朝鐘教授

私立中山醫學院生物化學研究所碩士論文

去氫棍子甘與洛神花成份抗氧化活柱之探討

The inhibitory effects and 臨echa胞的ms of

ge阻iposide and Hibiscus Sabdar掰泣 L 。詛

reactive oxygen species ^{syste臨 in} culture hepatocytes

朝鐘教授 (Chau-Jo且gWang) 翠華副教授(耳聞i闢Hwa Tse膛的 指導教授:王

曲

同

仕( Erl-Shyh Kao )

I可 而

研究生:

本論文為中山醫學院授予理學碩士學位之必備條件 之一會經中山醫學院生物化學研究所碩士論文考試委員審

核合格實並口試通過 O

口試委員

國立臺灣"大學醫學院

毒理研究所副教授

私立中山醫學院

生物化學研究所教授兼所長

(本論文指導教授)

私立中山醫學院

生物化學研究所副教授 (本論文指導教授)

郭明良

^副教授

有叫丸一

王朝鐘 教授

多 7月~.~

曾翠華

三二-.， .-甘于江

、「γ7/ . ~( {T甘、

三千千

一一一一一

副教授

誌謝

對一個初次嘗試研究工作者而言，一項研究工作的完成?無寧是 許多協助與鼓勵的累積 O 在此由衷的感謝我的指導教授曾翠華老師、

王朝鐘老師兩年來在學業上與精神上的支持及勉勵 O

同時也感謝朱嘉一、周芬碧、胡超群老師以及生化所諸位老師的

教誨 O 另外對於林玉玲學姊、黃怠珮學姊;鄭自君、李妙真、黃俊銘

同學在實驗上的指導與生化科周秀琴小妞在器材上的協助會致上無比

的謝意 O

本論文之質譜、核磁共振光譜白鹿科會中部貴重儀器中心與台大

醫學院藥學研究所代為測定 O 又本論文承郭胡良博士之審查與指正，

在此一併致謝 O

最後謹將此論文獻給我的父母、家人以及我最懷念的祖母 O

目錄

頁數

第一部份 去氫棍子甘抗氧化活性之探討 1

縮寫表.... ...周圍..

••...•.• .

..圖個...8'.

• •

^.甸.•••••••••• ••• • •••••• •

2

中文摘要.. . . . .. .固晒..• ••• •• • • • • ••• •••• • •• • ••• •••••••• • • • •••••••••••• •••• 3

英文摘要闢.... ••. ....•• . . .…留..

. . . ...•... ... . . . .... 5

壹.緒論

一.去氫棍子甘 (geniposide) 的背景... 6

二.研究島的....• . •••••• . . •• .• •••••••••• • •••. . .••. . .•••. •.

1 0

貳.實驗部份

一.前言 .•.••• ..圓圓.• • ...攝..

• • •• • • •• ••• • • •••• •• • •••• • •••• •••• • • • • • 11

二.材料與方法

(一).化學試劑與儀器.. . . .... . .. . . ... . .... ... . 15

(二).肝細胞之初代培養... .國.•• •• • •• • ••• •••••• •• • • •• • 16

(三).肝細胞毒性分析...... . .

...…. .... . ...

^{..醇 16}

(四).脂質過氧化分析... ....

.…. . . .. ... .. ... ... . .

.回 18

(五 ).DNA 損傷修補作用之測定.. . . .•. . .•••.• .••••

19

(六). Xanthine oxidase 之活性分析... 21

(七).超氧陰離子之測定.. .蜀..

• • • •••••• • • ••• • • ••• • • •

^.前

24

(八).自由基捕捉測定….. . 11 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • .宙間 25

(九).去氫棍子甘對 glutathione

peroxidase

(十).去氮棍子甘對過氧化氫酵素之影響 28

參.結果.... ... . ... ... . ... . . ... .. . . ... ..個... 30

肆 a 討論圓圓"..• • •• • • •••••••••• •• • • • • ..圓圓圓圓.. .但... 39

伍.參考文獻圖...

. . .. . . 11 .. .. .. .. ... . . . ... ... .

^{....回 42}

第二部份洛神花成份抗氧化活性之探討 47

縮寫表... •• • ^.圓周.•• • • • •• ...周四.• •••

.…. .

^...闢.

. . . . .. .. .. ... ...… 48

中文摘要給包

英文摘要蜀

，怎 &主陣主.A.

可旦回 符4司吾冊

49 51

洛神葵的形態與分佈.... .. . . ...闢... ....國 53

一. ;各神花的性狀﹒

55

;各神葵的傳統用途與已知成分..

55

貳.洛神花粗萃取物之抗氧化活性分析

前言鍾...•• ••••

...…‘...

57

一.材料與方法

(一).化學試劑與儀器.

. .. ... .. ... ... ... ...

^的

(二).粒萃取物之分離.... .

..11... ... .... .. .... . .

的 (三). Xanthine oxidation 活性分析... 60

(六).細胞毒性分析。.

. . ... .. . . .... ... ...

62

(七).肝細胞毒性分析...囡囡.

. . . ... .. . . .... ..

^的

(八).脂質過氧化分析.

.

..間...囡 63 (九). DNA 損傷修椅作用之測定...…闕，因 64

(十). GSH 定量分析.

. . .

...間閉. .圓圓 ...811 64

三.結果...

. . . ... . . .

^..雷..

• • • • • •

...也...

67

四.討論...• •• •• • • • ••••• •• .國.•

11 . . . ... . . . . 11 ... .... . . ... . 85

參.洛神花草離成分之抗氧化活性分析

一. 前言 • • ••••••••••• • •••••• • •• •••• .鷗圓圓咽.^•

...‘... 87

二.材料與方法

(一).化學試劑與儀器..... .. . . ..國...

••• •

^{...倒閉 87}

(二).有效成份之純化分離及鑑定..鈕...

88

(三)圖 Xanthine oxidation 活性分析.

... . ....“

115

(四).自由基捕捉測定... .圖...

1 1 Ei

(五).肝細胞之初代培養…閉目... 115

(六).肝細胞毒性分析...

1 1

t5

(七).脂質過氧化分析...

1 1

t5

(八). DNA 損傷修補作用之測定... 115

(九).

Protocatechuic

acid 對 glutathione

peroxl 位 ase 之影響... 1 1!5

三.結果...… 122

四= 討論 ...祖國間 136

肆，參考文獻.

. . .. ... . . . .... . . .. . .

^...閉.

• . •••••. •••••

^{...咽 138}

第一部分

去氫棍子甘抗氧化活性之探討

縮寫表

GP , geniposide ; PQ , paraqu品t ; X , xanthine ;

XO , xanthine oxidase ;

LDH , lactate dehydrogenase ; AL T , alanine transaminase ;

期 DA， malondialdehyde ;

UDS , unscheduled 0 閥A synthesis ;

DPPH , 1 ， 1 闡diphenyl間各picrylhy位 razyl

中文摘要

去氫棍子甘(

geniposide

)是棍子 (

Gardenia jasminoides

Ellis )中的主要成分贊其結構為一 iridoid 型之自己蹄體 O 對於去

氫棍子甘在肝細胞處於氧化壓力峙的保獲特性是本研究中第一次 被提出 O 當我們利用巴拉割( para可 uat )在濃度 5 mM 與黃 憬。今/黃噫吟氧化酵素( xanthine / xanthine oxidase )在濃度5 μM / 0.01u/ml 處理之下能產生活性氧系 (reactive oxygen species; ROS) 進而造成初代培養之肝細胞 (primary culture

hepatocyte) 的傷害。利用巴拉割與黃。祟。今/黃。象。今氧化酵素這兩

種系統皆可以顯著的提高肝細胞的乳酸去氫酵素( lactate dehydrogenase; LDH )、丙氯駿轉氛酵素( alanine transaminase;

ALT) 以及脂肪酸過氧化的產物丙二艦酸( malondialdehyde;

MDA) 而造成肝細胞的毒性 9 但是可以有效的被去氫花子甘

(0.1 mM) 所抑制 O 另外巴拉對與黃。祟。在于/黃。裳。在許氧化酵奈這兩

種系統產生的含氧自由基( oxyradical )所造成的 DNA 損傷員IJ 是以 UDS ( unscheduled DNA synthesis )方法來測肝細胞 DNA修補的董事發現加入去氫花子甘( 0.02-0.1 mM )能夠降低 這二種系統所引起之基因毒性 O 研究中也發現去氫棍子甘並不能 抑制藉由黃嚀。今/黃嘩。今氧化酵素所產生的超氧陰離子

