儘管已有眾多學者對DV感染所導致病症的嚴重程度進行研究，但對於作用機制仍未全盤了 解。目前，有幾種假說，包括病毒的毒力、抗體依賴性增強作用(antibody-dependent
enhancement)、免疫增強作用(immune enhancement)、免疫複合體(immune complex)活化補體
(complement)等幾種推論(Raghupathy, Chaturvedi et al. 1998)。首先是病毒的毒力方面，
以病毒的複製能力、病毒血症時間長短及血中病毒的量、造成疾病嚴重程度、造成流行的能力 來評估，由於不同型(serotype)或同型不同品系(strain)的毒力不同，因此毒力較強的病毒會 造成較嚴重的病症(Vaughn, Green et al. 1997)。第二種假說為抗體依賴性增強作用(Halstead 1992)，認為在第一次感染所產生抗體，在第二次受不同型感染時並不能中和病毒，反而使DV透 過其抗體的Fc部分與單核球(monocyte)或巨噬細胞(macrophage)的Fc受器(FcR)結合，進而提高 病毒進入宿主細胞的機率，使更多的病毒產生，導致DHF/DSS的發生。因此，若懷孕婦女感染登 革熱，則會將其抗體經由胎盤傳給胎兒，嬰兒在感染初期抗體的量尚足夠中和病毒，但八個月 大的嬰兒，體內來自母體的抗體效價降低不但不能中和病毒，反而增加病毒感染力(Kliks, Nimmanitya et al. 1988)。第三種假說為免疫增強作用，即宿主細胞遭受第二次不同型DV感染 會誘發初次感染的免疫力而導致細胞激素(cytokines)大量表現，但失去控制進而造成嚴重病症 (Bukowski, Kurane et al. 1989; Gagnon, Ennis et al. 1999)。在細胞激素的研究當中指出，
輕微症狀的DF病患身上，其體內所釋放的細胞激素主要由TH1細胞分泌，包括
interferon-gamma(IFN-γ),interleukin-2 (IL-2) and tumor necrosis factor-α(TNF-α)；
但在嚴重病徵的DHF/DSS病人體內所表現的細胞激素為TH2所釋放的IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, and IL-13。在TH1與TH 2所釋放的細胞激素中，扮演主要調控角色的細胞激素分別為IL-10和IFN-γ(Raghupathy, Chaturvedi et al. 1998)。除此之外，研究也指出初次感染登革熱第一型病 毒的單核球會釋放IL-1、TNF-α、interferon-α(IFN-α)，若第二次感染登革熱第二型病毒，
則IFN-α會大量表現，促進單核吞噬細胞合成及釋放一氧化氮(NO)，而NO可以促進血管擴張。
另外，DV也會促進單核球細胞產生血小板活化因子(platelet-activating factor)、thromboxane B2、prostaglandin D2，尤其是二次感染時，血小板活化因子表現量更是顯著(Kim, Hayashi et al. 2003)。其作用為活化血小板，進而影響內皮細胞的功能，導致血小板量降低及血管通透性 增大。第四種假說是由Dr.Rosen提出，當二次感染時，免疫複合體會活化補體系統相關因子 (eg.C3a和C5a)，這也和病症的嚴重程度有很大的關係(Kuberski, Rosen et al. 1977; Malasit 1987; Srichaikul and Nimmannitya 2000)。最後一種假說為不正常的免疫過度反應假說
(aberrant immune responses)，免疫細胞早期活化的標幟CD69表現、CD4/CD8比例下降、細胞
激素過度產生、辨識血小板及抗內皮細胞自體抗體存在，顯示淋巴系統的過度活化反應可能是 造成出血性最早的一個主因(Green, Pichyangkul et al. 1999; Liu, Huang et al. 2002)。
綜觀以上各種假說，可推知二次感染所造成嚴重性病症的機制很可能與細胞免疫反應有關。然 而，DHF/DSS嚴重的病徵在初次感染的情況下亦會發生，且許多病人在受二次感染時，血中病毒 的含量較初次感染時的低(Chen and Wang 2002)。所以，在初次DV感染情況下，導致較嚴重病 症的機制仍值得探討。
1.3 利用cDNA微陣列技術探討登革熱病毒與宿主細胞間的交互作用
近年來，已有許多研究探討DV感染宿主細胞後，細胞與病毒間複雜相互調控關係。在先前以 微陣列技術分析DV感染細胞研究中，血管內皮細胞受D2V感染後，一些作用機制會產生變化，如 細胞凋亡、RANTES和IL-8等細胞激素產量增加，此外，NF-κB訊號傳遞途徑活化、補體系統活 化、傷口癒合、調節細胞週期、抗病毒生物途徑及細胞骨架結構等作用也受調控(Warke, Xhaja et al. 2003; Liew and Chow 2006)。基因programmed cell death 8(PCDC8)、
receptor-interacting serine-threonine kinase 3(RIPK3)、tumor necrosis factor
