影響固定相滯留量的因素

在離心分配層析中，液體固定相在管柱中滯留的多寡影響了分離 的效率，在較高的固定相滯留量下可提高對樣品的承載量和分離的解 析度。影響固定相滯留量及分離的效率的因素分為下列幾點[23]:

(a) 溶劑系統：在選擇適當的溶劑系統時必頇考慮溶劑極性、對溶質 的選擇性以及溶質在不同溶劑中的溶解度。一般而言，分析物在 兩相溶劑間最佳的分配係數 KD需在 0.2 ~ 5 之間，才能獲得較佳的

分離效果。但在二元的溶劑系統中，KD值要落在此範圍不容易，

因此，常藉由加入第三種甚至第四種可溶於原先兩者的溶劑，用 來調和原先溶劑在極性或是界面張力的差異。然後依 KD來判斷分

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離結果，並決定移動和固定相。

(b) 儀器轉速：在較高的轉速下，固定相越容易滯留在管柱中，且因 為轉動速度大，離心力也較大，因此還可以加速移動相與固定相 的分層，這兩個結果均可提供較高的固定相滯留量，在有關於離 心分配層析分離效果的研究中，若可以得到固定相滯留量越大，

解析度也較佳，所以在 CPC 機械結構可以承受的轉速之下，轉動 速度越快，分離效果越好。

(c) 移動相流速：當移動相流速越快時，越容易將固定相推出管柱，

因此固定相的滯留量會比較低。反之移動相流速若較慢，會達到 較佳的固定相滯留量，且可提高分離解析度，但相對地分離時間 會變長。

2.3.5 離心分配層析儀的應用 因為 CPC 的固定相與一般填充管柱相比，能有較大的固定相體 積，且具有放大特性，所以在 CPC 的研究以天然物製備分離為主流 [24]，而在對於化學品的純化分離方面研究亦不在少數。近年來也有 學者將 CPC 與鏡像選擇物結合，應用在分離鏡像異構物的分子[25]，

或是蛋白質的純化[26]，最後也都成功將其分離。

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第三章 實驗 3.1 實驗樣品和溶劑

(1) 洋蔥

購自 愛買 量販店的美國紅洋蔥。

(2) 溶劑

Deionized water, purified from Milli-Q plus, (Bedford, MA, USA) Ethanol, 99.5%, (景明化工股份有限公司)

Formic acid, 98% up, (ACROS, Geel, Belgium, USA)

Tetrahydrofuran, HPLC/Spectro grade, 99.8% (TEDIA, Fairfield, OH, USA )

n-Hexane, HPLC grade, 95%,(景明化工股份有限公司)

Methyl t-Butyl Ether (MTBE), HPLC grade, 99.8%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

Acetonitrile (ACN), HPLC grade, 99.9%, (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

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3.2 實驗儀器

(1) 離心分配層析儀

CPC 是由 Sanki (Tokyo, Japan)所生產，型號是 CPC 240，內部主 體由 12 個 disks 所構成，包含 2136 個 channels，最高可耐壓為 6.2×10⁶ N/m² (900 psi)，管柱總容積大約 240 毫升，此儀器的轉速可以控制在 0 - 2000 rpm。藉由轉動外部控制閥，就可輕易選擇上升模式或下降 模式的操作模式。

(2) 往覆式幫浦

此幫浦為 Series II Digital HPLC pump ，流速可由 0.01 mL/min - 9.99 mL/min，購買自 Pharma-Tech Research Company (Baltimore, MD, USA)。

(3) 高效能液相層析管柱

由 Polymer Laboratories 製造的 PLRP-S column (250 mm × 4.6 mm, 15 μm)，屬於 reverse phase column。

(4) 紫外光-可見光偵測器(UV-Visible Detector)

型 號 為 Bio-Rad Model 1801 UV-Visible detector (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)，偵測器外部與個人電腦連接，利用色層分析儀 數據處理系統(訊華公司，台北市)擇取實驗訊號。

