從微陣列資料分析過程中，觀察到可能參與調控出血性反應的基因在初級上皮細胞中較初級
血管內皮細胞中表現顯著差異，因而懷疑血管內皮細胞通透性的改變是否經由上皮細胞感染後 釋放因子所產生的影響。為了測試此假設，將 D2V 先感染上皮細胞(NPC-TW06)，感染不同時間 點後收取培養液(conditioned medium)，再將此培養液用來培養未受感染的血管內皮細胞 (ECV304)，經兩天培養期後，收取細胞蛋白質(protein extraction)，以西方點墨法(Western blotting)分析可能造成出血性反應相關蛋白的表現模式。在先前研究中指出，血管內皮細胞 (human dermal microvascular endothelial cell line HMEC-1)受 D2V 感染後與細胞接合點(cell junction)相關的基因 occludin(OCLN)在細胞中組成會改變，進而影響細胞通透性(Talavera, Castillo et al. 2004)。所以，本論文挑選 OCLN 基因做為血管內皮細胞(ECV304)通透性改變 的標靶基因。在圖 14a.中，上皮細胞(NPC-TW06)分別感染具活性(aD2)或以經加熱失活
(iD2)(Huang, Lei et al. 2003)的病毒 4、8、12 小時後收取培養液，再將此培養液培養內皮 細胞(ECV304)，經 48 小時培養後萃取細胞蛋白，觀察細胞中 OCLN 蛋白表現量。圖中結果可知 上皮細胞受病毒效價為 moi=5 的 D2V(aD2)感染 4 hpi 的培養液與受失活的 D2V(iD2)感染的培養 液相比，內皮細胞 OCLN 的蛋白表現量減少，但此減少的現象隨感染時間點增加而回復(8/12 hpi)。另一方面，觀察以不同病毒效價感染上皮細胞的培養液對內皮細胞 OCLN 蛋白的影響。從 圖 14b 中可發現越高病毒效價感染上皮細胞的培養液會使內皮細胞 OCLN 表現量更下降。綜合圖 14a 和圖 14b 結果，可觀察到內皮細胞 junction protein-OCLN 的表現量會因上皮細胞感染不同 時間點及不同病毒效價而有所影響。
3.5 上皮細胞(NPC-TW06)感染 D2V 後對內皮細胞(ECV304)可能造成通透性改變的影響並 非由單一 D2V 病毒蛋白所調控
從先前微陣列資料分析過程及圖 14 結果可推知，當上皮細胞(NPC-TW06)受 D2V 感染後，可能 是由於釋放一些因子進而影響血管內皮細胞或改變細胞特性，使病毒更易通過上皮細胞保護層 去感染血管內皮細胞，進而造成內皮細胞出血性相關的反應。為了進一步觀察造成此作用結果 是否由某一特定 D2V 病毒蛋白所調控或影響，於是分別將表現 D2V 的 NS1、NS2A、NS2B、NS3、
NS4A、NS4B、NS5 病毒蛋白的過度表現(overexpression)質體個別送入細胞中，經不同時間後，
萃取細胞 RNA，進行 quantitative real-time RT-PCR，觀察可能影響內皮細胞出血性反應基因。
plasminogen activator inhibitor II(PAI-2)為一與血液凝集作用相關的因子，於出血性反應 的病患身上可觀察到凝血系統有異常現象(Carlos, Oishi et al. 2005)。在微陣列實驗中，PAI-2 的表現在感染早期就顯著高度表現，且此基因表現螢光值在晶片上的平均強度(average log intensity；A)很強(A>11)，所以選擇此基因作為觀察出血性反應的標的基因。細胞經過度表現 病毒蛋白質體不同時間點或直接感染 D2V 後，觀察 PAI-2 表現趨勢是否相似。圖 15a 中可看到 上皮細胞不受任何感染或過度表現病毒蛋白情況下(cell only)，PAI-2 基因表現量在不同時間 點中無任何改變。上皮細胞感染 D2V 短時間 4、8、12 小時 PAI2 表現隨時間增加而遞減。過度 表現病毒單一蛋白後，PAI-2 在時間點上的表現趨勢並不與細胞感染 D2V 相似。另外，觀察較後 期(12、24、36、48 小時)細胞受感染或過度表現情況下 PAI-2 表現模式(圖 15b)。D2V 感染狀態 下，細胞中 PAI-2 基因已不受調控，表現量與細胞不受任何感染或過度表現蛋白質體情況相同。