( superoxide anion ) ，但能夠捕捉部分 DPPH ( 1, 1-diphenyl-2-

picryhydrazyl )自由基 O 對於抗氧化酵素方面，去氫棍子甘可以提

氧化酵素( GSH-Px 和 catalase )的活性來降低肝細胞在遭遇氧

化壓力時的傷害 O

Abstr晶ct

Geniposide is an iridoid glycoside in the fruit of Gardenia jasminoides Ellis. Its properties of protecting hepatocyte subjected to oxidative stress were first investigated. Paraquat (PQ:5mM) and xanthine/xanthine oxidase system (XlXO: 5μMI

0.01 ~ml) can generate reactive oxygen species (ROS) which will induce oxidative damage to primary hepatocyte. PQ or XlXO system increased the leakage of lactate dehydrogenase (LDH) and alanine transaminase (AL T) and the formation of malondialdehyde (MDA) but the hepatotoxicity was significantly suppressed by the pretreatment of geniposide (0.1 mM). The oxyradicaI generation by PQ or XlXO system caused DNA damage was evaluated with unscheduled DNA synthesis (UDS) in the rat primary hepatocyte. Addition of geniposide (0.02'"'-' 0.1 mM) decreased genotoxicity evaluated by UDS in both system. Geniposide did not inhibit the generation of superoxide anion in XlXO system but quenched the free radical of 1 J 小

diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH). Gen川1甘iposi地de e剖levat胎ed the activities of catalase and glut協at廿納hione peroxidase (GSH-尹.

time course st心u吐di陪es. It is concluded that the protective action of geniposide subjected to oxidative stress were via quenching free radical and/or elevating defending enzymes (catalase and GSH-Px).

壹、緒論

一、去氫棍子甘( geniposide )的背景:

去氫棍子甘( Fig. 1 )為 iridoid 型之自己聽體，是棍子中之主要成 份( 1 ) ，棍子( Fig. 2 )為茜草科 Rubiaceae 植物，槌子 Gardenia

jasminoides EiIIs 及其它同屬植物多分佈於印度支那、大陸、日本西

南部、琉球、菲律賓、台灣等地，海拔大約 1600 公尺左右之闊葉林 區 O 在不同年代及地鼓有其不同之異名:

[別名] :本舟(本主鈞、越桃(別錄)、槌子(綱日)、鮮支(娟的、山去 氫棍子、山黃槌、技子、色枝、 Shan-jee-chee( 香港)、

Gardenia (英)、 Fructus Gardeniae ( 2 ) .

棍子始載於我國第一部本草典籍一神農本萃經之木部中品?在天

然藥物方面應用甚多，尤其在中藥方劑上如黃蓮解毒湯、茵練萬湯、

槌子乾姜湯等，被收載的方劑多達 47 個 O 其性寒、味苦、入心、肺、

三焦三已經會其功能為清熱瀉火、利尿、止血，效}男方面民間多以治熱

病，心煩懊惱、黃痘、淋病、消渴、自赤熱痛、吐血等症( 3) ⁰

去氫棍子其主要成份為 Carotenoids (α-Crocin , C

44

^H

s4

^0斜，

α-Crocetin , C

20

^{H訕。 14)'} Nonacosane ， β-Sitoster斜， d-

HOH 2C

R=Glc闇

OR

Fig. 1 Structure of geniposide.

Fig.2A 棍子之台灣市場品(原圈)

Fig.2B 花子之台灣市場品 X 1.5

左起 山站在子，棍子仁(以上為野生品) 水花子，棍子仁(以上為栽培品)

6) 0 棍子中的 Carotenoids 由於它的低毒性( 7 ) ，一直被廣泛的應 用於食品色素及酒的香料 O

在已知單一成份的研究方面會藏紅蔽( Crocetin )對黃鞠毒素致 肝癌作用及機轉已被證實，去氫棍子甘方面會主邊去的研究多注重在其 藥物動力學方面之研究會經由實驗證實去氫槌子甘在動物體內胃腸消

化系統可被轉換成其去酪體( 8) ，同時有證據顯示其藥理作用可能 來自其去酷體( 9) ，另外亦有研究顯示去氫花子甘在經由人體的腸 內細菌代謝之後會形成一種新的物質 genipinine ( 10) ，這是一個舍 有 nitrogen 的物質 F 但是其有無生理或生化的效用貝IJ 不得而知實在利 膽方面實已有報告證明去氫梳子甘具有利膽作用，將老鼠以胃管灌

食費發現去氫槌子甘能刺激膽汁之分泌'但以腹腔注射則不具有此作 用 (11-13)0

在去氮槌子甘的毒性研究方面，當老鼠以高劑量( 320 mg/kg )

餵食習 24 小時後血清中轉胺酵素顯著的上升 9 同時肝中 GSH 含量亦

隨之下降 (14) 0 去氫棍子甘的保肝作用也，有被報告，以去氫棍子甘

( 240 mg/kg )連續處理三天，其肝中結合性酵素如 α-naphthol glucuronosyltransferase 及 Glutathione S-transferase 之活性顯著增

加 O 同時顯示去氮花子甘能促進 α-naphthylisothiocyanate 或其毒性 代謝物的結合及經由膽汁排出( 15 ) ⁰

在最近的研究中 9 我們已經證明了不論的 vitro

(

^{16 )或是的 vivo}

( 17 )去氫槌子甘對於 aflatoxin 81 導致的肝毒性以及基因毒性有一

定的抑制作用 O 另外去氫梳子甘亦可能在 tumor promotion 時當作一 個抑制劑而阻止癌症的發生( 18 )。

二、研究目的:

氧是細胞生存不可或缺的物質，但是當細胞發生不正常的代謝過

程中，卻是造成細胞死亡之殺手含而許多毒性物質( toxic agent )在 進入細胞中往往會造成過量的活性氧系( reactive oxygen species;

ROS) 的產生 9 如超氧陰離子( superoxide anion; O_2'-) ，單氧

(singlet oxygen; 10)

，氫氧自由基(

hydroxyl radical; 'OH )

，過氧化氮

( hydrogen peroxide; 峙。2 )等，而 ROS 的產生貴如果超過細胞本身 抗氧化能力( cellular antioxidant capacity )的時候則會導致細胞胎 質的過氧化( lipid peroxidation ) ，以及蛋白質、 RNA 、 DNA 的損 傷、突變 (19 、 20) ，而這些傷害則可能是造成痞化、心血管疾病，

甚至老化都有一定的相關性 O

由於去氮棍子甘在許多研究中證實有多種的藥理藥效，對於降低 肝損傷及促進解毒能力的效果也被發琨會因此本實驗的目的在研究去 氫棍子甘對於 ROS 所造成肝細胞毒性有無保護或抑制的作用 9 並探 討其作用機轉 O

一、月1一一﹒-5 •

貳、實驗部份

巴拉割( Paraquat ，學名 1 ， 1'-Dimethyl-4 ，4' bipyridicium

dichloride )是一種椏有效而廣泛被使用之除草劑，但是常因使用不

當或誤食而造成許多全身性病例會在以前研究中心也已經證實其有造

成肺臟、肝臟和腎臟方面的毒性( 21-23 )。在植物方面， paraquat

的除草機制乃藉由于擾細胞內電子傳遞系統會抑制植物葉子光合作用 使 NADP 不能還原成 NADPH ，而造成 ROS 的產生?經由造成細胞

膜的過氧化作用( 24-25 ) ，而破壞掉細胞膜，使得樹葉枯死( 26- 27 )。在動物方面亦有類似的效果，其可能的反應機制如 Fig.3 0

Xanthine / Xanthine Oxidase 系統則是另一種產生 ROS 的系統，

xanthine 在經由 xanthine Oxidase 的作用之下會產生 uricacid ，而在 反應過程當中則會伴隨著 ROS 的產生造成 DNA 的損傷 (28) ，其可

能的反應機制如 Fig.4 ⁰

雖然 geniposide 在許多生理、生化及藥理方面都有被報導 9 但是 對於對抗細胞遭到氧化壓力( oxidative stress )時的保護效果則到 目前為止沒有被研究過 O 因此我們利用 paraquat 與 xanthine I

\ NADP

\ + __ .. _ __+ __ Altered PQ- ~歪扭 PQ ﹒一一主辦 NA

• - "'"... metabolism

1....-一 02

02+ Hρ2 ^{咱是一一一包圍}SOD

c 吋

H20+02

Toxicity

e

&zaw

a

US VE

;l

Mdf

--B SPI- u li I VJ

D-O

•

.

