(一一一)儀器與設備一儀器與設備儀器與設備 儀器與設備
名稱 廠牌
二位分析天平(2-Decimal Balance) OHAUS 四位分析天平(4-Decimal Balance) METTLER 五位分析天平(5-Decimal Balance) METTLER
高溫烘箱(Oven) YIH DER
微電腦酸鹼度計 (pH Meter) METTLER 高溫高壓滅菌釜 (Autoclave) TOMIN 旋轉式恆溫震盪培養箱 (Orbital Shaker Incubator) YIH DER 微量離心機 (Micocentrifuge) Thermo 高速冷凍離心機 (Centrifuge, Large Scale) Hitachi 高速冷凍離心機 (Centrifuge, Middle Scale) Eppendorff 超高速離心機 (Ultracentrifuge) Hitachi
生物反應器 (Bioreactor) Maior Science SDS 膠體電泳(SDS Vertical Slab Gel Electrophoresis) Bio-Rad 蛋白質液相層析系統(ÄKTA Prime Plus) GE Healthcare 蛋白質液相層析系統(ÄKTA FPLC) GE Healthcare 擩動幫浦(P1 Pump) GE Healthcare 高壓均質機(French Press) Thermo
超微膜濃縮裝置(Amicon Stirred Ultrafiltration) Amicon 攪拌加熱器(Hot Plate Stirrer) Corning
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分光光度計(Ultraviolet/Visual Spectroscopy) Thermo 石英微電子天秤(QCM；AFFINIX QNµ) Initium
金基板(Au sensor) Initium
(二二二)藥品及試劑二藥品及試劑藥品及試劑 藥品及試劑 名稱
名稱
名稱名稱 廠牌廠牌廠牌廠牌
Acrylamide 29:1, 40% J.T.Baker 5-Aminolevul Acid Hydrochloride(ALA) Merck Ammonium persulfate (APS) Sigma
Ampicillin Genemark
Agarose UniRegion
Alcohol Fluka
Bradford reagent Bio-Rad Bio-Rad Brilliant Blue G Sigma-Aldrich Bromphenol Blue sodium salt Sigma-Aldrich Deoxyribonuclease I Sigma-Aldrich DL-Dithiothreifol (DTT) Sigma-Aldrich Dimethly Sulfoxid(DMSO) Sigma-Aldrich
Dithiobis(C2-NTA) 同仁化學
EDTA J.T.Baker
Glycerol Sigma-Aldrich
Glycine Sigma-Aldrich
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HI load Superdex 75TM GE Healthcare HisTrapTM HP GE Healthcare Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich Hydrochloric Acid J.T.Baker
HEPES Sigma-Aldrich
Isopropylthiogalactoside (IPTG) Bioshop Bioshop
Imidazole Sigma-Aldrich
LB broth Sigma-Aldrich
Nickel(II) sulfate Sigma-Aldrich Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich
Protein Marker Genemark
SDS Sigma-Aldrich
Sodium Chloride J.T.Baker Sodium hydroxide Sigma-Aldrich Sodium Dithionite Sigma-Aldrich Sulfuric acid Sigma-Aldrich
Tris -Base J.T.Baker
HTP (Hydroxyapatite) Sigma-Aldrich
Hemin CALBIOCHEM
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(三三三)實驗步驟三實驗步驟實驗步驟 實驗步驟
1.在原核系統誘導蛋白質表現
為了快速取得大量的 PGRMC1，我們將其基因轉殖到表現型載 體大腸桿菌BL21(pET-21a)表現蛋白。對微生物生化工程來說，大腸 桿菌生長快速易培養，適合使用在本實驗上，因此選擇此種方式。
