耳又 0.2 ml 以 DABA method 剩 0.8 mllysate 在加入 3ml
DABA method :
1. DABA ( 3, 5-Diaminobenzoic acid )之記製:
在 1 ml H
2
0 中加入 300 mg DABA 與 50 mg charcoal,
充分混合之後以 3000 rpm 離心 10 min. ，並通過 0 .45μm 之 filter 即成 O
2. 步驟:
a 取 100μIDNA，在避光下加入 100μIDABA b 置於 water bath 中加熱至 60
oc
, 30 min.c. 立即置入水中冷卻
d. 力口只、 1.6m1. 1NHCI e. 10000 rpm 離心 5 min.
f.於 1 hr 內以 fluorocence spectrophotometer Ex / Em
=
408nm /508nm 測之
{六). Xanthine oxidase 活性分析:
(Activity of xanthine oxidase assay)
purine 在體內的代謝固不同的生物?其產物略有不同會在人類、
人猿、爬蟲類與鳥類中，其代謝之最終產物為尿酸 (uric acid) ，其代 謝途徑如 Fig. 5:
因為 uric acid 之 p均為 5 .4 ，必須在較高之 PH 值下才具有較大 的溶解度會而一般尿液都屬於酸性，故 uric acid 實不易經尿液而排出
體外(在 38 0ca幸， uric acid 之溶解度只有 0.1g/I) ，故如果可以將
xanthine oxidase 活性抑制其IJ uric acid 將不會生成，而 purine 之最終 產物即變成 xanthine 或 hypoxanthine ，而此兩種化合物的溶解度皆
NH3
太多所引起之疾病會如風濕症、腎結石、膀就結石或痛風等 O
Xanthine oxidase 活性之分析主要是根據 Robak 等人( 1988 )
之方法 (34 )書籍白利定 xanthine oxidase 之產物: uric aci性的產量 來看此 enzyme 的活性 O 其步驟如下:
1. 歸零:
將兩個 cuvettes 分別加入下列物質:
(1 )12μI phosphate buffer (內含 0.2 M NaH
2
P04
、 H2
0 : 0.2 M Na2HP04=1 0 . 1)(2)100 μIDMSO
(3)888μI
xanthine buffer ( phosphatebuffer 內含 2
X 10-4 M xanthine)分別放入 spectrophotorneter 之 reference 與 Sample 槽中加以
歸零 O
2 在測試 sample 之前，先做控制組試驗:
分別加入下列物質於兩個 cuvettes 中
Reference cuvette:
(1) 12μI phosphate buffer
Sample cuvette .
(1) 12μI xanthine oxidase ( 1.3units/mg protein ) (2) 100 μ10MSO
(3) 888μI xanthine buffer
混合均勻之後於室溫中靜置 10 min ，測定 295 nm 並且記錄其最大 之 00 值 O
3.Sample 之測試:
將兩個 cuvettes 分別加入下列物質:
reference cuvette .
(1) 12μI phosphate buffer
(2) 100μI test sample (溶於 OMSO 中)
(3) 888μi xanthine buffer Sample cuvette
(1) 12μI xanthine oxidase (2) 100 μI test sample (3) 888μI xanthine buffer
混合均勻之後於室溫中靜置 10 min ，測定 295 nm 並且記錄其最大之 OO{直 O
{七).超氧陰離子之測定:
(Determination of superoxide anion)
oxidase 催化產生 O 由於氧化態之 cytochrome C 會接受超氧陰離子 的電子後成為還原態會並在波長 550 nm 的吸光度有增強( 35 )。因 此可在 xanthine 會 xanthine oxidase 與 cytochrome C 存在下加入不 同濃度 (0.02
,
0.05,
0.1 mM) 的 geniposide 或 PBS ( geniposide之 solvent )下觀察 geniposide 對超氧陰離子的影響 O 最後以 nmol/ml/min 表示 O 其流程與計算方法如下:
取 1 ml 0.3 mM cytochrome C 加入 1.8 ml 0.2 mM xanthine
還入 water bath 加熱至 37 0C
• 5 min
加入 0.2 u/ml xanthine oxidase
加入 0.1ml PBS 或不同濃度( 0 間的， 0.02 , 0.1 mM) 之
geniposide
以 spectrophotometer 在波長 550nm 下 scan 10min
Determine superoxide anion as follows
.
A
x
1000x
1nmol/min/ml= …………一
29.5 X t where
t = total time(min)
A=change in absorbance per minute at 550nm
29.5=Millimolar absorptivity of cytochrome C at 550nm
{八).自由基捕捉測定:
(De說te軒rr帥ni隔nat誼ion of free r悶a咀 i姑ca醋I-q胸.
本研究使用之自由基是 1 ， 1-diphenyl-1-2-picryl-hydrazyl radical
(DPPH 卡因為 DPPH 在結構上有穩定的共振 F 所以可以在適當的儲
存下長時闊的保存下來( 36 )。而且 DPPH 在 517nm 的波長下有其 獨特的吸光，隨著 DPPH 濃度減少時 9 其 OD1直亦會隨之降低會故在
此研究中我們可以藉由 DPPH 當一個指標來看 geniposide 對島由基 是否有捕捉的作用 O 其流程如下:
取 2.87 ml methanol 加入 30μi 10 mM DPPH
•
加入 100μI DMSO ( geniposide 之 solvent) 或不同濃度( O. 眩，
0.05, 0.1 mM) 之 geniposide
•
直這令室;革中 30 min
•
加入 1 ml redistilled water 與 3 ml toluene ，並充分混合
•
3000 rpm 離心 10 min
•