二、實驗材料及方法

(一) 分離嗜中性白血球

以 腹 腔 注 射 pentobarbital (60 mg/kg) 麻 醉 大 鼠 (Sprague Dawley, 300-350 g)。由鼠腹腔大動脈抽取全血，與針筒中的 100 mM EDTA 溶液 (作為抗凝劑) 均勻混合，在倒入試管中與 dextran 充分混合後靜置。待 紅血球沉降，取上清液離心 (500

g

，4℃) 10 分鐘。沉澱物轉移至含 Ficoll-Hypaqe 的試管中離心 (400

g

，20℃) 20 分鐘 (Wang et al., 1994)。

將沉澱物懸浮在Hanks’ balanced salt solution (HBSS) 含 10 mM HEPES (pH 7.3) 及 4 mM NaHCO3 中離心 (800

g

，4℃) 10 分鐘。將沉澱物先以 入 FAL，並以 dimethyl sulphoxide (DMSO) 或 10% Triton X-100 當對 照組，反應 30 分鐘離心 (1000 g，4℃) 5 分鐘，取上清液以 cytotoxicity detection kit 測量 450 nm 吸光值變化。

(2) Trypan blue exclusion

將上述與 FAL 或 DMSO 反應後的細胞懸浮液取部分稀釋，重從中取 10 μl 至細胞計數盤上，於顯微鏡下觀察並計算細胞受損或死亡的比例。

(3) Calcein-AM assay

將 5 μM calcein-AM 加到嗜中性白血球懸浮液 (1 × 10⁶ cells/ml)中，

於 37℃ 下預熱 15 分鐘，再用 HBSS buffer 沖洗兩次。加入 FAL，並 以 DMSO 或 10% Triton X-100 當對照組反應 30 分鐘後，以 5 倍体積 的 HBSS buffer 終止反應。以 HBSS buffer 沖洗兩次，沉澱物以 HBSS buffer 懸浮。將細胞懸浮液加至 microplate 中，讀取 485/538 nm 的螢光 值 (Neri et al., 2001)。以 DMSO 作對照組，計算細胞受損的比例。

(三) 測量藥物對嗜中性白血球生成超氧自由基的作用

嗜中性白血球懸浮液 (2 × 10⁶ cells/ml) 先與 cytochrome c (0.5 mg/ml)、cytochalasin B (CB) (5 μg/ml) 及 CaCl₂ (1 mM) 於比色槽中混 合，並置於 37℃ 恆溫的雙光束分光光譜儀 (Hitachi, U-3210) 中預熱 3 分鐘。在加入 FAL 作用後，使用 1 μM fMLP 刺激細胞 5 分鐘。而於對 照組的比色槽中則另含 6.6 μg/ml 的 SOD。讀取在 550 nm 波長吸光值 的變化 (Wang et al., 2003)。

(四) 測量藥物對超氧自由基的直接清除作用

0.891 mM DHF 及 0.274 mM nitroblue tetrazolium (NBT)，而對照組的比 X-100。離心後取上清液分別測量 β-glucuronidase 和 lysozyme 的含量。

在 上 清 液 中 加 入 0.1 M acetate buffer (pH 4.5) 和 0.75 mM phenolphalin-β-glucuranide ， 在 37 ℃ 反 應 兩 小 時 後 加 入 50 mM Na2CO3 終止反應，使用 ELISA reader 讀取於 550 nm 吸光值的變化來 作為 β-glucuronidase 釋出的指標。另外在上清液中加入 0.06 M phosphate butter (pH 6.2) 和 0.02% Micrococcus lysodeikticus 懸浮液在 37℃ 水浴 槽反應大約 30 分鐘，讀取 450 nm 吸光值的變化。

(七) 細胞內鈣離子的測量 leupeptin、2 mM N-ethylmaleimide、100 mM NaF、1 mM sodium vanadate、

1 mM p-nitrophenylphosphate 和 1 mM PMSF) 混合並離心，以 HBSS buffer (pH 7.4) 含 2 mM PMSF 清洗兩次。沉澱物溶於 Laemmli sample buffer 中，並煮沸 5 分鐘。離心取上清液，並以 Lowery method 測量蛋白 質 的 含 量 。 蛋 白 質 以 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 展 開 後 ， 轉 移 至 polyvinylidene difluoride (PVDF) 膜上。以含 5% (w/v) 脫脂奶粉的 TBST Buffer (10 mM Tris-HCl

anti-phosphotyrosine、anti-phospho-p38 MAP kinase 、anti-phospho-MAPK APK2 、 anti-phospho-p42/44 MAP kinase 、 anti-phospho-GSK3β 、 anti-phospho-Akt(Ser⁴⁷³) 或 anti-phospho-Akt(Thr³⁰⁸) 抗體反應來辨識。辨 識後的 PVDF 膜，利用 stripping buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)、100 mM β-mercaptoethanol 和 2% SDS) 在 50℃ 清洗 20 分鐘後，再次以含 5% (w/v) 脫脂奶粉的 TBST Buffer 充填膜後。並以 Anti-pan-ERK、

anti-p38 MAPK、 anti-Akt 或 anti-β actin 抗體辨識作為 loading control (Chang and Wang, 1999, 2000)。測量結果以 Luminescent Image Analyzer (Fujifilm LAS-3000) MultiGauge software 分析，並計算磷酸化程度與 loading control 的比值。

