三相系統結合離心分配層析法的分離結果

經由上述實驗參數進行 CPC 分離，所得到的結果(圖 4-5)，可看 到存在 I、II、III、IV 四個波峰，使用分管收集器收集這四個波峰，

波峰 I 收集 74-82 分鐘，波峰 II 收集 92-99 分鐘，波峰 III 收集 112-124 分鐘，波峰 IV 收集 133-145 分鐘。圖譜(圖 4-5)中，觀察到 80 分鐘 以前的訊號較為不穩定，應屬於沖堤上層相與中層相所造成的固定相 的流失，固定相流失速度大約為 1 mL/hr；當切換到下層相當移動相 時，就無固定相流失現象，所以訊號趨為穩定。

之後將波峰 I、II、III、IV 收集進行 HPLC 分析，在圖 4-7 上圖 中觀察到圖譜中在 a 位置波峰即為 quercetin-3,4-di-O-glucoside，且佔 圖譜總面積的 90 %，故將其純度以 90 %表示之。在圖 4-7 下圖中觀 察到圖譜中在 b 位置波峰即為 quercetin-4-O-glucoside，且佔圖譜總面 積的 92 %，故將其純度以 92 %表示之；圖 4-8 上圖為波峰 II 收集後 經由 HPLC 分析後的圖譜，下圖則為波峰 III 收集後之 HPLC 圖譜。

41

42

圖4-8、上圖:經由CPC分離後的波峰II收集後HPLC的分析圖譜 下圖:經由CPC分離後的波峰III收集後HPLC的分析圖譜 quercetin-3,4-di-O-glucoside (圖 4-9)，波峰 IV 所收集到的成分物，主 要成分為 quercetin-4-O-glucoside(圖 4-12) [28；29]；而波峰 II (圖 4-10)、

III(圖 4-11)所收集到的成分物極性較高成分種類也較為複雜，因本實

43

波峰 II、III 做進一步的探討。

表4-7、波峰I和IV偵測ESI-MS正電荷

波峰 滯留時間

(min)

分析物 〔M+H〕⁺ (m/z)

離子碎片 (m/z) I 74-82 Q3,4G 627 465〔M+H〕⁺-Glc

303〔M+H〕⁺-Glc-Glc IV 133-145 Q4G 465

303〔M+H〕⁺-Glc Glc : glucosyl unit

圖4-9、以ESI-MS正電荷分析波峰I的層析圖

44

圖4-10、以ESI-MS正電荷分析波峰II的層析圖

圖4-11、以ESI-MS正電荷分析波峰III的層析圖

45

圖4-12、以ESI-MS正電荷分析波峰IV的層析圖

4.4.8 樣品在 CPC 中分離過程的探討

在整個分離過程中，首先上層相(Hexane-rich)沖堤時先將一些洋 蔥分析物中極性較低的物質沖提出來，當轉換為中層相或下層相沖堤 時因分析物極性較高，所以上層相的角色影響甚小，故以下的探討，

將上層相影響不列入其中。如圖 4-13 所示，在波峰 I 中的成分屬於 比較中偏高極性，易溶於在 Acetonitrile-rich 的中層相故在分析過程中，

隨著中層相(移動相)的沖堤在 74 分鐘左右被沖提出來。在波峰 II 中 的成分的極性又比波峰 I 中的極性高，傾向分佈在 Water-rich 的下層 相中比 Acetonitrile-rich 的中層相還要來的多，故隨著中層相沖堤結束 後，在 92 分鐘處被下層相(移動相)沖提出來。而在波峰 III 中的成分

46

極性又比波峰 I、II 還要來的更高，所以隨著波峰 II 的分析物沖提出 來後，接著在 112 分鐘處被沖提出來。波峰 IV 中的主要成分極性只 比波峰 I 大一些，相較之下極性又比波峰 II、III 的成分還要來的小，

因為當移動相由中層相換成下層相，並且轉換到下降模式時，管柱中，

原本的固定相由下層相變為中層相，波峰 II、III 的成分極性 III > II，

且都傾向分佈在下層相，隨著下層相(移動相)依序沖堤出來；而波峰 IV 成分，與 II 以及 III 相較，較為傾向於分佈在中層相(固定相)最後 133 分鐘才被沖提出來。

