(一一一)蛋白質純化一蛋白質純化蛋白質純化 蛋白質純化
先前的實驗室同仁已將 PGRMC1 基因轉殖到表現型載體大腸桿 菌(E.coli；BL21 pET-21a)並成功表現目標蛋白；因此本實驗利用塑膠 培養瓶放置在迴旋式恆溫培養箱做液態培養。培養後2L 的液態培養 液可得到約10~15g 帶有表現目標蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli)。
再經由French Press 使細胞均質化，並再利用高速與超高速離心將其 未破碎完成之細胞與細胞殘骸；離心之後將其上清液以0.22µm 的過 濾膜過濾，並進入純化階段。
在培養和純化 PGRMC1 時分成兩組樣品；樣品分別為在培養大 腸桿菌階段，未添加ALA 誘導血基質 Heme 和有添加 ALA 誘導血基 質 Heme 這兩個部分。純化過程有些許不同；培養時未添加 ALA 誘 導血基質 Heme 的大腸桿菌進入純化階段，粗蛋白藉由 ÄKTA-prime plus 蛋白質純化系統並經由親和性、非特異性離子交換管柱進行純化，
純化結果以14％SDS-PAGE 蛋白質電泳分析確認如圖(十六)所示。而 在培養大腸桿菌時添加ALA 誘導血基質(Heme)表現的 PGRMC1 重組 蛋白樣品，在純化時步驟與培養時未添加 ALA 誘導血基質 Heme 的 蛋白樣品相同，但由於培養環境不同則需再進一步使用分子篩過濾之 管柱進行純化；其結果如圖(十七)所示。
圖
PGRMC1 monomer SDS-PAGE 電泳的分子量分析
PGRMC1 樣品以進行下一步實驗。經由 SDS
26 kDa 26 kDa
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圖我們也可以得知，其實兩組 PGRMC1 分子量相同且無其他太大的 差別 。
為了進一步確認是否純化後的蛋白質為PGRMC1，因此利用基質 輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜Protein peptide finger printing 鑑定 技術，進行protein ID 比對；鑑定結果如圖(十七)所示：
圖 圖 圖
圖十七十七十七十七、、、基質輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜、基質輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜基質輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜生態質量圖譜基質輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜生態質量圖譜生態質量圖譜 生態質量圖譜
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(二二二)血基質重建二血基質重建血基質重建 血基質重建
本研究為了比較在培養時加入 ALA 誘導 Heme 活性中心結構與 使用較低成本，在純化後加入Hemin chloride 重建活性中心 PGRMC1 之間的研究差異，因此將血基質重建的PGRMC1 納入做比較。
將培養時未添加ALA 誘導並純化好的 PGRMC1，加入 Hemin chloride 重建活性中心，重建完成後蛋白質顏色外觀如圖(十八)。
重建前重建前
重建前重建前 重建後重建後重建後重建後
圖圖
圖圖十八十八十八十八、、、PGRMC1 重建前後外觀顏色比較圖、 重建前後外觀顏色比較圖重建前後外觀顏色比較圖重建前後外觀顏色比較圖
由圖(十八)可以明顯看到重建之後顏色外觀明顯變得比較深，這 個結果與先前文獻指出，血紅素蛋白質(hemoprotein)成功重建的結果 相符合(Fang Yang et al.,2010)，可作為初步判定重建結果的成功與否。
在接下來的研究，實驗更進一步確認重建的情況並比較與其他樣品之 間的差異。
(三三三)紫三紫紫外光紫外光外光/可見光吸收光譜外光可見光吸收光譜可見光吸收光譜 可見光吸收光譜
本研究欲比較不同 PGRMC1 與配體結合的情況，因此製備多種 狀態的PGRMC1；而在製備血基質重建的 PGRMC1 樣品時，為了確
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認其重建情況，本實驗利用UV-Vis 來做為判定成功重建與否的依據；
故也將其他樣品利用 UV-Vis 確認並比較其狀態的差異。其光譜圖如 圖(十九)所示。
圖 圖 圖
圖十九十九十九十九、、、UV-Vis 光譜圖、 光譜圖光譜圖 光譜圖
由光譜圖我們可以觀察到，不管是利用Hemin chloride 重建或者 是在培養時利用添加 ALA 的方式重建，其光譜結果都相同；兩種樣 品皆在400nm 左右有最大吸收光，與文獻所指出氧化態的 Heme 帶三 價鐵時在 398nm~412nm 會有最大吸收峰相符合；而未重建 Heme 活 性中心的PGRMC1 相較之下可以發現在 400nm 左右並無明顯的吸收 光。由實驗結果顯示，兩組樣品確實是帶有氧化態鐵(Fe3+) Heme 活
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性中心的PGRMC1(Thompson et al., 2007)。製備的完成以方便進行下 一步實驗 。
(四四四)石英晶體微天秤分子交互作用偵測四石英晶體微天秤分子交互作用偵測石英晶體微天秤分子交互作用偵測石英晶體微天秤分子交互作用偵測