O HU

臨 embrane lipid peroxidation ( MDA)

Polysaccharide

Nucleic acid

Fig. 3 Proposed mechanism of toxicity of paraquat.

Xanthine

H₂0, O₂

H+, O_2-

Uric acid

Fig. 4 Formation of superoxide anion by xanthine/xanthine system

而來( primary culture hepatocyte ) ，初代培養之肝細胞係根據 Bonney 氏等之方法 (29) ，以肝臟灌流方式取得 O 之後我們針對下 列的實驗做一系列的研究:

1. Hepatotoxicity assay 2. Lipid peroxidation assay

3. Measurement of DNA repair synthesis 4. Activity of xanthine oxidase assay 5. Determination of superoxide anion 6. Determination of free radical個quenching

capacity

7. Time course effect of geniposide on glutathione peroxidase activities

8. Time course e仟'ect of geniposide on catalase

activities

二、材料與方法:

{一}困化學試劑與儀器

1. 化學試劑

Geniposide paraquat (叭-dimethyl-4 ，4'-bipyridicium dichloride ), cytochrome C , xanthine ' xanthine oxidase collagenase

,

proteinase K

,

thiobarbituric acid ' SDS ' EDTA 會

thymidine

,

glycine '(methyl-3H)thymidine ' DPPH ( 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl )和 alanine transaminase ( Al T)

,

lactate dehydrogenase ( lDH ) kit 均購白美商 Sigma Chemical 公司，而其 他實驗所需要的 solvent 則購自德國 E Merck 公司 o Aquasol♂閃爍 液購自美國 New England Nuclear ( NEN )公司. protein assay kit

購自 Bio-Rad 公司 O 細胞培養所需的培養基( medium . Williams E ), PBS ( phosphate buffer saline ) , calf bovine serum , PSN antibiotic mixture

,

glutamine ' HBSS ( Hanks' Balanced Salt

solution) 等購自美國 GIBCO BRl 公司，其他試劑與實驗所需之 dish 其1J 購自 Nunc 公司 O

2. 儀器:

Spectrophotometer ( HITACHI; U2000)

Floroscence spectrophotometer ( HITACHI; F2000) Scintillation counter (AlOKA; lSC-900 )

{二).肝細胞之初代培養:

(Primary culture hepatocyte)

初代肝細胞之培養係根據 Bonney 氏等之方法( 29 )以肝臟灌 流方式取得( two stage liver pe巾sion method ) 0 以購自台大動物研 究中心之 Wistar 系大白鼠(體重約 200-300 克)給予腹腔注射

pantobartital ( 50 mg/ml )麻醉，劑量為大白鼠體重每 100 公克給予 0.2削，麻醉後，打問腹腔以 20G 血管導管穿刺肝門靜脈 9 固定之後

以加有 EGTA 而不合鈣、張離子之 HBSS ( Han 峙J Balanced Salt

solution )緩街液灌流，同時剪斷下股靜脈放血?再以含膠原酵素

( collagenase )之 HBSS 緩衝液灌流後 9 取下肝臟 9 分離肝細胞 9 依 實驗需要之細胞數目培養於含有 100/0 胎牛血清( calf bovine serum)

,

1 % PSN antibiotic mixture

,

1 % Glutamine 之 Williams E

培養基中 O 產於 37

oc '

^{50/0 CO}

2

^{培養箱中培養 O}

^於

^{4 小時之後史換}

培養基會除去未貼壁之細胞 9 當作以下各種實驗之細胞材料 ^O

{三).肝細胞毒性分析:

(Hepatotoxicity assay)

肝細胞毒性分析最常被使用的方法多為偵測其 lactate

dehydroganase ( LDH )與 alanine transaminase ( AL T )二種肝臟 酵紊 O 首先在肝細胞中預先處理 O. 眩， 0.05 , 0.1 mM 的

geniposide ，經過 1 個小時之後再加入 paraquat ( 5mM ) 8 小時或

xanthine/xanthine oxidase ( 5μM/0.01u/ml)1 小時 9 然後取出 1 圳

度 (0.0) 0 最後單位以 mu/10

⁶

cell 來表示 O 其流程與計算方法如下:

培養 1 X

10⁶ cell /60 mm dish

• 4 hr

置換新培養基，除去未貼壁之細胞

加入不同濃度( O. 哎， o. 的， 0.1 mM) 之 geniposide

J 也

加入 Paraquat (5mM)

18

^hr

取出 1ml

:

medium

與 LOH (1ml) 或 ALT kit ( 1 m I )在 30 ⁰C 下混合 在波長 340 mM 下以 time scan 方式 scan 120 min.

斗

Xanthine/xanthine( 5μM / 0.01 u/ml )

j

^{1 hr}

Oetermine LOH and AL T activity as follows

A per min

x

TV

x

1000

x

5 enzyme activity(mu/1 0⁶ cell)=

--圓圓圓圈，一…

6.22

x

SV

x

LP where .

A per min=change in absorbance per minute at 340 nm TV=Toatal reaction mixtcere volume

SV=Sample volume LP=Light path

{四}‘脂質過氧化分析:

( Lipid peroxidation assay )

由 paraquat 與 xanthine oxidase 二種系統皆會產生 ROS , ROS

在最近的研究中發現會造成脂質過氧化 9 而位於細胞膜之路質一旦被

ROS 攻擊而造成過氧化時，輕則改變細胞膜的流動性與通透性會重

則造成細胞膜的破壞導致細胞的死亡 O

路質過氧化的方法主要是根據 Yagi 氏( 1987 ) ( 30 )所使用的 螢光測定法( fluorometric method ) ，利用的 iobarbituric acid ( TBA )

與脂質過氧化之後的產物之一， malondialdehyde ( MDA )在高溫下 反應產生一穩定之結構實之後以 n-butanol 萃取出來?並在螢光光度 計 Ex / Em = 515 nm / 553 nm 下測定 O 而本實驗所使用之 standard 則是根據 Bradford(1976) ( 31 )中使用的 1 ， 1 ， 3 ， 3-tetramethoxypropan

( TEP )另外蛋白質的定量則是使用 Rio-Rad 公司所生產之 kit 以

albumin 當 standard 測之 O 最後單位以 nmol MDAlmg protein 來表 示 O 其詳細的流程如下:

培養 1

^X 10⁶ cell /60 mm dish

• 4 hr

置換新培養基會除去未貼壁細胞

•

加入不同濃度( 0.02, 0.05, 0.1 mM) 之 geniposide

• 1 hr

加入 paraquat (5mM) 或 Xanthine/xanthine( 5μM / 0.01 u/ml )

• 1 hr

以 PBS 洗二次後以 1 ml 的 phosphate bu仟'er ( 50mM, pH=7.0)將 cell 刮下

取 0.5 ml 加入 3⁰/0 SOS (0.2 ml),

0.1 持 HCI (2.0 ml), 100/⁰

phosphotungstic acid (0.3 ml)

和 0.70/0 TBA (1 ml) ，(另取適當 濃度之 TEP 當 standard)

培養於 100 oC , 30 min

於冷卻後加入 n.但 utanol (5.0 ml) 3000 rpm 離心 10min

•

取上層液於 fluorescence Ex / Em

= 515 nm / 553 nm 測之

(五). DNA 損傷修補作用之測定:

取 0.05 ml 加入蛋白質定量之

kit 2.5 ml (另取適當濃度之 albumin 當 standard)

產才令室溫中 10 min

以 spectrophotometer 波長

595 nm 測之

{臨easurement of DNA repair synthesis )

測定 ONA 修捕的暈主要是藉由 Unscheduled ONA synthesis ( UOS) 的方法?根據 Hsia 等人( 1983 )的方法( 32 ) ，將培養之 肝細胞先以 15 mM Hydroxyurea 與不同濃度之 geniposide 處理一小 時，再加入 paraquat 或 xanthine / xanthine oxidase 處理 2 小時，然

後更換掉培養基會加入 3H 標示的 Thymidine

(

1μCi/ml) 繼續培養

20 小時後會將細胞收集下來雪還於 25 mm , 2μm 孔徑的 PC 波、紙 上會以 10 ml Lysing buffer ( 20/⁰ SOS 會 0.025 M EOTA , 0.5 mg

thymidine 會 0.1 M glycine ' PH=10 及 0.15 mg/ml 之 proteinase K)

