根據衛生署 2001 年統計癌症現為國內十大死因，而肝癌又居前 第三名，所以目前治療肝癌己是刻不容緩的工作，因為傳統治療肝癌 的化學療法多以出現抗藥性及產生副作用，因此開發新的輔助性療法 為另一個可以嘗試的方向。我們選擇民間盛行具保肝作用有顯著功效 的台灣金線連為研究題材，試著探討台灣金線連是否具有抑制癌細胞 生長的能力。
以不同分化程度的肝癌細胞 HepG2、Hep3B 、Mal5、SK 進行細 胞生長抑制實驗，結果顯示以台灣金線連處理 Mal5 及 SK 等分化程 度較差的惡性肝癌細胞株，除了在高劑量 25μg/ml 有較明顯的抑制 生長效果外，對台灣金線連的感受性似乎不如分化程度較好的 HepG2 及 Hep3B。尤其在 HepG2 細胞株中對台灣金線連的感受性特別好，
在 10μg/ml 濃度下即有抑制近 50 %生長率的效果出現，顯示金線連 對於分化程度較好的肝癌細胞有較明顯抑制生長的效果(圖一)。所 以，我們以下接著的試驗皆採用 HepG2 細胞株以相同劑量 10μg/ml ( IC50 ) 的台灣金線連處理，分別在 24、48、72 小時與未加藥的對 照組做比較。
當細菌或病毒入侵時會形成 ROS，細胞會因此造成慢性傷害引
起細胞 DNA 損傷。例如慢性肝炎的病人，當有病毒感染，即可將原 本輕微發炎的症狀惡化，造成肝細胞惡性增生甚至增加罹患肝癌的危 險。因為，ROS 的形成可能造成 DNA 修護、校正系統出錯，以致 deamination，depurination 或 DNA polymerase errors 的錯誤訊息無法 察覺，引起 DNA 突變而走向癌化 ( Aimee L et al. 2001 )。而體內存 在有非酵素性、酵素性兩種抗氧化防禦機轉負責 ROS 減少 ROS 氧化 傷害。其中非酵素性抗氧化物以 GSH 為代表，細胞內酵素性抗氧化 物以 SOD、catalase、GPx 為代表 ( Jose’ M et al. 1999 )。
本研究中藉由在抑制 HepG2生長 IC50 的台灣金線連處理下測定 非酵素性抗氧化物 GSH 的變化。在 24、48、72 小時，與對照組相 比，金線連處理的實驗組皆有明顯下降的差異 P<0.01(圖一)，顯示抑 制 HepG2 細胞生長的因素，可能與抑制 GSH 表現量相關，此結果與 先前報告指出當 GSH 增加時可以有效的促進 HCC 生長的結果相符 ( Huang et al. 2001)。可是在我們的實驗結果中顯示對照組 72 小時並 未高於 48 小時而且下降與 24 小時的量相近，我們推測對照組因為細 胞培養密度較高造成細胞與細胞間接觸性抑制，所以影響 GSH 的合 成所致（ Carreero J. et al. 1999 ；Cai et al. 1995）。
一般認為 GSH 具有解毒及抗氧化功能，可將許多抗癌藥物分解 使之療效減低。如果將 GSH 量減低時，可以有助提升其他抗癌藥物
的效果 ( Zhang K et al.2001 )。但是有學者提出不一樣的說法，認為 GSH 具有雙重功能，其一，當硒 Se 存在時 GSH 的作用就像氧化前 驅物(pro-oxidant)，可促進硒引起的氧化壓力；其二，GSH 也可當作 抗氧化物，避免氧化壓力造成的傷害與細胞凋亡 ( Shen H et al. 2000, Zhang K et al. 2000)。有相關論文指出當 ROS 增加而 GSH 量不足時，
會造成脂質過氧化、蛋白質氧化、膜電位喪失，接著細胞因而死亡。
如果此時 catalase 也下降，會引起抗氧化能力受損因而產生過多的 ROS，解毒能力不夠而造成過氧化氫的累積 ( Mari M et al. 2001 )。
還有研究指出當 GSH 耗損過多時會抑制細胞周期 S phase，並且影響 周邊血液單核球的生長 ( Joseph PM et al. 1989 )。另外，在 2/3 肝切 除的大鼠實驗中發現，GCS 活性增加時可以決定 GSH 的合成，並影 響肝細胞使再生能力加強（ Huang et al. 1998 ），證實 GCS mRNA 的合成可控制 GSH 的合成。但是也有報告指出增加 GCS 轉錄並非控 制 GSH 合成的唯一因素（Jacques PP et al. 2002 ）。本研究以 RT-PCR 偵測 GCS mRNA 表現量與 GSH 表現量 24 小時的結果相吻合(圖二)。
