為了進一步鑑定甲基化與否對甲基接受蛋白分佈情形的影響，我 們在培養淋巴母細胞時以 20 µM 的 AdOx 處理三天，AdOx 會間接抑 制甲基轉移? 的活性，這樣一來淋巴母細胞內的甲基接受蛋白就會呈 低甲基化的狀態，再以不同的離心力將淋巴母細胞的萃取液分為 nucleus、ribosomal 和 cytosolic fraction (Corbin et al., 1997)。這些材料 拿來做實驗前，由於已知 FMRP 主要會存在核醣體之 fraction (Lin et al., 1996)，所以我們先利用 anti-FMRP 做西方點墨法確立 fraction 分 離的效果，結果 FMRP 的確大量出現在 ribosome fraction (圖十五：
lane2、4、6)。分離效果好的 subcellular fraction 即可用其它甲基接受 蛋白的抗體，鑑定甲基化與否對甲基接受蛋白分佈情形的影響。結果 如下所述：
1.對 FMRP 於淋巴母細胞不同 subcellular fraction 中分佈之影響:
已知 FMRP 為 FMR1 (fragile X mental retardation 1) 基因產 物，其含有 2 KH domain 及一 C 端之 RGG 區域，會存在於 ribosomal fraction 中 (Willemsen et al., 1996)，因此以此抗體進行研究。
其結果如圖十五所示:FMRP 的訊號以 ribosomal fraction 最強，以 AdOx 處理過的細胞其核內的 FMRP 訊號大大增強， ribosomal、
cytosolic fractions 則淢弱。
2.對 hnRNP A1 於淋巴母細胞不同 subcellular fraction 中分佈之 影響:
hnRNP A1 是典型的甲基接受蛋白之一，因此以此抗體進行研 究。其結果如圖十六所示: hnRNP A1 的訊號主要出現在 ribosomal fraction、核內亦有微弱訊號出現、細胞質則無訊號產生。以 AdOx 處理過的細胞其 hnRNP A1 蛋白於胞內分佈情形沒有改變。
3.對 hnRNP A2/B1 於淋巴母細胞不同 subcellular fraction 中分佈 之影響:
hnRNP A2/B1 是典型的甲基接受蛋白之一，因此以此抗體進行研 究。其結果如圖十七所示：加 AdOx 的 (N) hnRNP A2/B1 訊號增強，
加 AdOx 的 (R) hnRNP A2/B1 訊號減弱。
4. 對 含 有 mono/dimethylarginine 的 蛋 白 於 淋 巴 母 細 胞 不 同 subcellular fraction 中分佈之影響:
此抗體 (7E6) 能辨識形成精胺酸單甲基或雙甲基化的蛋白，因 此以此抗體進行研究。其結果如圖十八所示：以 AdOx 處理過的細胞 核內 mono/dimethylarginine 訊號增強。
5.對 FXR2 於淋巴母細胞不同 subcellular fraction 中分佈之影響:
FXR2 和 FMR1 有 50%相同，且具有 KH 和 RNA 結合 domain。
因此以此抗體進行研究。其結果如圖十九所示:以 AdOx 處理過的細胞 其 FXR2 蛋白於 (N) 訊號增強 (C) 減弱。
6.對 Sam68 於淋巴母細胞不同 subcellular fraction 中分佈之影響:
Sam68 (Src-associated in mitosis 68 kDa) 蛋白參與有絲分 裂，具有 KH RNA 結合 domain 和 RGG box，而其 RGG 序列會受 PRMT1、
RMT1 催化形成精胺酸單甲基及雙甲基化 (Bedford et al., 2000) 。因此 以此抗體進行研究。其結果如圖二十所示: Sam68 的訊號主要出現在 細胞質、核內次之、核醣體最弱。以 AdOx 處理過的細胞其 Sam68 蛋 白於核內及核醣體有增加的現象。
7.對 PRMT1 於淋巴母細胞不同 subcellular fraction 中分佈之影響:
PRMT1 為最主要的第一型蛋白質精胺酸甲基轉移? ，因此以此 抗體進行研究。其結果如圖二十一所示:以 AdOx 處理過的細胞其 PRMT1 蛋白在細胞質、核及核醣體的訊號皆稍微增強。
8.對 nucleolin 於淋巴母細胞不同 subcellular fraction 中分佈之 影響:
nucleolin 是核內主要的磷蛋白質，會和 preribosomal RNA 結合，
含有 RGG domain 而 其 RGG 序列之精胺酸會被修飾為雙甲基化
(Najbauer et al., 1993)。因此以此進行研究。其結果如圖二十二所示:
nucleolin 的訊號主要出現在 ribosomal fraction、核內亦有微弱訊 號出現、細胞質則無訊號產生。以 AdOx 處理過的細胞其 nucleolin 蛋 白於胞內分情形沒有改變。