將細胞分解 9 再以 3 ml 不合 proteinase K 之緩衝液沖洗 O 將波、紙還

Vytasek (1982) 之方法( 33 ) ，取懸浮液與 DABAi財劑反應呈色，以

Flouorescence Spectrophotometer 於激發波長 λEx405 nm ，放射 波長 λEm 505 nm 測其吸光度 O 最後單位以 cmp I μ9 DNA 來表 示 O 其詳細流程如下:

培養 1

^X 10⁶ cell/60 mm dish

• 4 hr

置換新培養基 9 除去未貼壁細胞

加入不同濃度( o. 位， O. 的， 0.1 mM) 之 geniposide 和 hydroxyurea

• 1 hr

加入 paraquat ( 5mM )或 Xanthine I xanthine oxidase ( 5μ MI

0.01 u/ml )

• 2 hr

以 PBSwash ，置換新鮮的 medium (內含 1μCi/ml 的[

methyl-3H ] thymidine

• 20 hr

以 PBS wash.::.二次，並以 2ml PBS-t (內含 0.5mg/ml thymidine )刮

下 cell

•

將 cell 放置於 25 mm, pore size 2μm 的 PC filter 上，以 10 ml Iysing buffer (內含 2⁰/0 SDS, 0.025 M EDTA, 0.5 mg/ml thymidine,

0.1 M glycine ( PH=10 )與 0.15mg/ml proteinase K) 將 celllyse 再以 3ml 不合 proteinase K 的 Iysing bu仟érwash

小心的將 filter transfer 到 scintillation vial ，孟加入 1 ml 0.5 N HCI0₄

還於water bath 加熱至的。C

!1

^hr

• •

耳又 0.2 ml 以 DABA method 剩 0.8 mllysate 在加入 3ml

DABA method :

1. DABA ( 3, 5-Diaminobenzoic acid )之記製:

在 1 ml H

2

^{0 中加入 300} mg DABA 與 50 mg charcoal

,

充分混合之後以 3000 rpm 離心 10 min. ，並通過 0 .45μm 之 filter 即成 O

2. 步驟:

a 取 100μIDNA，在避光下加入 100μIDABA b 置於 water bath 中加熱至 60

oc

^{, 30 min.}

c. 立即置入水中冷卻

d. 力口只、 1.6m1. 1NHCI e. 10000 rpm 離心 5 min.

f.於 1 hr 內以 fluorocence spectrophotometer Ex / Em

=

⁴⁰⁸

nm /508nm 測之

{六). Xanthine oxidase 活性分析:

(Activity of xanthine oxidase assay)

purine 在體內的代謝固不同的生物?其產物略有不同會在人類、

人猿、爬蟲類與鳥類中，其代謝之最終產物為尿酸 (uric acid) ，其代 謝途徑如 Fig. 5:

因為 uric acid 之 p均為 5 .4 ，必須在較高之 PH 值下才具有較大 的溶解度會而一般尿液都屬於酸性，故 uric acid 實不易經尿液而排出

體外(在 38 ⁰ca幸， uric acid 之溶解度只有 0.1g/I) ，故如果可以將

xanthine oxidase 活性抑制其IJ uric acid 將不會生成，而 purine 之最終 產物即變成 xanthine 或 hypoxanthine ，而此兩種化合物的溶解度皆

NH₃

。內t

uu

AMP deaminase

IMP

PPi

hypoxanthine phosphoribosyl

transferase PRPP

Adenosine

NH₃

Inosine H₂0

Hypoxanthine

ι一位

H₂0 , O₂

H\ O₂^-

xanthine oxidase

A

Xanthine

峙。'。2

H弋 O

2

^-

Uric acid

xanthine oxidase

H₂0

i

^… Adenine

H₂0

i

_Guanine

Fig. 5 Purine 在人體之代謝i過程

太多所引起之疾病會如風濕症、腎結石、膀就結石或痛風等 O

Xanthine oxidase 活性之分析主要是根據 Robak 等人( 1988 )

之方法 (34 )書籍白利定 xanthine oxidase 之產物: uric aci性的產量 來看此 enzyme 的活性 O 其步驟如下:

1. 歸零:

將兩個 cuvettes 分別加入下列物質:

(1 )12μI phosphate buffer (內含 0.2 M NaH

2

^P0

4

^{、 H}

2

⁰ : 0.2 M Na2HP04=1 0 . 1)

(2)100 μIDMSO

(3)888μI

xanthine buffer ( phosphate

buffer 內含 2

X 10^-4 M xanthine)

分別放入 spectrophotorneter 之 reference 與 Sample 槽中加以

歸零 O

2 在測試 sample 之前，先做控制組試驗:

分別加入下列物質於兩個 cuvettes 中

Reference cuvette:

(1) 12μI phosphate buffer

Sample cuvette .

(1) 12μI xanthine oxidase ( 1.3units/mg protein ) (2) 100 μ10MSO

(3) 888μI xanthine buffer

混合均勻之後於室溫中靜置 10 min ，測定 295 nm 並且記錄其最大 之 00 值 O

3.Sample 之測試:

將兩個 cuvettes 分別加入下列物質:

reference cuvette .

(1) 12μI phosphate buffer

(2) 100μI test sample (溶於 OMSO 中)

(3) 888μi xanthine buffer Sample cuvette

(1) 12μI xanthine oxidase (2) 100 μI test sample (3) 888μI xanthine buffer

混合均勻之後於室溫中靜置 10 min ，測定 295 nm 並且記錄其最大之 OO{直 O

{七).超氧陰離子之測定:

(Determination of superoxide anion)

oxidase 催化產生 O 由於氧化態之 cytochrome C 會接受超氧陰離子 的電子後成為還原態會並在波長 550 nm 的吸光度有增強( 35 )。因 此可在 xanthine 會 xanthine oxidase 與 cytochrome C 存在下加入不 同濃度 (0.02

,

0.05

,

0.1 mM) 的 geniposide 或 PBS ( geniposide

之 solvent )下觀察 geniposide 對超氧陰離子的影響 O 最後以 nmol/ml/min 表示 O 其流程與計算方法如下:

取 1 ml 0.3 mM cytochrome C 加入 1.8 ml 0.2 mM xanthine

還入 water bath 加熱至 37 ⁰C

• 5 min

加入 0.2 u/ml xanthine oxidase

加入 0.1ml PBS 或不同濃度( 0 間的， 0.02 , 0.1 mM) 之

geniposide

以 spectrophotometer 在波長 550nm 下 scan 10min

Determine superoxide anion as follows

.

A

x

¹⁰⁰⁰

x

¹

nmol/min/ml= …………一

29.5 X t where

t = total time(min)

A=change in absorbance per minute at 550nm

29.5=Millimolar absorptivity of cytochrome C at 550nm

{八).自由基捕捉測定:

(De說te軒rr帥ni隔nat誼ion of free r悶a咀 i姑ca醋I-q胸.

本研究使用之自由基是 1 ， 1-diphenyl-1-2-picryl-hydrazyl radical

(DPPH 卡因為 DPPH 在結構上有穩定的共振 F 所以可以在適當的儲

存下長時闊的保存下來( 36 )。而且 DPPH 在 517nm 的波長下有其 獨特的吸光，隨著 DPPH 濃度減少時 9 其 OD1直亦會隨之降低會故在

此研究中我們可以藉由 DPPH 當一個指標來看 geniposide 對島由基 是否有捕捉的作用 O 其流程如下:

取 2.87 ml methanol 加入 30μi 10 mM DPPH

•

加入 100μI DMSO ( geniposide 之 solvent) 或不同濃度( O. 眩，

0.05, 0.1 mM) 之 geniposide

•

直這令室;革中 30 min

•

加入 1 ml redistilled water 與 3 ml toluene ，並充分混合

•

3000 rpm 離心 10 min

•

取 upper phase ，產於 spectrophotometer 在波長 517 nm 下測其最

大之吸光度

{九).去氫棍子甘對 glutathione peroxidase 的影響:

(Time course effect of genåposide on glutathione

glutathione peroxidase 之測定主要是根據 Paglia 等( 1967 )的

方法( 37 ) ，利用 H

2

⁰

2

^{當受質?由於還原態的} NADPH 在反應中會

消耗會故可在 NADPH 波長 340 nm 的特殊吸光光譜來測定?最後以

μM / min / mg protein 0 其詳細的流程如下:

培養 1 X

10⁶ cell / 60mm dish

• 4 hr

置換新培養基，除去未貼壁細胞

•

加入 0.1 mM geniposide

於 0 ， 1, 2, 3, 6 hr 後以 1.5ml Tris-sucrose buffer 刮下 cell 以 homogenizer 將 cell 磨碎

10000 9 離心 20 min

取 0.5ml supernatant 加入

J

work solution [內含 2.0 ml Tris-HCI (0.1 M

,

PH 7.2 )

、 100μI NaN

3

^{、 100μi} 30 mM GSH 、 100μ16mM NADPH 、 100μ151U

glutathione reductase ]

•

充分混合後置於 37 ⁰C 5 min

置入 cuvatte 中，並加入受質

0.1 m17.5 mM H₂

0

2

斗

取 0.05 ml 加入蛋白質定量之

kit 2.5 ml (另取適當濃度之 albumin 當 standard)

•

置活令室溫中 10 min

•

以 spectrophotometer 波長

595 nm 測之

Determine glutathione peroxidase as follows . A per min

"一 μM/min

6.3

{十).去氫棍子甘對過氧化氫酵素的影響:

{τime course effect of geniposide on catalase activities)

Catalase 之測定主要是根據 Aebi ( 1984 )的方法( 38) ，以 H

2

⁰

2 ^為反應物

⁹ 因反應物在反應中會消耗故可藉由他O

2

^{的吸收波長}

(240 nm) 下測定而得，其流程如下:

培養 1

X 10⁶ cell/60 mm dish

• 4 hr

置換新培養基，玲去未貼壁細胞

加入 0.1mM geniposide

•

於 0 ，

1, 2, 3, 6

hr 後以 1

ml 50 mM phosphate

buffer 刮下 cell

以 homogenizer 將 cell 磨碎

方口 A 0.1 ml 7.5 mM H2

0

2

以 spectrophotometer 波長 240 nm scan 2-4 min

Determine catalase as follows

2.303 A1

K(unit)= 翩翩翩…--- 109--

t A2

Where:

t=total time

A1= 最初吸光值

A2= 最終吸光值

參、結果

如 Fig. 3 與 Fig. 4 ，我們可以利用 para司 uat 與 xant~ine I

xanthine oxidase 兩種系統來產生活性氧系，進而造成細胞的損傷會

而從 Table. 1 中會的確在 paraquat ( 5mM )與 xanthine I xanthine oxidase ( 5uM / 0.01 u/ml )分別處理 8 小時與 1 小時皆可以使 LDH 與 ALT 上升 O 在加入 paraquat 與 xanthine / xanthine oxidase 之前如 果先以 geniposide 預先處理 1 小時時，則可以發現 LDH 與 ALT 皆可以有意義的降低，而且都有 dose dependent 的現象 O 閻此

geniposide 不但可以抑制 paraquat 所造成的肝細包毒性實而且對於

xanthine / xanthine oxidase 系統所引起之肝細胞毒性亦有類似的效

果 O

在脂質過氧化實驗方面，我們以脂質過氧化的主要產物之一

malondialdehyde ( MDA )來當成一個指標實結果如 Table.2 所示，

單獨以 paraquat 或 xanthine / xanthine 處理?其肝細胞中 MDA 的 生成量皆會急速升高，但經過 geniposide 預先處理 1 小時刻 MDA 濃 度呈現顯著的降低作用 O

在 DNA repair synthesis 方面?我們用 unscheduled DNA synthesis ( U DS )方法來偵測，結果如下 Table. 3 所示實在 geniposide 預先處理之後實在濃度 0.02 mM 之下可以抑制約 20% 左 右的 DNAdamage 型當濃度升高到 0.1 mM 時則可抑制約 60 0/0 左右 的 DNA damage ，因此 geniposide 亦可以降低活性氧系對於 DNA

的傷害 O

由以上結果可以知道 geniposide 的確可以保護肝細胞兔於活性

氧系的傷害，而為了要了解其可能的機制，我們首先分析了 geniposide 對於 xanthine oxidase ( XO )與超氧陰離子

( superoxide anion . O

2

'-) 的影響，結果如 Table. 4 , geniposide

在濃度高達 1.0 mM 之下對於 xanthine oxidase 的活性與 superoxide anion 亦沒有影響 O

在 DPPH 實驗方面會主17Table. 5 所示， geniposide 在濃度 1 mM

時則可以降低約 60 0/0 的量，故 geniposide 有可能一部份是籍由捕

捉 free radical 來達到降低活性氧系對於肝細胞的傷害，但是對於

superoxide anion 則沒有影響 O 另外對於與會代謝掉活性氧系的抗氧

化酵素方面?我們分析了 glutathione peroxidase 與 catalase 兩種，

如 Fig. 6 , Fig. 7 在所示實在加入 geniposide 處理之後的 0 ， 1 ， 2 ， 3 ， 6 小時分別加以分析 p 結果在肝細胞的 catalase 活性方面在 2 小時時 有顯著的增高 9 而 glutathione peroxidase 活性方面則在 1-3 小時皆 有顯著上升 O 因此藉由對抗氧化酵素的活性提升亦可能是其保護肝細

胞兔於活性氧系的傷害機制之一 O

Table 1 Effect of geniposide on the leakage of lactate dehydrogenase ( lDH ) and alanine dehydrogenase ( Al T ) treated with reactive oxygen species in the rat primary hepatocytes culture

Treatment⁸ lDH AlT

(mU/10⁶ cell) (mU/10⁶ cell)

Normall 92.9 4.5^b 61.5 7.1

PO (5 mM) 138.5 3.9## 102.0 4.1##

GP ( 0.02 mM ) + PO 134.7+0.7 81.2+2.1*

GP ( 0.05 mM ) + PO 125.3 5.4 78.8 3.7*

GP (0.10 mM) + PO 114.6 3^.4* 63.5 4.0**

Normalll 75.3+2.2 60.2+6.6

Xf

XO

^(5μM / 0.01 u/ml )

125.2+5.8辦

90.1+4.9#

GP ( 0.02 mM ) + Xf

XO

^{117.3+6.5 81.5+1.5}

GP ( 0.05 mM ) + Xf

XO

112.1+5.5 78.2+6.8 GP (0.10 mM) + Xf

XO

99.2+3.4* 71.9 3.8*

a. Primary hepatocyte cultures were pretreated with geniposide ( GP ) at various concentrations for 1 hr; then paraquat ( PO ) was added for 8 hr or xanthine/xanthine oxidase ( Xf

XO )

for 1 hr.

The med.ium was prepared for enzyme activity assays.

b. ~ean 士 $P ， values are the average of triplicate determinations.

* P<O.01 ，神 P<O.001 ， compared with normal control group.

中 <0. 肘， **P<O.001, compared with reactive oxygen generating specles group.

Table 2 E仔:ect of geniposide on lipid peroxidation in rat primary hepatocytes induced by reactive oxygen species

Treatment⁸

Normal PO (5 mM)

GP ( 0.02 mM ) + PO GP ( 0.05 mM ) + PO GP (0.10 mM) + PO

XlXO (5μM I 0.01 日Iml)

GP (0.02 mM) + XlXO GP ( 0.05 mM ) + XlXO GP (0.10 mM) + XlXO

MDA

(nmol/mg protein)

4.2 士 0.8

^b

14.2 士 1.8#

11.1

+

1.5

7. 7 士 1. 尸 5.1 士 0.6*

1 7. 5 士 0.9#

16.8 士 1.2

15.3

+

0.6

12.6 士 1.6*

a. Primary hepatocyte cultures were pretreated with geniposide at various concentrations for 1 hr; then paraquat ( PO ) or xanthine/xanthine oxidase ( XlXO ) was added for 1 hr. The cell was prepared for MDA assay.

b. Mean 士 SD ， values are the average of triplicate determinations.

# P<0.001 , compared with normal control.

* P<O. 肘， compared with PO or XlXO treated alone.