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(5) 紫外光-可見光譜儀(UV-Visible Spectrophotometer) Hewlett Packard 8453, (Waldronn, Germany)。

(6) 離心機

型號為 EBA20 (Hettich, Germany)，最大轉速 6000 rpm，最大離 心力為 3421 g。

(7) 迴旋減壓蒸餾器

廠牌為 Buchi (Switzerland)，型號是 R-114。

(8) 分管收集器

廠牌為 Advantec (Tokyo, Japan)，型號是 CHF1215A。

(9) ESI-MS

廠牌為 Micromass (Manchester, England)，型號是 Quattro Micro，

主要使用分子量小於 2000 電灑游離法質譜。

(10) 果汁機

廠牌為 Gibson，型號是 GSN-6060G。

23

24

25

26

(6) 第二次平衡後，開啟 UV-Vis 偵測器(370 nm)，並等待訊號穩定。

(7) 注入洋蔥樣品溶液 5 mL，首先以上層相當移動相來沖提， 上升 模式，時間為 30 分鐘，並在樣品注入的同時紀錄層析訊號。

(8) 上層相沖堤 30 分鐘後，切換以中層相沖堤當移動相，上升模式，

時間 50 分鐘，持續記錄層析訊號。

(9) 最後，切換到下層相沖堤當移動相，並轉換為下降模式，時間 120 分鐘，記錄層析訊號。

(10) 每 1 分鐘收集一管，即每管中含有 1.2 mL 的樣品液。

(11) 實驗完成後，CPC 停止轉動，用氮氣將管柱內的液體吹出並收 集，紀錄有機相和水相的體積，上層有機相(移動相)的體積與總體積 相除就是固定相滯留率。

(12) 在 CPC 停止轉動的情況下，先以 300 mL 甲醇沖洗管柱，再以 300 mL 去離子水清洗，未流出之去離子水保存在 CPC 中。

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圖3-1、CPC實驗儀器裝置

包含了梯度幫浦、CPC 儀器、紫外光偵測器、以及分管收集器。

圖3-2、三相溶劑系統示意圖

3.3.6 HPLC 分析收集液實驗步驟

HPLC 實驗儀器裝置如圖 3-3 所示

(1) 每支收集管先用迴旋減壓蒸餾裝置把溶劑抽乾，再加入 1 mL 的 HPLC 沖堤的移動相溶解樣品，選擇用此移動相來溶解樣品，可避免 掉因為溶劑不同而產生的背景干擾訊號。

上層相 中層相 下層相

Hexane / MTBE / ACN / H₂O 體積比 ( 2 : 2 : 3 : 3 )

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(2) 使用 reversed phase HPLC 系統，先以純的 Acetonitrile 清洗管柱，

再用 solvent A [Tetrahydrofuran：0.1％(v/v) formic acid = 20：80 (v/v)]

當移動相沖堤管柱。

(3) 開啟 UV-Vis 偵測器，偵測波長設定在 370 nm，並等待訊號穩定。

(4) 注入洋蔥樣品溶液於六向閥的 20 μL sample loop 中，並將六向閥 由 inject 調至 load 的同時紀錄層析訊號。

圖3-3、HPLC實驗儀器裝置

包含了梯度幫浦、HPLC 管柱、紫外光偵測器。

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第四章 結果與討論 4.1 乙醇萃取洋蔥的濃度選擇

在進入 HPLC 與 CPC 分析之前，嘗試利用 300 mL 不同濃度的乙 醇水溶液(40％、60％、80％，v/v)做萃取。研究中，想分離出洋蔥中 的類黃酮成分，而在 60％的乙醇中所能萃取到的類黃酮成分較多，