同樣地，過度表現不同蛋白質體後，PAI-2 基因表現量亦不受影響。顯示上皮細胞受感染後對內 皮細胞所造成的影響並非只受單一 D2V 病毒蛋白所調控。
肆、 討論
本研究以可同時分析大量基因表現模式的微陣列技術，探討 D2V 感染上皮細胞後基因的表現。
分析結果發現上皮細胞受感染後，一些與增加細胞通透性或降低細胞間隙完整性的相關基因表 現量明顯受到改變，顯示上皮細胞可能為登革熱病毒感染過程的第一線細胞，上皮細胞感染後 可能局部分泌一些促進血管通透性增加的因子改變上皮細胞間隙完整性，進而增進病毒進到內 皮細胞層的機會，同時也導致內皮細胞層出現通透性增加情況，使局部性大量病毒容易穿過細 胞層進入血液循環系統中，造成嚴重全身性感染。
因缺乏有效疫苗與可用的藥物治療，登革出血熱及休克仍為登革病毒主要致死病因，先前研 究發現登革熱病毒造成較嚴重病症中出血性反應的特徵為血管通透性增加，血漿大量滲出。由 於臨床病患體內血管內皮細胞並無病毒直接感染或迫害證據情況下，本研究選擇以最易受登革 熱病毒感染的上皮細胞(Diamond, Edgil et al. 2000)作為研究模式，探討上皮細胞受感染後 對內皮細胞通透性改變的影響。
爲了全面性分析 D2V 對上皮細胞直接感染作用後所產生的基因表現，利用高疏通量的微陣列基 因晶片技術，描繪出細胞受病毒感染後基因間網絡調控(genetic network)的關係。
微陣列資料結果中以表現量相較於對照組 1.5 倍以上設為顯著差異表現(significant
expression)進行分群，可分兩大群：表現量增加基因群與表現量降低基因群。表現量增加基因 群再以感染不同時間點的表現趨勢進行分群，可分兩群，一為基因表現量隨感染後時間增加而 遞減，另一群為基因表現量隨感染後時間增加而遞增(圖 1b)。在隨感染時間增加表現量遞減的 基因群中，顯著表現的功能群(function group)為正向調控細胞計畫性死亡及急性反應調控作 用。先前研究指出在有出血性的臨床病人身上或受感染的皮膚上皮細胞和血管內皮細胞中，促 發炎反應因子(proinflammatory factors；eg.TNF-α)會明顯表現，活化細胞計畫性死亡機制，
避免進入到體內的病毒利用寄主細胞的生理系統進行大量複製(Warke, Xhaja et al. 2003;
Cardier, Marino et al. 2005; Limon-Flores, Perez-Tapia et al. 2005; Liew and Chow 2006)。
在微陣列結果細胞計畫性死亡機制於感染後很短時間內就被活化(圖 1b group I)。可能是因上 皮細胞對 D2V 具較高易受性，所以細胞反應較為快速。另外，隨感染時間增加表現量遞增的基
因群中，細胞內蛋白質運輸及免疫反應也顯著受到調控(圖 1b group III/IV)。而與免疫反應相 關的基因大都屬於細胞激素(cytokines；eg. interferon)和趨化激素(chemokines)。急性反應 屬免疫反應的一部分，利用 clusteranalysis 依細胞感染不同時間點後基因表現趨勢作分群，
可觀察到在急性反應功能群中與補體系統相關的基因 C1r 和 C4a 在較早感染時間點就受調控(圖 1b group II，圖 3)，這些基因的表現量變化可能會影響免疫反應的細胞激素和趨化激素相關基 因表現，這種時間上前後調控作用反應與細胞受到外物入侵時的防禦調控機制相符(附圖 3)。
細胞受病毒感染後，除基本的防禦機制-免疫系統活化表現外，其他抗病毒作用的基因亦受 調控，如參與在細胞膜組成及生物合成的基因 PLSCR1(圖 5)。PLSCR1 為一細胞膜蛋白，受 interferon 或 growth factor 活化，進行促進細胞結合作用活化(activation of cell binding)、