47

48

4.4.9 回收量及純度的探討

在 130.0 g 的洋蔥中，經由樣品前處理 60% 的乙醇萃取後，可 得到 6.25 g 的洋蔥黏稠萃取物，其進樣量 0.26 g 於 CPC 做製備分離，

最後計算其回收量，再由 HPLC，波長 370 nm 來偵測，得到分析物 純度(表 4-6)(圖 4-6)。

表4-8、回收量及純度

樣品進樣量 回收量 純度

(I) Q3,4G 0.26 g 0.33 mg 90 %

(IV) Q4G 0.26 g 0.12 mg 92 %

4.5 結論

本實驗的目的，是以離心分配層析來製備分離、純化洋蔥中兩種 類黃酮成分，Quercetin-3,4-di-O-glucoside、Quercetin-4-O-glucoside，

並利用 ESI-MS 來確定這些兩成分結構。在本研究中，首次將三相溶 劑系統結合離心分配層析儀，實驗中，成功利用了 Hexane / Methyl tert-butyl ether / Acetonitrile / Water(2:2:3:3)(v/v)此組三相溶劑系統來 分離純化洋蔥樣品。

49

參考文獻

[1] B. Enkhmaa, K. Shiwaku, T. Katsube, K. Kitajima, E. Anuurad, M.

Yamasaki, Y. Yamane, "Mulberry (Morus alba L.) leaves and their major flavonol Quercetin 3-(6-Malonylglucoside) attenuate atherosclerotic lesion development in LDL Receptor–Deficient Mice".

Shimane Institute for Industrial Technology, Matsue City, Shimane 690-0816, Japan.

[2] C. R. Pace-Asciak, S. Hahn, Eleftherios P. Diamandis, G. Soleas, David M. Goldberg, "The red wine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation andeicosanoid synthesis:

Implications for protection against coronary heart disease". Clinica Chimica Acta, 235 (1995) 207-219.

[3] E. Middleton, JR., C. Kandaswami, T. C. Theoharides, "The effects of plant flavonoids on mammalian cells : implications for inflammation, heart disease, and cancer". Pharmacol Rev 52, (2000) 673-751.

[4] K. Kanazawa, H. Ashida, G. Danno, "Antimutagenic Mechanism of Flavonoids Against a Food-Derived Carcinogen, Trp-P-2, Elucidated with the Structure-Activity Relationships". F. F. for D. Pre. II, Chapter 8 (1988), pp 67-82.

[5] V. Lanzotti, "The analysis of onion and garlic". J. Chromatogr. A,

Quaglia, V. Fogliano, "Flavonoid and carbohydrate contents in tropea red onions : effects of homelike peeling and storage". J. Agric. Food Chem., 50(2002) 1904-1910.

50

[8] D. Caridi, V. C. Trenerry, S. Rochfort, S. Duong, D. Laugher, R.

Jones, "Profiling and quantifying quercetin glucosides in onion (Allium cepa L.) varieties using capillary zone electrophoresis and high performance liquid chromatography". Food Chem., 105 (2007) 691-699.

[9] 蔡 旻都 , 陳 皓君 , "蔬 果中類 黃酮之 抗氧 化作用 與生物 活性 ".

Chemistry (2006) Vol. 64, No.3, 353-315

[10] Y. Ito, "Development of Countercurrent Chromatography". Anal.

Chem., (1984), (56), 534-551.

[11] Y. Ito, N. B. Mandava, "Countercurrent Chromatography : Theory and Practice ". Marcel Dekker, Inc., New York, (1998).

[12] W. D. Conway, "Countercurrent Chromatography : Theory and Applications". VCH Publishers, Inc., (1990).

[13] Y. Ito, W. D. Conway, "High-Speed Countercurrent Chromatography

". John Wiley & Sons, Inc., (1996).

[14] H. T. Lu, Y. Jiang, F. Chen, "Application of high-speed counter-current chromatography to the preparative separation and purification of baicalin from the Chinese medicinal plant Scutellaria baicalensis". J. Chromatogr. A, 1017 (2003) 117–123.

