空白組與給藥組之間的差異，結果顯示桑色素 200.0
µ
M 與 400.0µ
M 均對空腸與迴腸的 P-gp 有抑制作用，並達統計上的意義 (p <0.05)，且呈現出劑量依賴性，劑量越大抑制效果越強；槲皮素在空腸 的部分對 P-gp 有抑制作用，但未達統計上的意義，對迴腸 P-gp 抑制 作用則達統計學上的意義 (p < 0.05)；柚皮 元無論在空腸與迴腸皆 對 P-gp 的活性無顯著影響，如圖 3-1 ~ 3-4 所示。因此，我們認為桑 色素與槲皮素對空腸與迴腸之 P-gp 活性為抑制作用，此結果與 1997 年發表槲皮素為 P-gp 抑制劑的結果相符[62]，然而卻與 1994 年發表槲 皮素對 HCT-15 colon cells 之 P-gp 活性為活化作用之文獻結果相反
[30]，此岐異尚待更多的研究來釐清。
Table 3-1. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted jejunum (control group, n=3)
Table 3-2. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted jejunum in the presence of morin at concentration of 200.0 µM (n=5).
Table 3-3. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted jejunum in the presence of morin at concentration of 400.0 µM (n=5).
Rats
Table 3-4. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted jejunum in the presence of quercetin at concentration of 200.0 µM (n=3)
Table 3-5. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted jejunum in the presence of naringenin at concentration of 200.0 µM (n=4).
Table 3-6. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted ileum (control group, n=4)
Table 3-7. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted ileum in the presence of morin at concentration of 400.0 µM (n=5)
Rats
Table 3-9. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted ileum in the presence of quercetin at concentration of 200.0 µM (n=4).
Table 3-10. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted ileum in the presence of naringenin at concentration of 200.0
Table 3-10. Transport of rhodamine 123 (µg/ml) from serosal to mucosal side across the everted ileum in the presence of naringenin at concentration of 200.0