1.實驗動物
實驗動物的來源為國科會與台大之 Wistar 品系大白鼠，
雌雄不拘，動物購得之後進行交配繁衍。幼鼠出生後一至四天連 續給予皮下注射 6OHDA 100mg/Kg/ day，將其溶於 0.1% Ascorbic acid 溶液中，對照組則只給予注射 Ascorbic acid（0.01g Ascorbic acid 溶於 10 ml 的 0.9% normal saline 中），每隻大白鼠每次注射量 不超過 0.1ml，注射完四天後，將動物飼養於動物飼養盒中，光照 週期為 12 小時亮及 12 小時暗，食物與水自由取用。等幼鼠成長 至 25-40 天大之後即可進行實驗。
2.免疫組織化學染色法
（1.）灌流:
首先取得 35 至 40 天大的對照組及實驗組的大白鼠各四 隻，經由腹腔給予過量的 pentobarbital (100mg/Kg) 麻醉，待其麻 醉後將之固定於木板上，使用剪刀將其胸腔皮膚肌肉層剪開後，
再用止血鉗將其胸肋骨移開並固定住，接著將心臟游離出來，再 將 18 號針頭插入左心室，再由右心房以剪刀剪開一小洞，首先先
用幫浦依固定速率灌輸以 0.9% 生理食鹽水，經灌輸約 100 至
200ml 後，再將灌注液換以固定液，固定液成分為 4% glutaraldehyde +0.5% paraformaldehyde【溶於 0.1M 之 PB（phosphate buffer），pH 7.4】。經灌注約 300ml 後，在其頭顱處以刀片將其皮膚肌肉層移 除，再以骨剪將其頭骨移開後，以刀片將其腦組織取出後置放於 4% glutaraldehyde 和 0.5% paraformaldehyde 之固定液中 2 小時 後，以 0.1M PB 洗 3-4 次，再將腦組織於 0.1M PB，4℃過夜。
（2.）切片:
將置放於 PB 中之腦組織取出，用濾紙將其多餘水分吸乾 後，將腦組織固定黏於切片台上，並於切片台中加入 0.1M PB 以 浸潤腦組織，再以震盪切片機將腦組織以冠狀切面方式切成厚度 為 50ìm 之腦組織切片。
（3.）免疫組織染色:
首先以含 0.25% Triton 的 0.01M TBS (Tris buffered saline：0.9% NaCl 溶於 0.05M Tris buffer 中) 洗 3 次，每次 10 分 鐘，Triton 的作用可將細胞膜穿孔以增加抗體進入細胞的穿透度。
接著再將腦組織薄片置於含 3%之山羊血清的 TBS-Triton 中 30 分
鐘，以抑制非專一性的結合。接著再和一級抗體 (mouse anti-rat DBH, Chemicon) 於室溫中反應 2 小時，再於 4℃中反應 16 小時。
之後再以 TBS 洗 3 次，每次 10 分鐘，再以二級抗體 (Goat
Anti-mouse IgG,Vector) 反應 1 小時，TBS 洗 3 次，再以 ABC Elite (Vector) 反應 1 小時，接著以 PBS 洗 2 次每次 10 分鐘，PB 洗 10 分鐘。之後加入 0.009 % H2O2，並以 0.05% DAB (3•3’-diamino- benzidine) in PB 為呈色劑反應 10 分鐘，之後再以 PB 洗 2 次 10 分 鐘即完成染色。
（4.）封片:
將完成免疫染色之腦組織薄片貼於 gelatin-coated 的玻片 上並風乾，之後再以 PB 浸潤數分鐘，接著置於 0.01 % OSO4 (溶於 0.1MPB,pH7.4) 中 10 至 20 秒，再以 PB 洗 3 至 5 分鐘，接著以 50、70、95、100、100% 梯度的酒精中脫水，每次 3 分鐘，於 xylene 中 3 分鐘共 2 次，最後再以 DPX 封片，並於光學顯微鏡下觀察。
(5.) 觀察：
在我們的研究中，我們最主要觀察海馬體中的 CA1、CA3、
DG，以及其他區域如 subcortical 中的正腎上腺素性神經纖維，並