Table 3 E仟:ect of geniposide on unscheduled DNA synthesis in rat primary hepatocytes induced by reactive oxygen species

Treatment⁸

cpml μ9

DNA^b % of inhibition^C

Normal 28+4

PQ 74+7

GP ( 0.02 mM ) + PQ 58+10 22

GP ( 0.05 mM ) + PQ 42+5* 43

GP (0.10 mM) + PQ 31 4* 58

Normal 39+4

X1XO 106+6

GP ( 0.02 mM ) + X1XO 88+5 17

GP (0.05 mM) + X1XO 67 5* 37

GP (0.10 mM) + X1XO 46+6* 56

a. Primary hepatocyte cultures were pretreated with hydroxyurea and geniposide ( GP ) at various concentrations for 1 hr; then paraquat ( PQ : 5 mM ) or xanthine I xanthine oxidase ( X1XO : 5μM I 0.01 u/ml ) was added for 2 hr. Thereafter, the medium was changed;

[ methyl-3H ] thymidine (

1μCi

I ml ) was added for 20 hr.

The cells were harvested and Iysed for radioactivity counting and DNA quantitation.

b. DNA damage was determined according to UDS and expressed as cpml μ9 DNA. Mean 土 SD ， values are the average of triplicate determinations. *P<0.01 , compaired with PQ or X1XO treated alone.

C. The effect of GP on PQ or X1XO induced DNA damage was expressed as the fraction of inhibition = [ ( cpml μ9 DNAPQ or X1XO treated alone - cpm I μ9 DNA of geniposide pretreated ) I cpml μ9 DNA PQ or X1XO alone ]

x

100 %

τable 4 Effect of geniposide on xanthine oxidase (XO) and superoxide anion

Conc.

內回、‘SFO沼V〈忱

FTt『頭。趴

WM

ca

Nhw

gurt、

eD

峙，ι

0

、BB'，ι月nH

。此

扣怖

:-i

且，aa‘問HHndM恥叮Hd

mm en

Gur-、

G 0.1 0.5 1.0

1 .49 士。 .01 1 .48 土 0.01

1^.48

+

0.01

1 .4 9 士 O. 的

。.44 士 0.01

0^.44

+

0.01

0 .4 3 士 0.01

0 .43 士 0.01

a. Activity of xanthine oxidase' was evaluated according to the formation of uric acid with a spectrophotometer at 295 nm as described in the text.

b. Geniposide at various concentrations was added;

the e仔'ect on superoxide anion generated from XJXO system was assayed on measuring the absorbance of cytochrome C at 550 nm for 30 min. Each value is the average of duplicates.

Table 5 Quenching effect of geniposide on 1, 1-diphenyl-2-picryl- hydrazyl ( DPPH )

Treatment⁸ absorbance^b DPPH bleaching^C 1%

Control 1.25

+

0.02 0 GP (0.1 mM) 1.15

+

0.03 9.2 GP (1.0 mM) 0.50 士 0.02* 60.1

a. The reaction mixture contained methanol (3 ml), DPPH (10 m帥， 30μ1) and geniposide (GP^, 0.1

輛 1.0 mM ) in DMSO (100μ1). After 30 min at room temperature, it was extracted with toluene and centrifuged. The absorbance of the upper phase was read at 517 nm against blank without geniposide processed as above.

b. Mean

+

SD, values are the average of duplicate determinations. *P<0.001, compared with control.

C. Fraction of DPPH bleaching = [( absorbance of DMSO - absorbance of test ) I absorbance of DMSO]x 100 0/⁰

160

140

120

100

80

60

40

一obphGO 恥。許

20

6

Fig. 6 Time course of geniposide induced GSH 個PX

activity in primary hepatocyte cultures.

Hepatocytes were treated with genipos地 e (GP) at 0.1 m 關 concentration. At indicated time , cells were harvested and homogenized for the determination

ofGSH♂x activity with H

₂

0

₂

as substrate and

expresse揖 as 0/0 of contro

l.

* p<O.的， compared with 0 hr.

5 4

3

Time ( hr)

O 2

160

140

120

100

80

60

40

古拉 zcohc 法

20

5 6 4

3

Time ( hr )

O 2

Time course of geniposide induced catal晶se activity in primary hepatocyte culture

Hepatocyte at 0.1 m 臨 concentration. At induced time ,

cells were harvested and homogenized for the determination of catalase activity by monitoring the reduction qf H

₂

0

₂

and expressed as % of contro

l.

* p<0.01 , compared with 0 hr.

** p<0.05 , compared with 0 hr.

Fig.7

肆、討論

在以前的報告中曾經有研究顯示會 paraquat 在細胞內會先被

NADPH-cytochrome P450 reductase 還原成帶有一個自由基的結構

( 39 ) ，按著很快的會跟氧分子反應而產生超氧陰離子( superoxide

anion) ( 40 )。在這個實驗當中我們利用 paraquat 與 xanthine I

xanthine oxidase 來產生超氧陰離子和其他活性氧，而以前的研究也

指出活性氧系會造成脂質過氧化;甚至會造成染色體的損傷 (35 )。

在這個實驗中 9 我們利馬 LDH 與 ALT 來當作肝細胞毒性的基

本指標， MDA 當作脂質過氧化的指標， UDS 實驗當作基因毒性的

指標 9 結果可以發現， geniposide 不但可以抑制 paraquat 的初代肝

細胞的毒性而且對於 xanthine/xanthine oxidase 所造成的毒性亦有

類似的結果 O

xanthine I xanthine oxídase 系統在以前的研究當中常被當成一種 產生超氧陰離子會氫氧自由基( hydroxy radical )等活性氧系 9 而造 成 DNA 損害 (41 ) 0 從實驗結果中我們發現 geniposide 對於超氧陰 離子與 xanthine oxidase 皆沒有抑制的作用?但對於補捉自由基方面 則有其一定程度的效果 O

在抗氧化酵素方面， catalase 可以將經由 superoxide dismutase ( SOD )代謝產生的 H

2

⁰

2

^{代謝成 H}

2

0 '而 glutathione peroxidase

亦可以將峙。2 代謝成 H

2

0 ，另一方面則亦會代謝掉脂質過氧化所產 生的有毒物質來減輕活性氧系所造成的肝細胞毒性 O 從實驗結果中

Xenobioíics

H₂0

Peroxidase心@GSH

02+H正~--E急一一一SOD

Ca剖1t

仁。

OH. -一-可-帽拍向呵-哺向-向~….嘲叫叫一峭叫叫-輛→詰峙!Iooo Nucleic a 站

/\\~\\

GSH

Peroxidase 主掛 Lipid

@ alcohols

Fig. 8 Proposed mechanism of suppressive e仟éct by geniposide on reactive oxygen species-induced cell damage.

強 catalase 與 glutathione peroxi如峙的活性來達到解毒的目的實另 外 genispoide 亦可能藉由對自由基的捕捉作用來降低活性氧系對細 胞所造成的毒性 O

伍 a 參考文獻

1. Inouye, H., Saìto, S., Taguc俑， H. and Endo ，了 (1969) On the biosynthesis of iridoidglucosides. Te

t.

Let

t.,

28

,

2347-2350.

2. Lai Juong Hshiang. (1976) Pharmacognosy, 378^“3817.

3. 顏混癸 (1989) 原色常用中藥聞主監， 149.

4. Yamauchi, Y., Sakuragi, R., Kwano, S., Inouye,H. (1974) Biological and chemical assay of geniposide, a new laxative in the fruit of Gardenia. Planta Med. , 4, 69-81.

5. Endo, T and Takuchi, H. (1973) Chem. Pharm Bull., 21, 2684.

6. Umetini, Y., Fukui, H. and Toba惚， M (1980) Change in the crocetin and geniposide contents in the developing fruits of Gardenia jasminoides forma grandiflora. Yakugoku Zars側， 100, 920輛924.

7. Miwa, T. (1954) Jpn.J. Pharmacol., 4, 69輛81.

8. Aburada, M., Takeda, S., Shiba徊， Y. and Harada, M. (1978) J.

Pharm. Dynl ， 8 小88.

9. Aburada, M 蜀， Takeda, S., Sadur剖， M., and Harada, M. (1980) Pharmacological studies of gardenia fruits. V. Mechanisms of inhibitory effect of genipin on gastric acid secretion and its facilitatory effect on bile secretion in ra

t.

J. Pharm. Dy侃， 3 ， 423欄

433.

10. Kawa蝠， Y., Hattori, MF., Akao ，莉， kobashi, K., Namba, T. (1991) Formation of nitroogen-containing metabolites from geniposide

11. Aburada ，制.， Sasa俑， H. and Harad品， M. (1976) Pharacological studies of Gardenia fructus. 11. Contribution of the contituent crude drugs to choleretic activity of

“

Inchiko-to" in rats.

