(一) FAL 對超氧自由基生成之影響
利用 SOD 可抑制的 ferricytochrome c 還原方法測定大鼠嗜中性白 血球生成超氧自由基的量。以 fMLP 刺激細胞懸浮液 ，可引起快速且短 暫的超氧自由基生成。當細胞懸浮液先與 DMSO 反應不同的時間 (0、
1、3、5、10、15、20 分鐘) 後，加入 1 μM fMLP 活化細胞，發現 DMSO 不會顯著影響超氧自由基的生成。但當細胞懸浮液與 30 μM FAL 反應不 同的時間後，則發現 FAL 時間依存性 (time-dependent) 的抑制 fMLP 刺 激嗜中性白血球生成超氧自由基 (圖 2-1)。細胞與 FAL 反應 3 分鐘之後 即有超過 50% 的抑制效果 (P＜0.01)，而反應 10 與 15 分鐘間已接近 最大的抑制百分比。因此選擇 10 分鐘當作之後反應的時間。
當細胞懸浮液與不同濃度的 FAL (3、10、30、50 μM) 反應 10 分 鐘 後 ， 加 入 1 μM fMLP 活 化 細 胞 ， 發 現 FAL 以 濃 度 依 存 性
(concentration-dependent) 的方式抑制嗜中性白血球產生超氧自由基 (圖 抑制，P＞0.05) (圖 2-3)。而抑制 NADPH oxidase 的 diphenyleneiodonium chloride(DPI) 1 μM 可產生 83.0 ± 8.0 % 抑制效果 (P＜0.01)。
利用細胞釋出 LDH、trypan blue exclusion 和 calcein 發出的螢光值三 種方法來檢驗 FAL 對細胞的毒性。發現細胞與 30 或 50 μM FAL 反應 30 分鐘後，以三種檢測方法的測量值與 DMSO 反應的數值比較 FAL 對細 胞的毒性增加範圍均＜3% (表 3-1)。
(三) FAL 對 DHF 自體氧化反應的測試
於 DHF 自體氧化產生超氧自由基反應的實驗，主要是測量 FAL 是 否會直接清除超氧自由基。加入 30 或 50 μM FAL 和對照組比較，發現 均不會抑制 DHF 自體氧化產生超氧自由基的現象 (表 3-2)。
(四) FAL 對嗜中性白血球去顆粒化的影響
嗜中性白血球懸浮液經 DMSO 或 3、10、30、 50 μM FAL 反應 10 分 鐘 後 ， 加 入 1 μM fMLP 刺 激 細 胞 。 測 量 細 胞 釋 放 出 來 的 β-Glucuronidase 和 lysozyme。發現 FAL 以濃度依存性的方式抑制細胞 釋放出來的 β-Glucuronidase。在 3 μM FAL 時與對照組比較下即有明顯 的抑制效果 (13.6 ± 7.8 % 抑制，P＜0.01)，其 IC50 值為 32.8 ± 7.6 μM (圖 2-5) 。 測 量 細 胞 釋 放 出 來 的 lysozyme ， 發 現 FAL 的 抑 制 效 果 不 如 β-Glucuronidase 好。 FAL 在測試的最高濃度 (50 μM) 只抑制了 34.2 ± 5.6 % (圖 2-6)。
(四) FAL 影響 fMLP 刺激 ERK 、MAPKAPK2 及 p38 MAPK 磷酸化 的作用
嗜中性白血球懸浮液經 fMLP 刺激，細胞蛋白質以 SDS-PAGE 展 開。利用 anti-phospho-ERK 抗體辨識，發現有 ERK 磷酸化作用增加。
嗜中性白血球懸浮液與 3、10、30、50 μM FAL 反應 10 分鐘後，發現
FAL 在高濃度 (50 μM) 時有微弱的抑制 ERK 的磷酸化作用，但在較低 濃度時並不會影響 ERK 的磷酸化作用。使用 ERK 抑制劑 1 μM U0126 (Favata et al., 1998) 可幾乎完全抑制 ERK 的磷酸化作用 (圖 2-7)。
fMLP 刺激後的嗜中性白血球，細胞蛋白質以 SDS-PAGE 展開。利 用 anti-phospho-p38 MAPK 或 anti-phospho-MAPKAPK2 抗體辨識，發現 有明顯 p38 MAPK 及 MAPKAPK2 磷酸化作用的增加。細胞懸浮液先與 球細胞中 class IA、IB PI3K isoforms 的 catalytic subunit mRNA 表現。PCR 產物以 2% agarose gel 展開後，發現有出現與預期 base pair 數大小相同 且單一 band 屬於 IA 的 p110α、p110β 及 p110δ 和 屬於 IB 的 p110γ 存在 (圖 2-9)。經與 GenBank database 的資料作序列比對，其相似程度 分別為 99%、100%、100% 和 99%。