比較在對照組以及實驗組動物之間是否又所差異。
3.電生理實驗
（1.）腦組織切片
首先先將對照或實驗組動物以腦頸椎斷裂的方式人道處 死，之後再以斷頭台將其頭顱取下，所有的實驗步驟皆符合中國 醫藥學院所立的動物實驗人道法規，且在實驗中將盡其所能使得 實驗動物受到最少的痛苦。待將覆蓋頭顱之皮膚肌肉層移除後，
以骨剪剪開其頭骨以暴露其大腦，接著將大腦及部分小腦取出並 迅速將之置放於 4℃之冰冷人工腦脊髓液中【ACSF (artificial
cerebralspinal fluid) 主要成分：NaCl 119 mM、KCl 2.5 mM、CaCl2 2.5 mM、MgSO4 1.3 mM、NaH2PO4 1mM、NaHCO3 26.2mM、glucose 11mM】，以降低其代謝能力並維持其活性，所有 ACSF 皆通以 95%
O2及 5% CO2，之後將腦組織置於以 4℃人工腦脊髓液濕潤之濾紙 上，並將海馬體解剖出來，接著將海馬體固定於瓊酯 (Agar)中，
並將之固定於切片機載台中，切片台中輸以 4℃人工腦脊髓液，接 著以震盪切片機將海馬體切成 450ìm 厚度之切片，切下之組織切 片將之置於室溫中之人工腦脊髓液及空氣之界面中，維持其活性 待一至二小時即可進行實驗。
（2.）紀錄
待切完片之腦組織薄片恢復神經活性後，將腦組織薄片 由 interface slice chamber 中轉置於 submersion type 之 slice chamber 中，並穩定的灌注 30-33℃之 ACSF，液體的流速為 2 ml/min，其 成分和冰冷人工腦脊髓液相同，並以 95% O2 及 5% CO2 混合氣 飽和之，以使其酸鹼值維持在 7.4 及其充足的含氧量。此實驗主要 為觀察興奮性神經的訊息而非抑制性訊息，因此 ACSF 中加入 0.1 mM picrotoxin 以阻斷 GABAA接受體媒介之抑制性訊息。本實驗 以 CA1 為主要研究區域，所以海馬迴腦薄片於紀錄前先將 CA3 至 CA1 連接處以刀片切一刀，以防止因 GABAA接受體阻斷而使 CA3 產生之 epilepticform firing 之現象。接著將填充有 3M NaCl 之玻璃紀錄電極（2-4 MÙ）置於 CA1 之 stratum radiatum 上，以 紀錄細胞外興奮性突觸後電位(field-EPSP：excitatory postsynaptic potential) 之訊號，再於離紀錄電極不遠處置一 (figure 5 的實驗) 或二支 (figure7-21 的實驗) 雙極 (bipolar) 不銹鋼刺激電極以刺 激 Schaffer collateral branch，其刺激之頻率為 0.033HZ，刺激之強 度以能獲得最大之 field EPSP 之 40-50%且無 field spike (細胞放射 動作電位) 為準。我們引發 LTP 的方式為：1. 100HZ 的 è 波
(TBS:theta burst stimulation)：每一個 è 波含有 10 個 bursts，每一個 burst 含 4 個 100HZ 的刺激方形波且間隔 200ms。2. 20HZ：每一次 引發包含 3 個 train，一個 train 包含 40 個 20HZ 的刺激方形波，總 共 120 個刺激方形波。在 LTD 方面，我們使用 1HZ 的刺激波，共 刺激 15 分鐘，總共的刺激為 900 個 pulses。
(3.)實驗數據的取得和分析：
DATA 之擷取方式為將訊號以 CED 1401 (Cambridge