最後選用其為萃取條件。

4.2 以 HPLC 分析洋蔥萃取出的黏稠物 4.2.1 HPLC 移動相的選擇

實驗中以依序分別為(A)、(B)三組不同的溶劑系統(表 4-1)分別當 為 HPLC 移動相，圖 4-1、上圖中，滯留時間在 2~5 min 之間的吸收 峰，以及下圖中，滯留時間在 4~8 min 之間的吸收峰，所屬的混合物 是極性較小的物質，波峰的解析度不佳，所含的物質較為複雜，所以 並沒收集鑑定之；而 peak a 與 peak b 兩波峰解析度較佳，並猜測可 能為類黃酮物質，於收集之後做 ESI-MS 鑑定分析，最後分析結果並 未發現另兩黃酮化合物。圖 4-1 層析圖譜結果顯示(B)組的溶劑系統 有較佳的解析度，故本實驗最後選用移動相 [Tetrahydrofuran：0.1％

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(v/v) formic acid = 20：80 (v/v)]為 HPLC 移動相條件。

表4-1、HPLC移動相

Tetrahydrofuran 0.1％(v/v) formic acid

(A) 25 75

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4.2.2 HPLC 分析結果

我們將洋蔥的萃取物，利用 HPLC 分離，流速 0.5 mL/min，可 以在 40 分鐘內，以波長 370 nm 的 UV-vis 偵測器偵測，得到層析圖(圖 4-1 下圖)，其將層析圖中兩波峰標記依序為 a 和 b，其依序的滯留時 間為 20.9 min 和 25.4 min，經由收集後以 ESI-MS 偵測之。

4.3 以質譜鑑定洋蔥成分的結構

藉由 HPLC 分離並收集 a、b 兩個目標物，分別收集後，再用減 壓迴旋蒸餾將溶劑抽乾，然後進一步由 ESI-MS 正電荷做結構鑑定，

此儀器是選用低解析度的模式，準確值到整數位。

4.3.1 以質譜鑑定 peak a 結構

經由 ESI-MS 正電荷分析結果(圖 4-2)可由圖中發現，〔M+H〕⁺ 為 627.1 m/z 的訊號，是加一個質子的離子訊號。465.1 m/z 是(〔M+H〕

+ -glucoside)失去一個葡萄糖苷基的訊號；而在 303.1 m/z 則是(〔M+H〕

+-glucoside-glucoside )失去兩個葡萄糖苷基的訊號，因此可知 peak a 主成分是 Quercetin-3,4-di-O-glucoside (Q3,4G)。

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4.3.2 以質譜鑑定 peak b 結構

由 ESI-MS 正電荷分析結果(圖 4-3)可由圖中發現，〔M+H〕⁺ 為 465.1 m/z 的訊號，是加一個質子的離子訊號。而 303.1 m/z 是(〔M+H〕

+-glucoside)失去一個葡萄糖苷基的訊號，因此可知 peak b 主成分為 Quercetin-4-O-glucoside (Q4G)。

圖4-2、peak a 測ESI-MS正電荷質譜圖

33

圖 4-3、peak b 測 ESI-MS 正電荷質譜圖

4.4 離心分配層析儀製備分離的實驗結果

4.4.1 配製不同的溶劑系統

一開始嘗試利用下列五組兩相溶劑系統(表 3-1)，針對洋蔥中兩 種類黃酮分析物以 HPLC 的波峰面積計算其分配係數，結果顯示兩分 析物皆傾向分佈在下層相，分佈情況不理想，所以此五組溶劑系統不 適合應用在 CPC 分離本實驗的洋蔥萃取物。

根據文獻[16；17]的研究，並開始嘗試三相系統的可行性。由文 獻得知，不同的溶劑比例，可使得分析物在各層中的分佈情況會有所 不同。故本實驗首先針對此三相溶劑系統，改變成分溶劑比例，來得