補體系統表現、凝血系統相關蛋白酶(coagulation proteinase)清除血小板作用增強(Warke, Xhaja et al. 2003; Wiedmer, Zhao et al. 2004)。參與在細胞內蛋白質運輸功能群的基因中，
SSR1 和 VPS33A 表現顯著(圖 4)，可能分別在將要組裝成病毒顆粒相關的蛋白運送到內質網 (protein targeting to ER)或包覆病毒顆粒的囊泡附著到細胞膜進行外泌作用(vesicle docking during exocytosis)時扮演重要調控角色，使複製完成的病毒蛋白組裝成完整病毒顆 粒後釋放到細胞外，進而再感染其他鄰近細胞。
在表現量下降的基因群中，同樣以感染不同時間點的表現趨勢進行分群，可分六群，將各群 所包含的基因以GO分類系統進行分類，挑出符合分類層階level 5的功能群，六群中有兩群含顯 著表現功能群。其中一群基因表現趨勢為一開始受感染時基因表現量即低於感染0小時的基因表 現量，隨感染後時間點增加表現量遞減(圖1b.group V)。另一群基因表現趨勢與其相反，顯著 表現功能群中有porphyrin代謝調控作用(圖1b group VI)。Porphyrin為一可與金屬離子(如:
鎂、鐵、鋅、鎳、銅、鈷、銀等金屬)鍵結的化合物，當其與鐵鍵結形成複合物後，便形成具有 攜帶氧原子能力的原血紅素(heme)。Heme的代謝主要藉由heme oxygenase-1 (HO-1)催化，產生 biliverdin、游離的鐵離子及一氧化碳。HO-1的功能除代謝heme外，在HIV感染情況下，還會誘 導免疫及發炎反應作用活化，使細胞藉此來抵禦HIV的入侵(Devadas and Dhawan 2006)。調控 porphyrin代謝途徑在初級上皮細胞受D2V感染後顯著表現，表示上皮細胞亦可能經由調控免疫 及發炎反應的表現來抵禦病毒的侵害。從圖1b group 中可發現此功能群基因表現量較低，可能
是病毒調控此作用來避免自己遭受細胞防禦機制的迫害。在此基因群中，另一顯著表現的功能 群為負向調控核酸代謝作用。D2V基因組成為RNA，為使其能夠在細胞中進行複製與增殖過程，
會調控細胞降低代謝核酸作用，然而細胞中參與負向調控核酸代謝作用基因表現量極低，可能 為一種反抗病毒調控的防禦機制。在表現量增加的基因及表現量下降的基因中，調節細胞週期 功能群均顯著受到影響，顯示病毒感染細胞後，可能主要藉由調控細胞週期進行控制宿主細胞 作用。
微陣列資料利用 K means 軟體及 DAVID site 以 GO 分類系統進行功能分群後，可觀察到多數 顯著表現的功能叢集為細胞對病毒感染過程產生的防禦機制。另外用 GenMAPP 軟體分析後，除 找出利用 K means 軟體及 DAVID site 分析結果相似的功能叢集外，另外觀察到一些與病毒入侵 細胞後調控細胞的作用途徑，如病毒基因體複製、病毒進入宿主細胞途徑及病毒所引起的免疫 反應機制等功能群。在基因體複製方面，病毒藉由調控可活化轉錄作用的基因 HTATSF1 及降低 可抑制病毒複製的 TNIP1 和 IL-8 基因表現量，使病毒基因體可在宿主細胞中進行複製與增殖。
微陣列資料利用 K means 軟體及 DAVID site 以 GO 分類系統進行功能分群後，可觀察到多數 顯著表現的功能叢集為細胞對病毒感染過程產生的防禦機制。另外用 GenMAPP 軟體分析後，除 找出利用 K means 軟體及 DAVID site 分析結果相似的功能叢集外，另外觀察到一些與病毒入侵 細胞後調控細胞的作用途徑，如病毒基因體複製、病毒進入宿主細胞途徑及病毒所引起的免疫 反應機制等功能群。在基因體複製方面，病毒藉由調控可活化轉錄作用的基因 HTATSF1 及降低 可抑制病毒複製的 TNIP1 和 IL-8 基因表現量，使病毒基因體可在宿主細胞中進行複製與增殖。