Electronic Design,uk) interface 數位化後，以 CED 公司之 signal 軟 體於個人電腦上呈現並儲存，刺激之頻率、週期、間隔由 Master-8 控制，訊號之最後放大倍率為 1000 倍，為了避免量取 EPSP 的大 小受到動作電位的影響，所以 field-EPSP 之測量方式是以量 EPSP 之起始端斜率大小為準，而 Potentiation 或 Depression 之值為引發 高或低頻率的條件刺激後之最後 10 分鐘的平均斜率值比上基礎刺 激時之平均斜率值之比值，結果以百分比顯示。所有的實驗結果 皆以 mean ± SE（standard error）表示，同一腦組織切片間引發前 後的比值以 paired t test、不同動物組別間之差異以 ANOVA
（Analysis of Variance）test 作統計學上的比較，p＜0.05 有統計學 上的意義。
第五章 實驗結果
動 物 出 生 後 給 予 注 射 6OHDA 會造成海馬體的正腎上腺素神經纖維 受損而不是在次皮質區域
由 於 注 射 6OHDA 對 於 正 腎 上 腺 素 神 經 會 有 所 損 傷 (Blue et al.,1982；Harik et al.,1984)，所以我們使用免疫組織染色 (immunohistochemistry) 的方式來確認 6OHDA 對大白鼠海馬體中 正腎上腺素神經纖維的影響。圖 1-3 中，A 分別代表對照組動物海 馬體之 CA1、CA3 、DG 區域的染色(1A-3A)，在對照組中我們可 以在海馬體中的這些區域中看到有 DBH 的免疫反應，假設應是 NE 纖維（1A-3A 圖中箭頭所指處）;然而這些有 DBH 免疫反應的 神 經 纖 維 卻 無 法 在 實 驗 組 (1B-3B) 中 看 到 。 此 外 在 次 皮 質 (subcortical)區域中如視丘、下視丘、腦幹等區域，對於施打 6OHDA 卻沒有顯著影響（圖 4A、B），這些結果和先前報導相似 (Harik et al.,1984)。
6OHDA 處理後之動物其 LTP 無法被維持而不是 LTD
接著我們觀察在施打 6OHDA 後其對海馬體 CA1 突觸可 塑性的影響為何?首先我們以 100HZ、20HZ 及 1HZ 三種不同頻率 之條件刺激來觀察在不同動物組別中其對於 bidirectional synaptic plasticity 之表現有何差異? 於對照動物組的 hippocampal slices 中，以 100HZ 及 20HZ 的高頻率刺激可在 CA1 突觸引發 LTP，並 且 LTP 可以維持至 30 分鐘以上。在 100HZ 的條件刺激中 (圖 5A, 實心圓圈)，fEPSP slope 被提升至原來的 150.97±17.50% (n=12)，
而在 20HZ 組中 (圖 5B,實心圓圈) 為 131.19±13.66% (n=10)。相對 地在 1HZ 的條件刺激中 (圖 5C, 實心圓圈)，經過 30 分鐘後其突 觸 傳 導 效 能 卻 是 降 低 的 ， 其 效 能 降 低 至 原 本 之 77.47±13.66%
(n=10)。然而在 6OHDA lesion 的 hippocampal slices 中，雖然在 100HZ 及 20HZ 的刺激之後，fEPSP 的 slope 有顯著增加，但是在 短期間內 (大約 10-15 分鐘內)，其 EPSP 的大小卻下降至和原來條 件刺激前相近，在 100HZ 組中 （圖 5A,空心圓圈）其引發後的 EPSP 值和引發前比較結果為 100.93±8.91%，20HZ 組（圖 5B,空 心圓圈） 為 97.15±8.78%，可是在 1HZ 引發之 LTD 中，6OHDA lesion slices 其 LTD 的引發和表現皆和對照組一致（72.23±5.79%, n=10, 圖 5C, 空心圓圈），由此可知，施打 6OHDA 會對其 LTP 的 維持有所影響，然而對 LTD 卻是沒有差異的。由以上不同頻率之
刺激所得到之不同的 fEPSP slope 的值，我們可以將結果畫成如圖 6 之關係圖，在圖 6 中我們可以觀察到，在對照組動物中，θm的 值約為 5-10HZ，但是在 6OHDA 的 slices 中，θm的值被提升至約 70-80HZ，由此可知施打 6OHDA 可以改變θm的值。