隨 後 再 將 已 轉 殖 PGRMC1 重 組 蛋 白 的 表 現 型 載 體 大 腸 桿 BL21(pET-21a)放入含有 100 µg/ml ampicillin 的 100 ml LB 液態培養 基中，置於37 ℃迴旋式恆溫培養箱以 230 rpm 培養十二小時，隨後 將培養液放大至20 倍體積的 100 µg/ml ampicillin LB 液態培養基。繼 續以相同條件培養至 OD600為 0.6~0.8 之間後加入最終濃度為 1 mM 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl--d-thiogalactopyranoside ： IPTG），後以 25℃低溫誘導蛋白表現，25 個小時後以液態氮凍菌保 存在-80℃。
2.誘導血基質表現
PGRMC1為一種血基質蛋白(hemeprotin)，藉由添加血基質的前 驅物5-胺基戊酮酸（5-Amino-4-oxopentanoic acid hydrochlorid：ALA）
系統表現血基質(Heme)，用來提供給大量表現的PGRMC1重組蛋白。
原核系統表現血紅素方式為在上述誘導蛋白質的表現的過程中，加入 最終濃度為1 mM的IPTG（isopropyl--d-thiogalactopyranoside）同時加 入最終濃度1mM ALA可以大量誘導Heme的表現。
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3.細胞破碎均質化
取約10~15g 保存於-80℃之濕菌置於冰上解凍，加入 1~1.5 倍體 積20mM Tris-base pH =7 的緩衝溶液回溶，待完全溶解後加入少量的 DNaseＩ與苯甲基磺醯氟 (Phenylmethanesulfonyl fluoride: PMSF)；並 將菌液倒入預冷於4℃的 French Press cell 中；以 1280 psi/cm2的壓力 將細胞破碎，收集破菌液體重複上述French Press 破菌步驟三次，以 確保大部分菌體完成溶裂。
將破菌完成的破菌液以高速離心機 12000 rpm(17126g)轉速在 4℃下離心 30 分鐘。在高速離心後取上層水溶液繼續以超高速離心機 55000rpm(26000g)轉速在 4℃下離心 1 小時，以除去破碎不完全細胞 及細胞殘骸。隨後取超高速離心後的上清液體以0.22µm 的過濾膜過 濾，進行下一步驟純化。
4.目標蛋白質純化
一開始選用 HisTrapTM HP(GE Healthcare)來做為 PGRMC1 蛋白 質第一階段的純化管柱，由於HisTrapTM HP(GE Healthcare)帶有 Ni2+
離子，屬於金屬親和性管柱，可以應用在已帶有6 個 histidine (metal affinity tag)的 PGRMC1 重組蛋白上。
先將 HisTrapTM HP(5ml)管柱使用擩動幫浦(P1 Pump)，以 20mM Tris-base pH =7 的緩衝溶液平衡。平衡後再使用破菌上清液體以 1 ml/min 流速來沖洗管柱至 3~4 個循環。接著藉由 ÄKTA-prime plus(GE Healthcare) 蛋白質純化系統進行純化。首先，先配置兩瓶緩衝溶液 A 為20 mM Tris-base、500mM NaCl 、pH =7，緩衝溶液 B 為 20 mM
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Tris-base、500mM NaCl、500mM Imidazole、pH =7。使用 4％的緩衝 溶液B、1 ml/min 的流速來沖洗管柱，將沒有被管柱內 Ni2+離子抓住 的蛋白質沖提出來，隨後再以階段式提高Imidazole 濃度，分別為 20
％、40％、60％、100％緩衝溶液 B 以同樣的 1 ml/min 流速流洗，並 將其沖提出來的蛋白質收集起來。改變 Imidazole 濃度的基準為特定 濃度下出現峰值，直到儀器所顯示的吸收光譜為水平，再改變至另一 充的管柱藉由ÄKTA-prime plus (GE Healthcare)蛋白質純化系統進行 純化。預先配置兩瓶緩衝溶液A為20 mM Tris-base、pH =7，緩衝溶液 B為20 mM Tris-base、400Mm KH2PO4、 pH =7。固定2 ml/min流速，
以緩衝溶液A平衡管柱至儀器所顯示的吸收光譜為水平，將樣品以流 速3 ml/min注入管柱。注入後使用流速2 ml/min緩衝溶液A將沒有被管 柱內HTP(Hydroxyapatite )吸附的蛋白質沖提出來，在以階段式提高磷
在培養大腸桿菌時添加
Superdex 75TM(GE Healthcare)
管柱中進行流析，並收集流析出的液體 將其具有明顯波峰的各個收集管收集起來 蛋白質電泳分析確認之
最後將純化好的蛋白質收集起來 的Amicon超微膜濃縮裝置進行濃縮
mM Tris-base、pH =7的緩衝溶液如此反覆稀釋和濃縮 的鹽類濃度降低至10Mm
Superdex 75TM(GE Healthcare)管柱並藉由ÄKTA 蛋白質純化系統進行純化。預先以20 mM Tris pH =7配製好的沖提溶液(elution buffer)預先平衡好 (GE Healthcare)管柱，再將樣品以0.1ml/min的流速注入