superfamily member 6(TNFSF6)、TGF-beta receptor-interacting protein(TRIP)、抑制細胞 凋亡的human inhibitor of apoptosis (h-IAP1)活化表現；造成染色體濃縮、DNA斷裂的 PDCD8/AIF表現降低，抑制cytochrome c調控caspase訊號傳遞途徑的heat shock protein 27(GSP27)，對細胞凋亡或存活扮演重要決定角色。phospholipid scramblase 1(PLSCR1)藉由 將phosphatidylserine易位來調控補體系統活化作用。MAD3基因表現在細胞週期中的S-phase，
作用為調控細胞有絲分裂anaphase初始化的關卡，使細胞複製過程無法進行。此基因表現可能 作用為停止已受感染的細胞複製生長，最後自行凋亡。Actin的組成在細胞感染後有顯著受調控 的變化。巨噬細胞為DV主要感染宿主之ㄧ，同樣以微陣列基因晶片方式分析，可觀察到感染後 短時間內就會釋放免疫反應相關調控因子，如細胞激素(cytokines)、細胞附著(cell adhesion) 分子及趨化因子(chemokines)等。這些因子的表現決定DV對細胞迫害的嚴重程度
(Moreno-Altamirano, Romano et al. 2004)。利用微陣列技術分析下，可觀察到上述細胞與病 毒間相互調控關係及一些與病毒造成病症嚴重程度的因子，另外，從一些臨床病人體內或直接
體外感染內皮細胞的實驗中，仍可發現一些其他會影響病症嚴重程度的因子。如病人血清中一 氧化氮含量(Trairatvorakul, Chongsrisawat et al. 2005)、TNF-α(Cardier, Marino et al.
2005)、IL-6、tissue plasminogen activator(Huang, Lei et al. 2003)表現量及細胞中NF-κB、IL-8表現量(Bosch, Xhaja et al. 2002)多寡等因素。
1.4 研究動機和策略
由於登革熱目前缺乏良好的動物模式(animal model)且檢體取得具高風險性(Avirutnan, Malasit et al. 1998)，故一般實驗以細胞培養(cell culture)方式進行，多以血管內皮細胞 (e.g. human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)為主要探討模式。然而，在感染登革 熱病毒後出現較嚴重病症的病人身上，並無證據顯示其血管內皮細胞遭受感染或破壞，顯示內 皮細胞雖是血管通透性增加時受改變的第一線，但這影響可能並非源自DV直接感染複製所造 成，因此，受DV感染後血管內皮細胞通透性增加的情況，可能是受其鄰近細胞遭感染後產生反 應所導致的影響(Carr, Hocking et al. 2003)。另外，研究指出，在DV感染不同型態細胞過程 中，以相同細胞數量進行感染，發現上皮細胞被感染的比例較其他型態細胞高，顯示上皮細胞 對DV的接受度高(high susceptibility) (Diamond, Edgil et al. 2000)。
基於上述理由，本論文選取與活體組織相近的初級上皮細胞(primary normal nasopharyngeal cells)進行研究。由於細胞在受感染後，基因的表現不會維持相同的反應，因此，實驗設計著 眼於 DV 感染細胞不同時間點後，觀察其對宿主細胞的影響。又為了探討 DV 對細胞直接的作用 影響，選擇感染較短時間點來作觀察。另外，為了研究細胞受感染後基因層次上的表現，藉由 微陣列(microarray)技術，經資料整合分析，從龐大的基因資料庫中有效地挑選出受調控的基 因，對基因表現變化作統合性的觀察，並深入探討基因受 DV 感染後造成的影響，進而推演出對 上皮細胞本身或其鄰近細胞(eg.內皮細胞)可能作用的機轉。本研究發現，上皮細胞受感染後可 能會釋放調控血管通透性的因子，改變內皮細胞間隙相關的蛋白表現量降低。推測這樣的現象 會使影響通透性的分子或病毒較易通過上皮細胞層進到內皮細胞，進一步改變內皮細胞及組織 通透性，局部性導致大量病毒通過血管細胞層，傳播至血液循環系統中，最後造成全身性感染。
貳、材料與方法
2.1 細胞株與病毒1.NPN001(primary normal nasopharyngeal cells)，人類正常初級鼻咽細胞 2.HUVEC(human umbilical vein endothelial cells)，人類臍靜脈初級內皮細胞 3.NPC-TW06，人類鼻咽上皮細胞株
4.ECV304，人類臍靜脈內皮細胞株
5.BHK-21(baby hamster kidney cells)，幼小倉鼠腎臟纖維母細胞 6.D2V，台灣小琉球分離出之病毒株 PL046
2.2 引子
引子 序列(5,~3,)
NS3F CGGGAGATTGTGGACCTAATGTGTC NS3R TGTCCAGAACTCCACGAACGTTCAG D2F4522 GCTGGAGTATTGTGGGATGTCCC D2R5550 CGAACGTTCAGGGATTTCTCTTTCTT PAI2-F AATCTAAATGGGCATGATCC
PAI2-R CTCACCCTAAAACTAAGCGT Col4a6F AGAGGTCAGCACACAT Col4a6R GCTTTACTTTGAACCAGGC
2.3 質體
質體名稱 特性 來源
D2NS12388-3477/pCR3.1pCR3.1 上帶有 D2 NGC strain NS1 sequence 及 flag tag
