圖十、利用 PRMT1 抗體檢測 S3, S4 fractions 和 003 淋巴母細胞中 的 PRMT1 含量
分別取 30 µg 的豬腦萃取蛋白 (S3，S4 fractions) 和淋巴母 細胞萃取蛋白，以西方點墨法進行分析所得的結果，所用抗體為 mouse anti-PRMT1。
(A)
S3
S4 003
C10 23 24 25 26 27 28 29 30 31
(B)
圖十一、分析過完 gel filtration 色層分析法的 S3 和 S4 fractions 的 甲基轉移? 活性
250 µl Samples 打入 superdex 200HR gel filtration 管柱 (24 ml )。管柱以 20mM NaH2PO4 (PH 7.3, 流速 0.4 ml/min) 進行平衡和 eluted，取 S3 和 S4 的 column fractions 每管各 11 µl 分析甲基轉移?
活性如圖 A. B.所示。
(C)
C10 25 26 27 28 29 30 31 32 33
0 1 2 3 4 5 6
20 25 30 35 管
S3 S4
(C) 將 S3 和 S4 的 column fractions 所得的甲基轉移? 活性壓 片結果，以數位影像分析儀定出每管 column fractions 的相對強度。
(A)
(B)
圖十二、以 Mono Q 陰離子交換色層分析法分析 S3 和 S4 fractions 取 1000 µl S3 和 S4 Samples 打入 Mono Q 陰離子交換管柱。管柱 0~5 分鐘時以 100% buffer A (0.02M Tris PH 7.5 流速 1 ml/min)，5~15 分鐘時 buffer 由 A 慢慢轉換為 B，15~20 分鐘時以 100% buffer B (0.02M Tris 、1 M NaCl PH 7.5 流速 1 ml/min) 進行 eluted，S3 和 S4 在波長 A280下的色層分析結果如圖 A. B.所示。
(C)
(D)
(C) 取 S3 的 column fractions 每管各 11 µl 分析甲基轉移? 活 性。 (D) 取 S4 的 column fractions 每管各 11 µl 分析甲基轉移?
活性。
(A)
(B)
13 14 15 16 17 18 19 20
13 14 15 16 17 18 19 20
(B)
圖十三、以銀染分析過完 gel filtration 色層分析法的 S3 和 S4 fractions 中所含的蛋白
250 µl Samples 打入 superdex 200HR gel filtration 管柱 (24 ml )。管柱以 20 mM NaH2PO4 (PH 7.3, 流速 0.4 ml/min) 進行平衡和 eluted，取 S3 和 S4 的 column fractions 每管各 30 µl 進行銀染。如圖 A (S3)、B (S4) 所示。
圖十四、以 MBP 分析 S3 和 S4 fractions 中所含的第二型甲基轉移
? 活性
以 5 µg 的第二型甲基接受蛋白 MBP 做受質 (lane 1、3) ， 和 20 µg 的 S3、S4 fractions 進行甲基化反應後，壓片三天所得結果。”+”
表示有加 MBP。
1 2 3 4
S3+
S3- S4+
S4-
圖十五、分析加入 AdOx後 FMRP 在細胞內的分佈變化
淋巴母細胞分別培養在有加沒加 AdOx 的培養液中72小時後分 為 cytosolic (C)、ribosomal (R) 和nuclear (N) fractions。取等量的蛋白 (30 µg) 以12.5% SDS-PAGE將蛋白分離後以西方點墨法分析。抗體為 anti-FMRP (CHEMICON, 1:5000)。箭頭所標示處為FMRP。
Adox ＋ － ＋ － ＋ －
N N
R
R C C
←
FMRP圖十六、分析加入AdOx後hnRNP A1在細胞內的分佈變化
淋巴母細胞分別培養在有加沒加AdOx的培養液中72小時後分為 cytosolic (C)、ribosomal (R) 和nuclear (N) fractions。取等量的蛋白 (30 µg) 以 12.5% SDS-PAGE將蛋白分離後以西方點墨法分析。抗體為 anti- hnRNP A1 antibodies (Santa Cruze, 1:800)。箭頭標示處為hnRNP A1。
Adox ＋ － ＋ － ＋ －
N N R R C C
←
hnRNP A1圖十七、分析加入 AdOx後 hnRNP A2/B1 在細胞內的分佈變化