(九) 測量細胞中 PKC、ARF 及 RhoA 膜轉位作用

反應後的嗜中性白血球 (1 ×10⁷ cells/ml) 懸浮液，在加入五倍體積冷 的 HBSS 終止反應後離心 (1000 g，4℃) 5 分鐘。將細胞懸浮於 300 μl 溶解溶液 (0.34 M sucrose、10 mM Tris-HCl (pH 7.0)、10 μg/ml 的 leupeptin 和 antipain 、 1 mM PMSF 、 1 mM p-nitrophenylphosphate 、 10 mM benzaleimide 和 1 mM EGTA)。於冰浴中，以超音波震碎細胞後離心 (800

g，4℃) 10 分鐘。取上清液進行超高速離心 (50,000 g，4℃) 30 分鐘。

取沉澱物為細胞膜分劃。蛋白質經定量後，以 SDS-PAGE 展開，並轉移 至 PVDF 膜上。以含 5% 脫脂奶粉的 TBST buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl 和 0.1% Tween 20) 充填後，用 anti-PKC、anti-RhoA 及 anti-ARF 抗體反應來辨識 (Tsao and Wang, 1997; Wang et al., 2002)。同時

利用 β-actin 抗體辨識作為 loading control。

在無細胞系統 (cell-free system) 的實驗，先將嗜中性白血球 (3 ×10⁷ cells/ml) 懸浮於 buffer B (含 25 mM HEPES (pH 7.4)、100 mM KCl、3 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM Mg-ATP、1 mM EGTA、5 mM dithiothreitol、

1 mM Na3VO4、0.5 mM PMSF 和 10 μg/ml leupeptin)。在冰浴中以超音波 1-O-[³H]octadecyl-sn-glycero-3-phsophocholine 在 37℃ 下 反 應 75 分 鐘。清洗後將細胞重新懸浮於 HBSS 中。在 1 mM CaCl₂ 以及 0.5%

ethanol 存在下，與 FAL 在 37℃反應 10 分鐘。然後在 CB 存在下加入 fMLP 刺激。反應完成後，加入 CHCl3/CH3OH 混合液抽取脂質。經濃縮 乾燥後，以少量的 CHCl₃ 溶解，以 silica gel 60 分離 (Wang et al., 1997)。

TLC 板置於含有 hexane : diethyl ether : methanol : acetic acid (90:20:3:2) 的展開液中展開到一半，待乾燥後再以 ethylacetate : isooctant : acetic acid : water (110:50:20:100; v/v) 混 合 液 的 上 層 液 作 為 展 開 液 。 使 用

[³H]phosphatidylethanol (Wang et al., 2002) 在 TLC 板上位置，並刮下以 liquid scintilation counter (Packard, Tri-carb 2900TR) 偵測放射線強度。

(十一) RNA 的分離

嗜中性白血球 (5 ×10⁷ cells/ml) 或組織加入 4 ml 的 solution A buffer (4 M guanidium thiocyanate、0.5% N-lauroylsarcosine、 25 mM sodium citrate 2H₂O (pH 7.0)和 0.1 M β-mercaptoethanol) 進行均質化並離心 (4

℃，10000 g) 10 分鐘。取上清液加入 0.1 ml 2 M sodium acetate (pH 5.2)、

1 ml phenol 和 0.2 ml chloroform/isoamylalcohol 混合 15 秒後置冰上 20 分鐘。離心 (4℃，10000 g) 20 分鐘後，取上清液至另一離心管。再加入 2 ml phenol 和 2 ml chloroform/isoamylalcohol 混合 15 秒，並置冰上 20 分鐘。離心 (4℃，10000 g) 20 分鐘後，取上清液至另一離心管，加入 等體積 isopropanol，置 -20℃ 20 分鐘後，離心 (4℃，10000 g) 10 分鐘 去上清液，加入 2 ml 75% 酒精洗二次，風乾後加入溶於 0.1% DEPC 水 並且存在 – 70℃ 備用。

(十二) Polymerase chain reaction

利用上述所得的 RNA 合成 cDNA。在反應液中加入 5 μg total RNA, 再用滅菌水調整體積至 10 μl, 放入 70℃ 溫浴 3 分鐘，再加入 0.5 μg