[15] Q. Du, W.Cai, M. Xia, Y. Ito, "Purification of (+)-dihydromyricetin from leaves extract of Ampelopsis grossedentata using high-speed countercurrent chromatograph with scale-up triple columns". J.

Chromatogr. A, 973 (2002) 217–220.

[16] Y. Shibusawa, Y. Yamakawa, R. Noji, A. Yanagida, H. Shindo, Y.

Ito, "Three-phase solvent systems for comprehensive separation of a wide varietyof compounds by high-speed counter-current chromatography". J. Chromatogr. A, 1133 (2006) 119-125.

51

[17] A. Yanagida , Y. Yamakawa, R. Noji, A. Odaa, H. Shindo, Y. Ito, Y.

Shibusawa, "Comprehensive separation of secondary metabolites in natural products by high-speed counter-current chromatography using a three-phase solvent system". J. Chromatogr. A, 1151 (2007) 74-81.

[18] E. Delannay, A. Toribio, L. Boudesocque, J. M. Nuzillard, Z. H.

Monique, E. Dardennes, G. L. Dour, J. Sapi, J. H. Renault, "Multiple dual-mode centrifugal partition chromatography, a semi-continuous development mode for routine laboratory-scale purifications". J.

Chromatogr. A, 1127 (2006) 45-51.

[19] E. Delannay, A. Toribio, L. Boudesocque, J. M. Nuzillard, M. Hanrot, E. Dardennes, G. L. Dour, J. Sapi, J. H. Renault, "Multiple dual-mode centrifugal partition chromatography, a semi-continuous development mode for routine laboratory-scale purifications". J.

Chromatogr. A, 1127 (2006) 45-51.

[20] E. Gavioli, N. M. Maier, C. Minguillo´n, and W. Lindner,

"Preparative Enantiomer Separation of Dichlorprop with a Cinchona-Derived Chiral Selector Employing Centrifugal Partition Chromatography and High-Performance Liquid Chromatography: A Comparative Study". Anal. Chem., 76 (2004) 5837-5848.

[21] J. B. Friesen, G. F. Pauli, "Rational development of solvent system families in counter-current chromatography". J. Chromatogr. A, 1151 (2007) 51-59.

[22] Y. Ito, "Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography". J. Chromatogr. A, 1065 (2005) 145-168.

[23] W. D. Conway, Y. Ito, "Resolution in Countercurrent Chromatography". J. Liq. Chromatogr. 8, (12), (1985) 2198-2207.

52

[24] J. C. Delaunay, C. Castagnino, C. Che`ze, J. Vercauteren,

"Preparative isolation of polyphenolic compounds from Vitis vinifera by centrifugal partition chromatography". J. Chromatogr. A, 964 (2002) 123-128.

[25] N. Rubio, C. Minguillon, "Preparative enantioseparation of (±)-N-(3,4-cis-3-decyl-1,2,3,4-tetrahydrophenanthren-4-yl)-3,5-dinitr obenzamide by centrifugal partition chromatography". J. Chromatogr.

A, 1217 (2010) 1183-1190.

[26] I.A. Sutherland, G. Audo, E. Bourton, F. Couillard, D. Fisher, I.

Garrard, P. Hewitson, O. Intes, "Rapid linear scale-up of a protein separation by centrifugal partition chromatography". J. Chromatogr.

A, 1190 (2008) 57-62

[27] W. Zhi, Q. Deng, "Purification of salvianolic acid B from the crude extract of Salvia miltiorrhiza with hydrophilic organic/salt-containing aqueous two-phase system by counter-current chromatography". J.

Chromatogr. A, 1116 (2006) 149-152.

[28] P. Bonaccorsi, C. Caristi, C. argiulli, U. Leuzzi, "Flavonol glucosides in Allium species: A comparative study by means of HPLC-DAD-ESI-MS-MS". Food Chem., 107 (2008) 1668-1673.

[29] K. R. Price, M. J. C. Rhodes, "Analysis of the Major Flavonol Glycosides Present in Four Varieties of Onion (Allium cepa) and Changes in Composition Resulting from Autolysis". J Sci Food Agric., 74 (1997) 331-339.