在 6OHDA 注射所引起突觸可塑性不正常是由正腎上腺素所主導而 不是多巴胺
假設如果施打 6OHDA 所引起的正腎上腺素性神經纖維 破壞會對於海馬體 CA1 突觸可塑性造成影響，則以 bath application 的方式加入正腎上腺素應可恢復其原本之功能。為了證實這個假 設，我們進行以下實驗。圖 7A 為一實驗進行流程，該實驗使用 6OHDA lesion 的 hippocampal slices 。首先在 CA1 之 stratum radiatum 位置放置一記錄電極，如之前之實驗一般，之後在記錄電 極的兩邊放置兩支刺激電極，之後每隔 15 秒交替的經由兩支刺激 電極刺激兩群獨立的 Schaffer collateral branches fibers 以在 CA1 細 胞引發 fEPSP (圖 7A)。如此就個別的電極而言，其刺激頻率仍然 維持在每 30 秒刺激一次。在經由交替刺激兩個獨立的 Schaffer collateral branches fiber 而獲得穩定的 fEPSP 之後 (圖 7B)，隨即在
其中一個 pathway (稱為 pathway 1) 給予 TBS 的高頻率刺激 (圖 7B, 實心圓圈) ，同時並關閉另一 pathway (稱為 pathway 2) 的刺 激 ， 以 避 免 在 另 一 pathway 引 發 association LTP (Bliss and Collingridge, 1993) ， 之 後 回 復 原 來 的 實 驗 狀 況 。 此 時 可 看 到 pathway1 的 fEPSP 在 TBS 之後有被增加，但隨即降低至與 baseline 一樣的大小。反之 pathway2 則不受干擾 (圖 7B, 空心圓圈)。
pathway 1 在 TBS 之後無法有效的引發 LTP 的結果，再度證實之 前的實驗結果。在給予 pathway 1 TBS 30 分鐘之後，即在 pathway 2 給予 TBS，同時關閉 pathway 1 的刺激，此外在給予 pathway 2TBS 之前 10 分鐘可以 bath application 的方式加入 20ìM 的 NE 20 分鐘 (圖 7B)，結果可看到 LTP 可以在 pathway 2 成功的引發，並維持 30 分鐘之久 (圖 7B, 實心圓圈)。此外 pathway 1 的 fEPSP 並不受 任何影響；這些結果證實了 NE 的補充確實可以重建 6OHDA-lesion slices 之 CA1 突觸 LTP，此外也證實了 LTP 有 pathway specificity 的特性 (Bliss and Collingridge 1993)。相同的實驗重複了 8 次，其 結果總結在圖 8B：在圖 8B 中，以給予 TBS 的時間為基點 (t=0)，
pathway 1 在 TBS 之後無法有效的引發 LTP 的結果，再度證實之 前的實驗結果。在給予 pathway 1 TBS 30 分鐘之後，即在 pathway 2 給予 TBS，同時關閉 pathway 1 的刺激，此外在給予 pathway 2TBS 之前 10 分鐘可以 bath application 的方式加入 20ìM 的 NE 20 分鐘 (圖 7B)，結果可看到 LTP 可以在 pathway 2 成功的引發，並維持 30 分鐘之久 (圖 7B, 實心圓圈)。此外 pathway 1 的 fEPSP 並不受 任何影響；這些結果證實了 NE 的補充確實可以重建 6OHDA-lesion slices 之 CA1 突觸 LTP，此外也證實了 LTP 有 pathway specificity 的特性 (Bliss and Collingridge 1993)。相同的實驗重複了 8 次，其 結果總結在圖 8B：在圖 8B 中，以給予 TBS 的時間為基點 (t=0)，