Oligo(dT)15、0.5 mM dNTP 、 1 × Reaction Buffer 、 0.01 M DTT 、 2 U/μl RNA sin 和 10 U/μl SUPERSCRIPT II (RT)，再放入 42℃溫浴 60

分鐘，再轉至加熱 70℃ 下 15 分鐘。而 PCR 的最終反應體積為 25 μl，

包含 1 μl cDNA、 5 U/μl Ex Taq DNA polymerase、0.25 mM dNTP 和 0.5 μl 特定的 primer，而所設定的 primer 和溫度設定如下：

PI3K primer pairs

α GCCAGATTTCATGGATGCTT (s) CCTTGGTTTTGCCAGATGTT (as)

261 bp

β CAGGAAAGCAGGAAAAGTGC (s) CGAAGACCAGCTGTGCAATA (as)

109 bp

γ ATGACGTCAGTTCCCAAGTT (s) CGCAGATCATCACCATGTTT (as)

247 bp

δ GCACTCTATGCTGTCGTGGA (s) CGTACTGTACCCGCAGGATT (as)

PLC primer pairs

β1 AAGCCCGTGTGCGTGTCCGA (s) TCCTCTTGAGGGATGGAATC (as)

578 bp

β2 GCCCACCAAGTTTATCTCCTTCGAG (s) GCCACCTTGTCTGTGGTGACTTTGG (as)

1521 bp

β3 ATCGAGACCTGAGGGAACTG (s) CTGAAGCTCCCTTCTTCTCCC (as)

377 bp

β4a AAGATTCAGACCCTGACATCGG (s) CATCTCCTTCGCCTGCTCATTC (as)

483 bp

γ1 CTACTCCAAGAAGTCGCAGC (s) TAGTTGACCTGTGACAGGCAT (as)

444 bp

γ2 AGTACATGCAGATGAACCATGC (s) ATCTAAATCCTGATTTGATGCC (as)

435 bp

δ1 TCATCCTGTCCCTGGAGAAC (s) TCAGACACGTCAGTGGCTTC (as)

229 bp

δ4 CCACTAATCAGGACCTGCTGC (s) CTTCTCTGAAACTCATCCGGC (as)

447 bp

PLC 反應條件均為 94℃ 45 秒→ 58℃ 30 秒→ 72℃ 1 分鐘，共 28 cycle。

PCR 產物以 2% agarose gel 展開。將膠染上 ethidium bromide ，再用 UV 燈進行偵測，最後再利用 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer 和 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 進行定 序。

(十三) 實驗材料

Dextran T-500 購自 Pharmacia Biotech (Uppsala., Sweden)。HBSS 購自 Gibco Life Techologues (Grand Island, NY., USA)。Diphenylene iodonium 購 自 Research Biochemicals Internationsl (Natick, MA., USA)。U0126 購自 Promega (Madison, WI., USA)。Fluo-3-AM、SB203580 和 LY294002 購自 Calbiochem-Novalbiochem (San Diego, CA., USA) 。 Enhanced chemiluminescence reagent 購 自 Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK)。Polyvinylidene difluoride membrane 購自 Millipore (Bedford, MA., USA)。Cytotoxicity detection kit 購自 Roche Diagnostics (Mannheim, Germany)。Anti-p38 MAPK antibody、anti-Akt antibody、

anti-PKCβI antibody、anti-PKCβII antibody、anti-PKCζ antibody、anti-ARF antibody 、 anti-RhoA antibody 和 β-actin antibody 購 自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA., USA)。 Anti-phospho-ERK antibody、

anti-phospho-Akt(Ser⁴⁷³) antibody 、 anti-phospho-Akt(Thr⁴⁷³) antibody 及 anti-phospho-p38 MAPK antibody 購自 New England Biolabs (Beverly, MA., USA)。Anti-pan-ERK antibody、anti-PKCα antibody、anti-PKCδ antibody 和 anti-phosphotyrosine antibody 購自 BD Transduction (Lexington, KY., USA)。其餘化合物購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO., USA)。藥物 皆溶於 DMSO，不超過反應溶液體積的 0.5 % (v/v)。DMSO 購自 Merck (Taiwan, ROC)。

(十四) 統計分析

實驗數據以 means ± S.D. 表示。統計以 Student's t-test 來比兩組間 的差異，多組間的比較則先以 ANOVA 分析，再經 Bonferroni t-test 比較 差異。分析結果以 P 值小於 0.05 視為有統計上的差異。分析 regression line 來定藥物抑制作用的 IC₅₀ 值。

在文檔中 FAL 抑制嗜中性白血球生成超氧自由基的研究; Inhibitory Effect of FAL on Superoxide Anion Generation in Neutrophils (頁 37-48)