至於 48、72 小時對照組 GCS RT-PCR 與 GSH 量的表現有所差異，是 否與 glutathione synthetase (GS)相關，則有待進一步證實。
因此，本研究也進一步分析其他抗氧化酵素在金線連處理下可能 扮演的角色。結果顯示在經金線連處理過的 HepG2 細胞其 SOD 的蛋
白質表現量皆較未施藥的對照組有增加的趨勢，但此改變未具統計學 上的意義 (圖三)，進一步偵測 SOD 活性，對照組與以金線連處理的 實驗組相比較出現漸強的顯著差異(圖七)。
此外在 catalase 蛋白質表現量上，經過台灣金線連處理過的實驗 組相較於對照組，不論在 24、48、72 小時都有下降的趨勢。而 catalase 活性的測定表現量上，實驗組與對照組相比較，出現有逐漸減弱的顯 著差異(圖七)。
有論文指出 SOD 活性在分化不良的 HCC 比分化較好的 HCC 要 低 ( Huang C, Wu M. 1990 )，HCC 比鄰近正常組織 SOD 活性低引起 脂質過氧化造成惡性 HCC ( Huang CC. 1991 )。有報告指出，當 SOD 活 性 增 加 時 ， 因 為 金 屬 離 子 （ 如 錳 、 鐵 、 鈷 、 銅 等 ） 會 與 2-methylaminopyridine 形成複合物，而具有類似 SOD 活性，可以引 起過氧化氫的形成，當 GSH 耗損過多，catalase、GPx、GSH-reductase 活性下降時，此時因為產生過多的過氧化氫，而可將癌細胞殺死 ( Naggar et al. 1998 ) 。有報告指出當 CuZnSOD 過度表現時，細胞內 抗氧化酵素，包括 MnSOD、catalase、GPx 會被改變。在體外試驗中，
CuZnSOD:GPx 活性比上升時，癌細胞生長速率會因此而減少，猜測，
CuZnSOD 是一種抑制癌症基因 ( Ying et al. 2002 )，當 CuZnSOD 活 性過度表現時，會造成過氧化氫累積，可能藉此機轉達成抑制癌症細
胞生長。此推論與本實驗經過台灣金線連處理過的細胞相較於對照組 CuZnSOD 活性有上升(圖七)，而在 catalase、GPx RT-PCR 的結果中 顯示加藥組呈現下降，在過氧化氫的產量分析中發現過氧化氫有增多 趨向，皆與上述之論點相符。
我們從先前的 Huang et al.的研究中得知，GCS-HS 其啟動區上游 具有 AP-1、 NF?B 的結合位。如果細胞中 AP-1、 NF?B 結合促使 GCS 轉錄而可令 GSH的合成增加（ Huang et al. 2001，Yan et. al 1990 , Mulcahy et al. 1997 ），在本研究中以含有 NF?B，AP-1 結合位的報導 質體進行轉染 HepG2 細胞由 promoter assay 的結果顯示，在以金線連 處理 24 小時的 HepG2 細胞 NF?B 與對照組相較下降 4.6 倍，AP-1 則 下降 6.1 倍 (圖六)。由於進行 GCS-HS 啟動區選殖的實驗並不順利，
因此，僅能推測金線連透過抑制 NF?B，AP-1 與 GCS-HS 啟動區結合 造成 24 小時的 GCS-HS mRNA 合成減少，進而造成 GSH 表現量減 少，因而使得 HepG2 細胞生長受到抑制（ Huang et al. 2001）。
從流式細胞儀測定超氧自由基產能的結果發現，金線連加藥組比 對照組氧自由基減少而過氧化氫產能有稍微增加的趨勢，但我們卻看 不到細胞凋亡 DNA ladder 的現象；由於有研究指出 reactive oxygen intermediates ( ROI ) 合併 NF?B 下降時會抑制肝細胞的凋亡 ( Jones BE et al. 2000 )，所以猜測是否因為 ROI 產生的原因所致。
當過氧化氫增加時會令 GCS-HS mRNA 轉錄增加，使 GSH 量也 連帶增加，相反的當過氧化氫減少時會令 GCS-HS mRNA 轉錄減少 使 GSH 量也連帶減少；推測金線連可能經由過氧化氫的影響，誘導 GCS-HS mRNA 轉錄 ( Mari M et al. 2000)。
經由 Vanadate 誘發 AP-1 活化的實驗結果顯示，AP-1 會受到超 氧自由基、過氧化氫的活化，但不受氫氧自由基的誘導而活化 ( Ding et al. 1999 )。另外有關於骨骼肌細胞相關實驗報告指出，NF?B 在氧
化壓力時，可有效調節 GPx、catalase 表現量的上升 ( Zhou LZ et al.
