3.1 台灣金線連對各種不同肝癌細胞株的生長影響
為探討台灣金線連是否具有抑制肝癌細胞生長，我們選擇不同 分化程的肝癌細胞 HepG2、Hep3B、Mal5、SK 進行細胞計數實驗。
3.1.1 台灣金線連對 HepG2 細胞株生長率影響之結果
加入台灣金線連不同劑量的實驗組與不加藥處理的對照組在培 養 24 小時後，計算其生長速率。經比較後得知在較低劑量 2.5 µg/ml 及 5 µg/ml 組與對照組相比，並無明顯的差異，而在較高劑量的 10 µg/ml 與 25 µg/ml 組，則有明顯的差異(p<0.05)。相同的結果出現在 48 小時實驗中。在培養 72 小時後，以低劑量處理 2.5 µg/ml 組，並 無明顯的差異，但在處理 5 µg/ml、10 µg/ml 組與對照組相比較，出 現明顯的差異(p<0.05)，已有顯著控制生長率的效果，尤其在較高劑 量的 25 µg/ml 組則有明顯的差異(p<0.01)(圖一)。
3.1.2 台灣金線連對 Hep3B 細胞株生長率影響之結果
加入台灣金線連不同劑量的實驗組與不加藥處理的對照組在培 養 24 小時後，計算其生長速率。經比較後得知在較低劑量 2.5 µg/ml 、5 µg/ml 與 10 µg/ml 組，並無明顯的差異，而在高劑量的 25 µg/ml 組，則有明顯的差異(p<0.05)。相同的結果出現在 48 小時實驗
無明顯的差異，沒有顯著控制生長率的效果；而在高劑量的 25 µg/ml 組則有明顯的差異(p<0.01)(圖一)。
3.1.3 台灣金線連對 Mal5 細胞株生長率影響之結果
加入台灣金線連不同劑量的實驗組與不加藥處理的對照組在培 養 24 小時後，計算其生長速率。經比較後得知在較低劑量 2.5 µg/ml 及 5 µg/ml，並無明顯的差異，而在高劑量的 10 µg/ml 、25 µg/ml 組，
則有明顯的差異(p<0.05)。相同的結果出現在 48、72 小時實驗中。
3.1.4 台灣金線連對 SK 細胞株生長率影響之結果
加入台灣金線連不同劑量的實驗組與不加藥處理的對照組在培 養 24 小時後，計算其生長速率。經比較後得知在較低劑量 2.5 µg/ml 及 5 µg/ml，並無明顯的差異，而在高劑量的 10 µg/ml 、25 µg/ml 組，
則有明顯的差異(p<0.05)。相同的結果出現在 48、72 小時實驗中。
總結以上結果顯示台灣金線連水萃取物對於分化程度較差的惡 性肝癌細胞株 Mal5 及 SK 抑制生長效果較不明顯，但特別在分化程 度較好的良性肝癌細胞株 HepG2 抑制生長效果較為顯著，在 10 µg ( IC50 )劑量時即可有效抑制生長，所以我們選擇對於台灣金線連藥 物感受性較好的 HepG2 肝癌細胞，以 10 µg 為固定劑量接著觀察在 24、48、72 小時不同時間點細胞內各種不同蛋白質的表現量。
3.2 台灣金線連對 HepG2 細胞株之 GSH 變化量測定
在 2001 年 Huang 等人首先發現在人類肝癌細胞中 GSH 以及 GSH 合成酵素表現量增加，並且藉由體外試驗 HepG2 細胞培養觀察 得知當增加 GSH 表現量時可促進 HepG2 細胞生長，另外由 2/3 肝切 除的動物實驗中證實 GSH 表現量增加為正常肝細胞再生時 DNA 合 成所必需 ( Huang et al.2001 )。所以我們接著以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後，在 24 小時、48 小時、72 小時 觀察細胞生長受到抑制時，GSH 的表現量也是否隨之下降。結果顯示在以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細 胞株之後，不管在 24 小時、48 小時、72 小時後，與未施藥的對照組 比較下均 P<0.009，在統計上有明顯的差異；顯示台灣金線連處理過 HepG2 細胞株後，有使細胞 GSH 量顯著下降的功能 (圖二)。
3.3 以西方墨點法測量 CuZn-SOD、 catalase 蛋白質表現 情形
3.3.1 以西方墨點法分析 CuZn-SOD 蛋白質表現量測定
以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後別在 24 小時，48 小時，72 小時後抽取蛋白，與未施藥的對照組比較。其
細胞內源性抗氧化酵素 CuZn-SOD 蛋白質量，在經由β-actin 修正後 分析所得之數據顯示，台灣金線連施藥 24小時後與正常組比較為 1.43 倍，台灣金線連施藥 48 小時後與正常組比較為 1.36 倍，台灣金線連 施藥 72 小時後與正常組比較只有 1.02 倍，在統計學上沒有明顯的差 異 (圖三)。