34

35 ethyl acetate / butanol / water

(2/1/4)(v/v) 0.15 --

ethyl acetate / butanol / water

(2/2/4) (v/v) 0.13 --

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根據文獻[11]應用在逆流層析儀中的研究，並開始針對三相系統 結合離心分配層析儀的可行性。過程中首先，針對(Hexane / Methyl tert-butyl ether / Acetonitrile / Water)的三相溶劑系統，改變各成分溶劑

的 比 例 ，來 得到平 衡 後 的上 、中、 下 層 相的 體積比 ， 上 層相 為 Hexane-rich，中層相為 Acetonitrile-rich，下層相則是 Water-rich。

4.4.3 三相系統結合離心分配層析儀沖堤時間的選擇

實驗過程中，首先以上層相做沖堤，接著以中層相沖堤，最後再 轉換為下層相做逆沖堤，所以各層相沖堤時間不同也是可能是影響分 析物是否可以被分離出來的因素之一。圖 4-4 中，沖堤時間為上層相 首先沖堤 30 分鐘，沖堤模式為上升法，接著中層相沖堤 40 分鐘，最 後以下層相轉為下降模式沖堤 50 分鐘，可以觀察到在 80 分鐘左右，

兩層析峰重疊區域太多，造成解析度太差，判斷為分析物在溶劑系統 中，沒有足夠的時間來分離開；而將中層相時間延長為 50 分鐘(圖 4-5)，結果發現在 80 分鐘處的 peak，明顯比圖 4-4 中的 peak 解析度 還要更佳，所以中層相(移動相)的適當的分離時間可直接影響 80 分 鐘處吸收峰的解析度。在 70 分鐘一個直線型的落差(spike)所造成的 因素是，當上升模式切換到下降模式時所造成的訊號。最後選擇上層

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min

相沖堤時間 30 分鐘，中層相沖堤時間 50 分鐘，下層相沖堤時間 120 分鐘做為本實驗三相系統的最佳化分析時間 (圖 4-5)。

圖4-4、以CPC來分離洋蔥萃取物，Hexane / Methyl tert-butyl ether / Acetonitrile / Water = 2：2：3：3 (v/v)，沖堤時間30-40-50 min

(上-中-下層)

圖4-5、以CPC來分離洋蔥萃取物，Hexane / Methyl tert-butyl ether / Acetonitrile / Water = 2：2：3：3 (v/v)，沖堤時間30-50-120 min

(上-中-下層)

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圖4-6、以CPC來分離洋蔥萃取物，Hexane / Methyl tert-butyl ether / Acetonitrile / Water = 2：2：3：2 (v/v)，沖堤時間30-50-120 min

(上-中-下層)

mAU

min

上 中 下

39

40

4.4.6 三相系統結合離心分配層析法的分離結果 實驗參數如表 4-4 所示。

經由上述實驗參數進行 CPC 分離，所得到的結果(圖 4-5)，可看 到存在 I、II、III、IV 四個波峰，使用分管收集器收集這四個波峰，

波峰 I 收集 74-82 分鐘，波峰 II 收集 92-99 分鐘，波峰 III 收集 112-124 分鐘，波峰 IV 收集 133-145 分鐘。圖譜(圖 4-5)中，觀察到 80 分鐘 以前的訊號較為不穩定，應屬於沖堤上層相與中層相所造成的固定相 的流失，固定相流失速度大約為 1 mL/hr；當切換到下層相當移動相 時，就無固定相流失現象，所以訊號趨為穩定。

之後將波峰 I、II、III、IV 收集進行 HPLC 分析，在圖 4-7 上圖 中觀察到圖譜中在 a 位置波峰即為 quercetin-3,4-di-O-glucoside，且佔

之後將波峰 I、II、III、IV 收集進行 HPLC 分析，在圖 4-7 上圖 中觀察到圖譜中在 a 位置波峰即為 quercetin-3,4-di-O-glucoside，且佔

在文檔中 以離心分配層析法結合三相溶劑系統製備分離洋蔥中兩種類黃酮成分 (頁 32-0)