(六) FAL 對 fMLP 刺激 Akt 與 GSK3β 磷酸化的影響
嗜中性白血球懸浮液經 fMLP 刺激後，細胞蛋白質以 SDS-PAGE 展 開，利用 anti-phospho-Akt(Ser473) 或 anti-phospho-Akt(Thr308) 抗體抗體辨 識，發現有 Akt(Ser473) 和 Akt(Thr308) 磷酸化的增加。細胞懸浮液與 3、
10、30 或 50 μM FAL 反應 10 分鐘後，並不會影響 fMLP 引起的 Akt(Ser473) 和 Akt(Thr308) 磷酸化。而使用 PI3K 抑制劑 30 μM LY294002 (Vlahos et al., 1994) 則幾乎完全抑制了 Akt(Ser473) 和 Akt(Thr308) 的磷酸 化作用 (圖 2-10)。
同樣的，對於fMLP 刺激細胞引起的 GSK3β 磷酸化。FAL (3-50 μM) 也不會影響 GSK3β 的磷酸化作用。而 LY294002 對 GSK3β 的磷酸化產 生 32.1 ± 9.1 % 抑制作用 (圖 2-10)。
(七) FAL 影響 fMLP 刺激蛋白質酪氨酸磷酸化作用
fMLP 刺激後的嗜中性白血球，細胞蛋白質以 SDS-PAGE 展開，利 用 anti-phosphotyrosine 抗體辨識，可見到蛋白質磷酸化的增加。細胞懸 浮液與 3、10、30 或 50 μM FAL 反應 10 分鐘後，顯示 FAL 只有在使用 50 μM 時可產生明顯的的抑制效果 (抑制 51.3 ± 29.8 %)。使用 tyrosine kinases 抑制劑 genistein (100 μM) (Coyne and Morrison et al., 1990)，可以 有 75 ± 26.6 % 的抑制蛋白質磷酸化作用 (圖 2-11)。
(八) FAL 對 fMLP 刺激 PLD 活性的影響
1-O-[3H]octadecyl-sn-glycero-3-phsophocholine 標 示 的 嗜 中 性 白 血 球，在 1 mM CaCl2 以及 0.5% ethanol 存在下，與 100 μM genistein 或 3、10、30 或 50 μM FAL 反應。經 fMLP 刺激後，將抽取脂質經 TLC 展 開，偵測 [3H]phosphatidylethanol 產物的含量變化作為 PLD 活性的指 標 。 可 發 現 FAL 以 濃 度 依 存 性 的 方 式 抑 制 fMLP 引 起 的 phosphatidylethanol 生成。FAL 在 10 μM 已顯示統計學上顯著的抑制效 果 (41.2 ± 21.4 % 抑制，P＜0.01)。當濃度增加至 30 或 50 μM 則可分 別達到 69.4 ± 14.9 % 和 75.7 ± 15.6 % 的抑制效果， 其 IC50 值為 16.0 ± 8.6 μM (圖 2-12)。
(九) 大鼠嗜中性白血球 PLC isoforms 的表現
以 RT-PCR 的實驗方法，使用專一的 primer pairs 來測量嗜中性白血 球細胞中 PLC isoforms 的 mRNA 表現。PCR 產物以 2% agarose gel 展 開後，發現有出現與預期 base pair 數大小相同的 PLCβ1-4、 PLCγ1-2 及 PLCδ1 的存在 (圖 2-13)，除 PLCβ3 有兩條 bands (下方的 band 為 PLCβ3) 外其餘均為單一 band。經與 GenBank database 的資料作序列比 對，其相似程度分別為 100%、100%、99%、100%、99%、99% 和 98%。
PLCδ4 似乎不存在於嗜中性白血球細胞，但可見於鼠腦組織中。
(十) FAL 影響 fMLP 刺激細胞內鈣離子增加的作用
RhoA 膜轉位作用。使用 10 μM FAL 對 RhoA 的膜轉位已有明顯的抑制