2001 )。還有論文指出過氧化氫改變時並不會影響 NF?B 對 DNA 的 結合 ( Earner et al. 1996 )。
當 AP-1 與 DNA 結合能力下降時，此時外加 SOD 與 catalase 令 SOD 與 catalase 過度表現，可以使 GSH 下降；而且抑制 AP-1 mRNA 的形成與抑制 AP-1 與 DNA 結合能力( Ozolins TR et al. 1997 )。在因 局部腦缺血的情形下所造成缺氧及自由基增加的實驗結果中，證實雖 然在缺氧及自由基增加的情形下，但由於 ZnCu SOD 過度表現，仍會 造成 AP-1 活性下降( Huang CY et al. 2001 )。其他報告指出當抑制 AP-1 活性、mitogen-activated protein kinase pathway 可以抑制細胞生 長 ( Chung et al. 1999 )。
在本實驗中我們做了外加過氧化氫的實驗結果顯示，以台灣金線 連先處理過 HepG2 細胞後加入過氧化氫處理的組別與不處理的對照 組相比，對自由基、過氧化氫有比較強的清償能力，代表台灣金線連 先加藥後能有效維持抗氧化能力；而在先加過氧化氫後加台灣金線連 的組別在 1、2 小時對超氧自由基、過氧化氫都有產能較高的趨勢，
在 4 小時後才恢復對過氧化氫的清償能力。我們推測可能之原因是，
在先外加過氧化氫時會對細胞形成氧化壓力，先造成細胞內酵素性抗 氧化物 catalase 與過氧化氫作用；然後加入台灣金線連時，會讓原先 已耗損的 catalase 更加減少，致使有上述之情形發生。
雖然我們外加過氧化氫實驗祇有瞭解細胞內 1、2、4 小時之間的 氧化還原狀態，但藉由此結果可證明台灣金線連具有清除過氧化氫與 預防自由基形成的能力。
由於 AP-1 會受到超氧自由基、過氧化氫的活化 ( Ding M et al.
1999 )。從實驗結果中顯示，promoter assay 的結果顯示 AP-1 下降 6.1 倍(圖六)，而外加過氧化氫實驗中以台灣金線連先處理過 HepG2 細胞 後加入過氧化氫處理的組別與不處理的對照組相比，對自由基超氧自 由基有比較強的清償能力、過氧化氫有稍微增加。過氧化氫改變時並 不會影響 NF?B 對 DNA 的結合( Earner et al. 1996 )，所以當台灣金線 連處理過 HepG2 細胞後，雖過氧化氫有稍微增加，但此 redox status
不影響 NF?B 對 DNA 的結合，promoter assay 的結果顯示 NF?B 與對 照組相較下降 4.6 倍，與本實驗結果並無衝突。經由外加過氧化氫的 實驗結果顯示先加台灣金線連處理過 HepG2 的細胞對自由基、過氧 化氫有比較強的清償能力，可有效維持抗氧化能力；所以推測當造成 缺氧及自由基增加的情形下，由於 CuZn SOD 過度表現，會造成 AP-1 活性下降(Huang et al. 2001 )，使 AP-1 與 DNA 結合能力下降，GSH 合成減少，而且抑制 AP-1 mRNA 的形成與抑制 AP-1 與 DNA 結合能 力( Ozolins et al. 1997 )。另外，抑制 AP-1 活性可以抑制細胞生長 ( Chung et al. 1999 )是否與 GSH 合成減少而可能有協同抑制 HepG2 肝癌細胞生長的效果，有待我們進一步的實驗探討。