淋巴母細胞分別培養在有加沒加AdOx的培養液中72小時後，藉 由不同的離心力分為 (參照材料與方法) cytosolic (C)、ribosomal (R) 和 nuclear (N) 等 三 個 fractions。 取 等 量 的 蛋 白 (30 µg) 以 12.5%
SDS-PAGE將 蛋 白 分 離 後 以 西方點墨法分析 。 抗體為 anti-hnRNP A2/B1 (Santa Cruze, 1:800)。 箭頭標示處為hnRNP A2/B1 (36 kDa)。
Adox ＋ － ＋ － ＋ －
N N R R C C
←
hnRNP A2/B1圖十八、分析加入 AdOx後含有 mono/dimethylarginine 的蛋白在細 胞內的分佈變化
淋巴母細胞分別培養在有加沒加 AdOx 的培養液中 72 小時後，
藉由不同的離心力分為 (參照材料與方法) cytosolic (C)、ribosomal (R) 和 nuclear (N) 等三個 fractions。取等量的蛋白 (30 µg) 以 12.5%
SDS-PAGE 將蛋白分離後以西方點墨法分析。抗體為 anti-methyl arginine antibodies (abcam, 1:200) 。
Adox ＋ － ＋ － ＋ －
N N R R
C C
←
←
←
←
←
圖十九、分析加入 AdOx後 FXR2 蛋白在細胞內的分佈變化
淋巴母細胞分別培養在有加沒加AdOx 的培養液中72小時後，藉 由不同的離心力分為 (參照材料與方法) cytosolic (C)、ribosomal (R) 和 nuclear (N) 等 三 個 fractions。 取 等 量 的 蛋 白 (30 µg) 以 12.5%
SDS-PAGE將 蛋 白 分 離 後 以 西 方 點 墨 法 分 析。 抗 體 為 anti-FXR2 antibodies。箭頭標示處為FXR2 (95 kDa)。
Adox ＋ － ＋ － ＋ －
N N R R C
C
←
FXR2圖二十、分析加入 AdOx後 Sam68 蛋白在細胞內的分佈變化
淋巴母細胞分別培養在有加沒加AdOx 的培養液中72小時後，藉 由不同的離心力分為 (參照材料與方法) cytosolic (C)、ribosomal (R) 和 nuclear (N) 等 三 個 fractions。 取 等 量 的 蛋 白 (30 µg) 以 12.5%
SDS-PAGE將 蛋 白 分 離 後 以 西 方 點 墨 法 分 析 。 抗 體 為 anti-Sam68 antibodies (1:10000) 。箭頭標示處為Sam68 (68 kDa)。
Adox ＋ － ＋ － ＋ －
N N R R C C
Adox ＋ － ＋ － ＋ －
N N R R
C
C
←
Sam68圖二十一、分析加入 AdOx 後 PRMT1 蛋白在細胞內的分佈變化
淋巴母細胞分別培養在有加沒加AdOx 的培養液中72小時後，藉 由不同的離心力分為 (參照材料與方法) cytosolic (C)、ribosomal (R) 和 nuclear (N) 等 三 個 fractions。 取 等 量 的 蛋 白 (30 µg) 以 12.5%
SDS-PAGE 將 蛋 白 分 離 後 以 西 方 點 墨 法 分 析 。 抗 體 為 anti-PRMT1antibodies (1:600) 。箭頭標示處為PRMT1 (40.5 kDa)。
Adox ＋ － ＋ － ＋ －
N N R R C C
←
PRMT1圖二十二、分析加入 AdOx 後 nucleolin 蛋白在細胞內的分佈變化
淋巴母細胞分別培養在有加沒加AdOx 的培養液中72小時後，藉 由不同的離心力分為 (參照材料與方法) cytosolic (C)、ribosomal (R) 和 nuclear (N) 等 三 個 fractions。 取 等 量 的 蛋 白 (30 µg) 以 12.5%
SDS-PAGE將蛋白分離後以 西方點墨法分析。抗體為 anti-nucleolin (1:4)。箭頭標示處為nucleolin (100 kDa)。
(A)
←
nucleolin7E6 －AdOx +AdOx
(B)
(C)
圖二十三、以共軛焦顯微鏡觀察 HeLa 細胞中蛋白的分佈情形
以抗體 (A)anti-7E6 (B)anti-PRMT1 (C)anti-Sam68 和細胞內特定 蛋白結合後，加入二次抗體 anti-FITC 後以波長 488 nm 雷射光激發後 所得結果。左排細胞：未加 AdOx；右排細胞：以 AdOx 處理三天。
附錄
Sam68 －AdOx +AdOx PRMT1 －AdOx +AdOx