為了瞭解數個狀態的 PGRMC1 與配體結合情況，將其經由 UV-Vis 確認過的 PGRMC1 蛋白質樣品，進一步使用壓電石英晶體微 天平(Quartz Crystal Microbalance;QCM)做分子交互作用的偵測。本研 究進行四組不同條件的蛋白質與配體結合實驗，其實驗分組樣品如表 (一)所示:
Sample NO. Protein Ligand
NO.1 PGRMC1 Hemin
NO.2 PGRMC1 Progesterone
NO.3 PGRMC1(ALA) Progesterone
NO.4 PGRMC1(Reconstitution of Heme) Progesterone
表 表 表
表 1、、、QCM 實驗分組樣品、 實驗分組樣品實驗分組樣品實驗分組樣品
接下來實驗將分組好的樣品依照編號進行分子交互作用偵測，其 結果圖如圖(二十、二十一、二十二、二十三)所示：
38 圖圖
圖圖二十二十二十二十、、、PGRMC1M 與、 與與與 Hemin 分子交互作用偵測圖分子交互作用偵測圖分子交互作用偵測圖。分子交互作用偵測圖。。上圖。上圖上圖上圖: PGRMC1M 與與與與 Hemin 實際偵測頻率圖
實際偵測頻率圖 實際偵測頻率圖
實際偵測頻率圖，，，，下圖下圖下圖下圖: AQUA 軟體數據分析圖軟體數據分析圖軟體數據分析圖軟體數據分析圖
39 圖
圖 圖
圖 二十一二十一二十一二十一、、、、PGRMC1 與與與與 Progesterone 分子交互作用偵測圖分子交互作用偵測圖分子交互作用偵測圖分子交互作用偵測圖。。。。上圖上圖上圖上圖: PGRMC1M 與與
與與 Progesterone 實際偵測頻率圖實際偵測頻率圖實際偵測頻率圖，實際偵測頻率圖，，，下圖下圖下圖下圖: AQUA 軟體數據分析圖軟體數據分析圖軟體數據分析圖軟體數據分析圖
40 圖
圖 圖
圖二十二二十二二十二二十二、、、PGRMC1M(ALA)與、 與與與 Progesterone 分子交互作用偵測圖分子交互作用偵測圖分子交互作用偵測圖分子交互作用偵測圖。。。上圖。上圖上圖: 上圖 PGRMC1M(ALA)與與與與 Progesterone 實際偵測頻率圖實際偵測頻率圖實際偵測頻率圖實際偵測頻率圖，，，下圖，下圖下圖: AQUA 軟體數據分析下圖 軟體數據分析軟體數據分析軟體數據分析 圖
圖 圖 圖
41 圖
圖 圖
圖二十三二十三二十三二十三、、、PGRMC1(Reconstitution of Heme)與、 與與與 Progesterone 分子交互作用偵測分子交互作用偵測分子交互作用偵測分子交互作用偵測 圖圖
圖圖。。。。上圖上圖上圖: PGRMC1(Reconstitution of Heme)與上圖 與與 Progesterone 實際偵測頻率圖與 實際偵測頻率圖實際偵測頻率圖實際偵測頻率圖，，，， 下圖
下圖 下圖
下圖: AQUA 軟體數據分析圖軟體數據分析圖軟體數據分析圖 軟體數據分析圖
42 結果顯示各個狀態的 PGRMC1 與配體 Progesterone 解離常數只達到 10-6，各個結合結果差異並不大；實驗將全部的結果整理如表二所示：
Protein Ligand Kd(M) r2
NO.1 PGRMC1 Hemin 4.06e-008 0.985
NO.2 PGRMC1 Progesterone 2.98e-006 0.947
NO.3 PGRMC1(ALA) Progesterone 2.53e-006 0.978
NO.4 PGRMC1(Reconstitution of Heme) Progesterone 1.06e-006 0.957
表 表 表
表 2、、、分子交互作用偵測計算結果、分子交互作用偵測計算結果分子交互作用偵測計算結果 分子交互作用偵測計算結果
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由表二結果比較顯示，PGRMC1 不管其狀態如何與 Progesterone 的 結 合 情 況 都 不 盡 理 想 ； 從 結 果 可 以 證 實 PGRMC1 並 不 與 Progesterone 直接結合。但利用 Hemin chloride 重建的 PGRMC1 樣品 與 Progesterone 結合數值卻高於未重建的 PGRMC1 三倍，因此推斷 PGEMC1 Heme 活 性 中 心 的 重 建 與 否 確 實 會 影 響 PGRMC1 與 Progesterone 結合。另外由 PGRMC1 與 Hemin 的分子交互作用偵測 結果，可以觀察到 PGRMC1 與 Hemin 結合情況緊密；但文獻 (Thompson et al., 2007)提到 PGRMC1 在酵母菌的同源蛋白 Dap1，與 Heme 的結合的 Kd 值卻可達到 10-10，數值相差100 倍。由於文獻所 使用的蛋白質並非與本研究相同，其功能與序列與 PGRMC1 也不盡 相同。因此本研究繼續比對，序列對照如(圖二十四)所示：
圖 圖 圖
圖二十四二十四二十四二十四、、、PGRMC1(Homo sapiens)與、 與與 Dap1(與 Saccharomyces cerevisiae)序序序序列比較列比較列比較列比較。。。。
序列比對結果發現相似度約只有 38％，由此推斷實驗結果的差 異可能來自於兩者蛋白的低相似度和實驗方式的不同。若依照 QCM 儀器使用的結果來推斷PGRMC1 與 Hemin 結合情況，其狀態確實緊
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密結合；因此本研究認為兩者數值雖然相差 100 倍，但仍可推斷 PGRMC1 與 Hemin(Fe3+)緊密結合。
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