3.3.2 以西方墨點法分析 catalase 蛋白質表現量測定
以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後，分 別在 24 小時、48 小時、72 小時後抽取蛋白，與未施藥的對照組比較。
其細胞內源性抗氧化酵素 catalase 蛋白質量在經由β-actin 修正後分 析所得之數據顯示，台灣金線連施藥 24 小時後與正常組比較為 0.9 倍，台灣金線連施藥 48 小時後與正常組比較為 0.73 倍，台灣金線連 施藥 72 小時後與正常組比較只有 0.82 倍。在統計學上並沒有明顯的 差異 (圖三)。
總結以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之 後，分別在 24 小時、48 小時、72 小時與未施藥的對照組比較其細胞 內源性抗氧化酵素的表現量，並沒有明顯的差異。所以，我們想進一 步以 RT-PCR 方法取代北方墨點法探討其相關酵素在 RNA level 上 的表現。
3.4 台灣金線連對 HepG2 細胞株中抗氧化酵素 mRNA 表現 之測量
3.4.1 RT-PCR 測量 GCS mRNA 的表現情形
以軟體分析 RT-PCR 實驗所得之結果，24 小時實驗組與對照組比 較之下顯示 GCS mRNA 的表現有明顯下降的差異( P<0.05 )。但在 48 小時、72 小時後其量變化均不明顯，無統計上之意義 (圖四、五)。
3.4.2 RT-PCR 測量 GPx mRNA 的表現情形
以分析軟體分析 RT-PCR 實驗所得之結果，實驗組與未施藥的對 照組比較之下，在 24 小時、48 小時、72 小時皆有明顯之差異(P<0.05) (圖四)。
3.4.3 RT-PCR 測量 SOD mRNA 的表現情形
以分析軟體分析 RT-PCR 實驗所得之結果，實驗組與未施藥的對 照組比較之下，在 24 小時、48 小時、72 小時皆無明顯之差異 (圖四)。
3.4.4 RT-PCR 測量 catalase mRNA 的表現情形
以分析軟體分析 RT-PCR 實驗所得之結果，實驗組與未施藥的對 照組比較之下，在 24 小時、48 小時、72 小時(P<0.05)皆有明顯之差 異 (圖四)。
結果顯示在以台灣金線連處理 HepG2 細胞株之後，不管在 24
小時、48 小時、72 小時，與未施藥的對照組比較下 SOD mRNA level 無明顯之差異，catalase mRNA level 皆有明顯之差異；在蛋白質表現 量上卻不明顯，因此，除了瞭解細胞內源性抗氧化酵素 mRNA level 變化之外，我們接著觀察 SOD、catalase 活性是否也有不同的改變。
3.5 測量 SOD、catalase 活性
以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後，
分別在 24 小時、48 小時、72 小時後抽取蛋白與未施藥的對照組做比 較。其細胞內源性抗氧化酵素 SOD 活性隨時間而增加， catalase 活 性在 24 小時後，有相對減少的趨勢，在 48 小時後相對減少的量最多，
在 72 小時後相對的減少量最少 (圖七)。
由以上實驗結果可知以台灣金線連處理 HepG2 細胞株之後不管 在 GSH level 的表現量或是 SOD、catalase 活性上都與未施藥的對照 組有差異。
3.6 台灣金線連對 HepG2 細胞株轉錄子活性分析
在對照組中因載體不帶有 luciferase 之報導基因，所以不管加藥 或不加藥測定冷光之激發量並無太大差異，顯示我們的品管信度可被 接受。
經由軟體分析實驗所得之結果顯示，加藥組與對照組之比較轉染 具有 NF-κB 結合位而影響轉錄子活性約下降 4.6 倍；轉染具有 AP-1 結合位而影響轉錄子活性約下降 6.1 倍。兩者均有明顯之差異
(P<0.01)(圖六)。
結果顯示在以台灣金線連處理 HepG2 細胞株之後 promoter assay 不管在轉染具有 NFκB 或 AP-1 結合位的載體之後，其報導基 因轉錄出 luciferase activity 皆有明顯下降 (圖六)。
3.7 台灣金線連處理 HepG2 細胞株後活性氧分子產量分析