中研院生醫所林宜玲老師實驗 室(constructor:李乾彰) D2-NS3-pCR3.1 pCR3.1 上帶有 D2 NGC strain NS3
sequence 及 flag tag
中研院生醫所林宜玲老師實驗 室(constructor:孫貽菁) D2 NGC NS5-flag-pCR3.1pCR3.1 上帶有 D2 NGC strain NS5
sequence 及 flag tag
中研院生醫所林宜玲老師實驗 室(constructor:陳奕丞) pCDNA3-NS2A pCDNA3 上帶有 D2 NGC strain NS2A
sequence 及 HA3/His6 tag
交通大學楊昀良老師實驗室 (constructor:楊馥嘉) pCDNA3-NS2B pCDNA3 上帶有 D2 NGC strain NS2B 交通大學楊昀良老師實驗室
sequence 及 HA3/His6 tag (constructor:楊馥嘉) pCDNA3-NS4A pCDNA3 上帶有 D2 NGC strain NS4A
sequence 及 HA3/His6 tag
交通大學楊昀良老師實驗室 (constructor:楊馥嘉) pCDNA3-NS4B pCDNA3 上帶有 D2 NGC strain NS4B
sequence 及 HA3/His6 tag
交通大學楊昀良老師實驗室 (constructor:楊馥嘉)
2.4 初級細胞及細胞株培養(Primary cell and cell lines culture)
初級鼻咽上皮細胞自正常女性鼻腔取出後，放置細胞於事先以膠原蛋白處理過之T75 培養盤 (collagen-coated plate)，培養於不含血清的keratinocyte medium(Gibco)，置於 37℃的 5% CO2 培養箱中培養。當細胞生長近約七至八成滿時，將培養盤取出，抽去培養液，以 5 ml PBS清洗 一次，再以 2 ml Trypsin-EDTA溶液打散細胞，取出後置於 15 ml離心管，加入 8 ml的培養液中 和Trypsin-EDTA的作用，以 1000 rpm(Beckman AllegraTM 6R centrifuge)離心 5 分鐘兩次後，
加入 15 ml培養液並混合均勻後放回 37℃的 5% CO2恆溫培養箱中培養。在本論文中所使用的初 級上皮細胞代數不超過十代以上。初級內皮血管細胞(primary human umbilical vein
endothelial cells;HUVECs)是由王寧博士提供(中研院生物醫學科技研究所)。
由於初級細胞培養不易，因此在本研究中，我們採用鼻咽癌細胞株(NPC-TW06)來模擬病毒感 染後細胞反應的狀態。NPC-TW06 為一從台灣鼻咽癌患者體內分離出的細胞株。培養於含 10%
fetal calf serum (FCS)及penicillin (100 u/ml)/streptomycin(100 μg/ml)兩種抗生素的 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Gibco)培養液中。用於增殖病毒(virus
amplication)的C6/36 cell培養於添加 10% FCS的MEM(Minimum Essential Medium; Gibco)培養 液中，培養在 28℃恆溫培養箱。BHK-21 cell應用於測定病毒效價，培養在 5% FCS的MEM培養液 中，置於 37℃、5% CO2恆溫培養箱中培養。
2.5 登革熱病毒之增殖(Dengue virus amplification)
將D2V PL046病毒株以感染率MOI(multiplicity of infection)=0.1接種於C6/36細胞中，培 養於含5％ FCS及penicillin/streptomycin的MEM培養液中，細胞置於28℃、5％CO2的培養箱中 培養一小時。病毒經過兩小時吸附作用後，吸去含有D2V的培養液，以PBS清洗細胞三次，再加
入含10％ FCS及penicillin/ streptomycin的MEM培養液。細胞於感染後三天、六天、九天收集 細胞培養液於15 ml離心管中，以轉速為1000 rpm(Beckman AllegraTM 6R centrifuge)情況下離 心5分鐘，收取病毒上清液，將之通過0.22 μm的filter(Millipore Co., Bedford, MA, USA) 使細胞殘渣濾掉，最後分裝到1.5ml的eppendoff中，保存於-80℃備用。
2.6 噬菌斑試驗測定病毒效價及病毒失活作用
(Virus titration by plaque assay and inactivation)
將細胞數為 3×105的BHK-21 細胞置入 6 well細胞培養皿中，在培養箱中培養一夜後，細胞約 七八分滿。將病毒以未含血清的培養液(serum-free MEM)作為稀釋液，進行十倍系列稀釋。稀 釋完成後，將細胞自培養箱中取出，抽掉培養液，以未含血清的培養液清洗細胞一次後，每個
將細胞數為 3×105的BHK-21 細胞置入 6 well細胞培養皿中，在培養箱中培養一夜後，細胞約 七八分滿。將病毒以未含血清的培養液(serum-free MEM)作為稀釋液，進行十倍系列稀釋。稀 釋完成後，將細胞自培養箱中取出，抽掉培養液，以未含血清的培養液清洗細胞一次後，每個