Yakugakuzasshi, 96, 147由 153.

12. Harada ，脫 τenmyo ， N., Abura悔， M. and Endo, T. (1974) Pharmacological studies of gardenia fructus. 1. Effect if geniposide and geneipin on the biliary excretion , the gastric juice secretion, and the gastric contration, and other pharmacological actions. Yakugakuzasshi, 94, 157-162.

13. Takeda, S., Yuasa, K., Endo, T. and Aburada ，制. (1980) Pharmacological studies on iridoid compounds. 11. Relationship between structures and choleretic actions of iridoid compound. J.

Pharm ， Dy旺， 3 ， 485咀492.

14. Yamauchi, k., Fujimoto, N., Kfuwano, S., Inouye, H. and Inou, K.

(1976) Planta. Med. , 30, 39-47.

15. lau, F.T.K., Chang, H.M. and Pak, R.C.K. (1986) Asia Pacific J.

Pharmacol., H. and Inoue,K. (1976) 在何ects if Gardenia jasminoides and geniposide on hepatic drug-metabolizing enzyme activities, implications for

r

-naphthylisothiocyanate- induced hepatotoxicity. Planta. Med. 30, 39-47.

16. Wa 峙， S.W., lai, C.Y. and Wang.C.J. (1992) Inhibitory e偏ct of geniposide on aflatoxin B 1 四induced DNA repair synthesis in primary cultured rat hepatocytes. Cancer letters. ,65, 133-137.

17. Wa旬， C. J., Wa峙， S.W. and l泊， J.K. (1991) Suppressive effect of geniiposide on the hepatotoxicity and hepatic DNA binding of aflatoxin B1 in rats. Cancer letters. , 60, 95-102.

benzo[a]pyrene蝸initiated CD刁 mouse skin by geniposide.

Anticancer Research 15 ， 41 小416.

19. Cerutti, P.A. (1985) Prooxidant states an吐 tumor promotion.

Science., 227, 375-380.

20. 自的imer， L.H. (1990) Molecular mechanism of oxygen rádical carcinogeenesis and mutagenesis:τhe role of DNA damage.

Molecular Carcinogenesis. , 3, 188-197.

21. Winterbourn, C.C. (1981) Production of hydroxyl raddicals from paraquat radicals and H₂0_{2 .} FEBS Let

t.

128, 339-342.

22. Sandy, M.S., Moldeus ，戶， Ross,P. and Smith, M.T. (1986) Role of redox cycling and lipid peroxidation in byoyoridyl herbicide cytotoxicity. Biochem. Pharmacol., 35, 3095-3101.

23. Ruch, R.J. and klanning, J. 巳 (1988) Inhibition of mouse hepatocyte intercellular cocmmunication by paraquat刪generated

oxygen free radicals. Toxicology and Applied Pharmacology. , 94, 427-436.

24. Burk, R.F., Lawrence, R.A., Lane, J.M. (1980) Liver necrosis and lipid peroxidation in the rat as the result of para可 uat and diguatadministration. J.Clin.lnves

t.,

65

,

1024-1031.

25. Yasaka ，了， Okudaira, K., Fujito,H. (1986) Further study of lipid peroxidation in human para那.I at poisioning. Arch Ifntern. Med., 146, 681-685.

26. Dasta, J.F. (1978) paraquat poisioning: A reiew. J. Hsop.

Pharm., 35 , 1368司 372.

27. Kuo, C.H., Sheen, I. S., Huang, C.C. e

t.

al. (1988) Liver bio國

chemical tests in para可 uat intoxication. Chang Guang Med. 扎，

11. 160-166.

R.M. (1988) Acute effects of a superoxide radical岫generating

system on ONA double-strand stability in Chinese hamster ovary cells. Mutation Research., 198, 161 司 68.

29. Bonney, V.R., Beck前， J.E., Walker, P.R. and Potter, V.R. (1974) Primary monolayer cultures of adult rat liver parenchymal' cells suitable for study of regulation of enzyme synthesis. In Vitro. , 9, 399-413.

30. Ya餅， K. (1987) Li pid peroxide and human disease. Chem.

Phys. Lipids., 45, 337-351.

31. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram puantities of protien utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. , 72, 248耐254.

32. Hsia, M.T. S., Kreamerand, B.L. and Oola悶， P. (1983) Acute effects of a superoxide radical-generating system on ONA double-strand stability in Chinese hamster ovary cells. Mutation.

Research. , 122, 177-185.

33. Vytasek, R. (1982) A sensitive fluorometric assay for the determination of ONA. Anal. Biochemistry., 120, 243-248.

34. Rob旬， J. and Gryglews划， R.J. (1988) Flavonoids are scavengers of superoxide anion. Pharmacology. , 37(5) , 837閉

841.

35. Sofuni ，了 and Ishidate Jr., M. (1984) Induction of chromosomal aberration in culture Chinese hamster cells in superoxide-gene- rating system. Mutation Research., 140, 27-31.

36. Ursini ，卡， Maiorino, M., Morazzoni ，戶， Roveri, A. and Pifferi, G.

(1994) Free Radical Biology & Medicine, 16(5), 547-553.

glutathione peroxidase. J. Clin. Med. 70, 158-169.

38. Aebi , H. (1984) Catalase 的 vitro. Meth. Enzymol. 105, 121-125.

39. Bus. I.S., Aust, S.D. and Gibson, J.E. (1974) Superoxide and singlet oxygen-catalyzed lipid peroxìdation as a possible mechanism for parauat toxicity. Biochem. Biophys. ⁱ Res.

Commun. 58. 749-755.

的. Talcott; R. 丘， Shu, H. and W剖， E.T. (1979) Dissociation of microsomal oxygen reduction and lipid peroxidation with the electron acceptors, paraquat and menaddione. Biochem.

Pharmacol. 28, 665個671.

吽 1. Breim前， L.H. (1990) Molecular mechanism of oxyxgen radical carcinogenesis and mutagenesis: The role of DNA base damage. Molecular Carcinogenesis 3, 188-197.

第二部分

洛神花成份抗氧化活性之探討

縮寫表

ιBHP ， tert咽butyl hydrop會 roxide

X , xanthine ;

XO , xanthine oxidase ;

臨TT， Thiazolyl blue

LDH , lactate dehydrogenase ; AL T , alanine transaminase ;

輔 DA， r閥割。 ndialdehyde ;

UDS , unscheduled DNA synthesis ;

DPPH , 1 , 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

中文摘要

;各神花為錦葵科( Malvaceae )洛神葵 ( Hibiscus sabçlariffa

linnaeus) 之花，在未成熟時除去子房之等片 O 在台灣則被廣泛的運 用於夏季清涼飲料中 O 在本實驗中第一次提出其成分在抗氧化方面的

石汗究 O

te吋-Butyl hydroperoxide ( t-BHP )是目前被廣泛用來模擬細胞 在處於氧化壓力( oxidative stress )時之情形 O 當我們處理 ιBHP

1.5 mM 峙，能顯著的提高肝細胞去氮氧化酵素( lactate dehydrogenase; LDH )與丙氛酸轉氯酵素( alanine transaminase;

ALT) 而造成細胞毒性 O 對於 t-BHP 所造成的毒性可以被洛神花粗

萃取物( CHCI₃ extract, EtOAC extract )所抑制，而 ιBHP 造成之 脂質過氧化、 DNA 損傷 9 亦可被這二種洛神花粗萃取物抑制 O 另外

研究中也發現洛神花亦可抑制 xanthine oxidase 與捕捉自由基會對

於細胞的解毒系統方面，加入 t-BHP 1.5 mM 30 分鐘之後會明顯清 耗掉 glutathione ( GSH )的量 9 在預先處理洛神花之粗萃取物發現 並無法提升 GSH 的量 O 故;各神花之粗萃取物可能藉由細胞外/內

以捕捉自由基的方式來降低細胞對於遭受氧化壓力時的傷害 9 而非經

由解毒方面系統的途徑 O

在洛神花草離成分方面會我們發現 protocatechuic acid 亦有上 述之效果。此外會在抗氧化酵素方面， protocatechuic acid ( 50 ug/ml )

可以有效的增加 glutathione peroxidase (GSH早x) 活性 O 由此?廣

Abstr晶ct

The flower of

Hibiscus Sabdariffa

l. ( HS ) has been widely used as soft drink in Taiwan. It has been used as a folk remedy for convulsion, hypertension and pyretics. The antioxidant e仟:ects of it were studied and the principles were analyzed in this experiment.