為瞭解在 HepG2 細胞株未施藥的對照組與以台灣金線連處理 HepG2 細胞株間活性氧分子實際產能情形的比較，以流式細胞儀分 析以台灣金線連處理細胞後超氧自由基、過氧化氫產量之變化。3.7.1 台灣金線連對 HepG2 細胞株處理後超氧自由基產量分析 結果顯示在 24 小時對照組經 Coulter XL 軟體分析超氧自由基產 量為 46.9 % ±3.1，在以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後經 Coulter XL 軟體分析超氧自由基產量為 36.3 % ± 2.7。在 48 小時對照組經 Coulter XL 軟體分析超氧自由基產量為 43.6% ± 2.6，在以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞 株之後經 Coulter XL 軟體分析超氧自由基產量為 23.1 % ± 2.1。在
72 小時對照組經 Coulter XL 軟體分析超氧自由基產量為 27.5 % ± 2.4，在以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後 經 Coulter XL 軟體分析超氧自由基產量為 15.5% ± 1.9 (圖八)。
3.7.2 台灣金線連 HepG2 細胞株處理後過氧化氫產量分析
結果顯示在 24 小時對照組經 Coulter XL 軟體分析過氧化氫產量 為 58.3 % ± 3.1，在以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後經 Coulter XL 軟體分析過氧化氫產量為 76.7 % ± 3.5。在 48 小時對照組經 Coulter XL 軟體分析過氧化氫產量為 70.7 % ± 3.4，在以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後 經 Coulter XL 軟體分析過氧化氫產量為 77 % ± 2.8。在 72 小時對照 組經 Coulter XL 軟體分析過氧化氫產量為 54.7 % ± 2.5，在以台灣金 線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之後經 Coulter XL 軟體分析過氧化氫產量為 58.2% ± 2.5 (圖九)。
總結以台灣金線連 10 µg/ml 為固定劑量處理 HepG2 細胞株之 後，結果顯示在以台灣金線連處理 HepG2 細胞株之後分別在 24 小 時、48 小時、72 小時與未施藥的對照組比較超氧自由基產量皆呈現 下降的趨勢，與台灣金線連處理 HepG2 細胞株之後 SOD level、
activity 上升結果相符。過氧化氫產量在 24 小時、48 小時、72 小時 與未施藥的對照組比較皆呈現上升的趨勢，尤其在台灣金線連處理後
24 小時過氧化氫產量差異最大。所以，我們更進一步做外加 H2O2 試驗，希望能深入瞭解在以台灣金線連處理 HepG2 細胞株後對細胞 內氧化壓力反應的影響如何。
3.8 外加過氧化氫處理後 HepG2 細胞株活性氧分子產量分析
3.8.1 HepG2 細胞株經外加 200 µM 過氧化氫處理後超氧自由基、過 氧化氫產量測定
其超氧自由基產量在一小時為 35.7 % ±0.98，二小時為 36 % ±2，
四小時為 23.13 % ±5.8；過氧化氫產量在一小時為 65.38 % ± 1.07，二 小時為 52.13 % ± 1.4，四小時為 31.6 % ± 0.97 (圖十、十一、十二)。
3.8.2 HepG2 細胞株經外加 200 µM 過氧化氫處理後再以台灣金線連 處理超氧自由基、過氧化氫產量測定
超氧自由基產量在一小時為 41.38 % ± 3.76，二小時為 41.8 % ± 5.15，四小時為 29.43 % ± 0.93；過氧化氫產量在一小時為 69.23 % ± 0.92，二小時為 56.53 % ± 5.29，四小時為 26.13 % ± 1.19 (圖十、十一、
十二)。
3.8.3 HepG2 細胞株經以台灣金線連處理後再外加 200 µM 活性氧分 子、過氧化氫產量測定
超氧自由基產量在一小時為 28.28 % ± 5.8，二小時為 33.6 % ± 5.05，四小時為 14.69 % ± 3.01；過氧化氫產量在一小時為 55.98 % ± 5.09，二小時為 43.73 % ± 7.81，四小時為% 26.13 ±2.15 (圖十、十一、
十二)。
結果顯示先加台灣金線連有保護細胞抗氧化，清除超氧自由基、
過氧化氫的功效。而先加過氧化氫再加台灣金線連則保護細胞抗氧化
過氧化氫的功效。而先加過氧化氫再加台灣金線連則保護細胞抗氧化