Four compounds were isolated and characterized on the spectroscopies. Three of them were compared with the authentic samples, such as β “sitosterol-β-D-glucoside ( HS耐C2 ), palmitic acid ( HS-E1 ), Protocatechuic acid ( HS翱 E2 ) and the last compound was a new compound.

Te時-butyl hydroperoxide (ιBHP ) induces formation of malondialdehyde ( MDA ), leakage of lactate dehydrogenase ( LDH ) and alanine transaminase ( AL T ) and DNA repair synthesis in rat primary hepatocytes. Hepatocytes with 1.5 mM ( t-BHP ) treated were protected by the C H C 13 extract ( 50, 1 00, 200 ug/r啊 I ) and EtOAC extract ( 100 ug/ml and 200 uglr啊 I ) of HS. The xanthine oxidase ( XO ) inhibition assay and DPPH ( 1, 1-diphenyl-2- picrylhydrazyl ) test were performed to study the antioxident properties of HS. The capacity of quenching DPPH is EtOAC extract

> CHCI₃ extract > residual extract. The ability of XO inhibition is CHCh extract > EtOAC extract > residual extract.

HS咀 E2 ( protocatechuic acid ), a simple phenolic acid decreased the leakage of LDH ( P< 0.05 for 50 ug/ml and P< 0.01 for 100 ug/ml ) and AL T ( P< 0.05 for 50, 100 ug/ml ) and the formation of MDA ( P< 0.01 for 100 ug/ml ) in rat primary

evaluated by UDS ( P< 0.05 for 100 ug/ml, P< 0.01 for 200 ug/ml ).

HS-E2 could activated the activity of glutathione peroxidase ( GSH翩

PX ) in rat hepatocyte culture and quenched free radicals in DPPH test. From these results, it suggested that HS-E2 protects hepatocytes against oxidative stress induced by t-BHP for its ability of quenching free radicals and activating defense enzyme ( GSH- PX ).

壹 a 緒論

-.ì-各神葵的形態與分佈:

1. 名稱:

洛神葵，學名 Híbíscus sabdaríffa Línnaeus， 為錦葵科

( Malvaceae )植物 O 洛神花( Fig. 1 )為洛神葵之花於未成熟 時除去子房之等片 O

{別名] : Rozelle (英)、 Jamaica Sorrel (英)、 Red Sorrel

(英)、 Asam susur (馬)、 Kachieb priew (泰)、紅 角葵(中)( 1 )。

2. 形態:

一年生之木質狀草本灌木 O 株高 1-2 公尺 O 玄淡紫色至紅 紫色且多分歧，被疏粗毛。葉互生，其毛柄(長 4-6 公分)(幼 苗土著為草葉) ，葉片異形，下部葉近卵形，不分裂，長 8-12

公分，上部掌狀 3-5 裂 9 先端尖，長 2-8 公分，寬 5-15 公及世 兩面無毛?背面主動脈具腺體 O 花草生脈出賢先端刺芒狀 O 花

槌長可達 7 公是 9 小芭 8刁 2 枚，基部合生，長 10 公屋，有毛?

等杯形，淡紫色或紅紫色，疏生粗毛及刺 F 粗厚多肉質， 5 裂 9 裂片長 1-2 公分 O 花冠黃色，徑 6-7 公分，中心部分呈紫黑色雪

花瓣 5 片 O 雌雄蕊合體?雄蕊多數?花絲合生會雌蕊自雄蕊、筒

Fig. 1 本實驗所使用之大陸進口洛神花

顆 9 種子如腎形 O 花期夏秋間 O 果期秋冬閱( 1 )。

3. 分佈:

厚、產熱帶地區 O 分佈於印度、馬來西亞，其他東南亞各地

均有栽培 O 台灣最早於 1910 年日本人藤根吉春氏從新加坡引 進 O 其次於 1911 、 1913 、 1914 年亦有報導從夏威夷、菲律賓 再引進 O 今以台東、花蓮等東海岸地區為主產地會中南部亦有栽

培出產 O

二 . ì-各神花的性狀:

本品通常在採集之後曬乾備用，其表面主紫紅色，並略生粗毛 O

鹿子房及花枝均已除去 9 故形狀頗規則 O 全體紙質易撕裂 9 微具特有 之臭味及愉'決之酸味 O 新鮮品嘗黏液質 9 味酸?加熱可搗成果漿狀 O

三 ì各神葵的傳統府途及已知成分:

1. 傳統用途:

洛神葵的藥用部位為花等(肥厚部分)、種子及根部，其中 以花等效果較為顯著 O

(1) .花等(洛神花) :有清熱、解;昌、止咳、降血壓之效，

(2). 種子:有強壯、利尿、輕瀉之效 O (3). 根部:有強壯、輕瀉之效 O

2. 已知成分:

洛神葵之已知成分依其不同部位包括如下:

(此等成分可能會自採集時間、部位、氣候或地點不同而有

其不同之含叢書甚至影響到所含的一些成分會如 Hibiscusic

acid 至自前為止只在墨西哥當地生產之洛神花被分離

出 o )

(1 ).花等:含有一些糖類，如蕉糖、還原糖、失水乳糖

( galactan )、失水戊糖( pentosan )、粒蛋白 質、粗脂肪，另外還含有 Carboxylic acid D(+)-Apfelic acid ( Malic acid; C₄H₆0_S )、

Citronenic acid ( C6H_a07 )、 Protocatechuic

acid 、 Citric acid 、 Malonic acid 、 Hibiscusic

acid 、 Hibiscin ( Anthocyan )及 Flavonoids :

棉花色素 ( Gossypetin )、 Hibiscetin

( C

1s

H 泊。9) 、相皮素( Quercetin )、 Hibiscitrin

( C₂₁ H

20

⁰

14

⁾ 、除此之外尚含有果膠( pectin ) :

內含果膠酸、檸檬酸等( 1 )( 2) ⁰

(2). 種子:含有一些油類以及一些擬蛋白( albuminoid )。

貳 a 洛神花粗萃取物(甜甜甜串串xtr齡梅)之抗 氧化活性分析

、 1 、

一. 耳目言

te件 Butyl Hydroperoxide ( t-BHP ) ，在以前的實驗中已經証實會 在短時間內造成肝細胞中還原態的 glutathione ( GSH )氧化、細胞 脂肪的過氧化( peroxidation )會甚至造成細胞死亡( 3-5 ) 0 其可能 造成細胞毒性的機制如 Fig. 2 ⁰ t-BHP 在細胞內會很快的被

glutathione peroxidase 代謝成 te比butyl alcohol 和 glutathione

disulfide ( GSSG ) ;按著 GSSG 被 glutathione reductase 再氧化回 GSH 而造成 NADPH 的氧化( 6-8 )會進一步影響到鈣離子的平衡 (弘 12 ) ，另外 ιBHP 於金屬離子的存在之下會還原成 ιBHP 自由 暴，而造成細胞糢脂質之過氧化( 13-14 ) ，此自由基或相伴產生的自

由基攻擊細胞內之分子而造成毒性，如 .OH 等小分子產生而攻擊

DNA ( 15 ) ( 29 ) ⁰

洛神花為錦葵科( Malvaceae) ;各神葵之花?於未成熟時去除子 房之等片雪雖然在許多藥書中多指其有解熱、峰血壓、抗痠學、利尿 等功技 9 而今多為夏季清涼飲料或茶品之主要原料之一 O 但在以前的

文獻當中尚無洛神花成分抗氧化活性之研究 O 因此，本研究擬將洛神 花以乙醇初步萃取再以氯仿 (CHCI

3

)、乙酸乙酪 (EtOAC) 萃取會

Interaction with Cellular Molecules

T

Me³⁺

也~社

Membrane

dsγ~ROH

Peroxidation

;

Loss of membrane integrity

Me²⁺

..L ROOH ~ ROH + 2H20 GSH

Peroxidase

2GSH _‘三 ^> GSSG

GSSG Reductase

NADP 〈三 _> NADPH + H+

Altered Ca2+

Homeostasis

Fig. 2 Proposed mechanisms of cell death induced by 胎化butyl

hydroperoxide. Me

=

^metal.