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(1) 在無菌操作台內進行活化菌株的操作，首先，取 0.1 ml 的菌體 懸浮液液滴入 LB 帄盤培養基的邊緣，以四區劃線法接種於帄盤培 養基。
(2) 將已接種的 LB 帄盤培養基置入培養溫度 37 ℃的恆溫培養箱中 培養。
圖八、四區劃線法
(3) 挑取單一菌落置入配製 100 ml 已滅完菌的 LB 培養基中，以培 養溫度 37 ℃、180 rpm 的恆溫培養條件培養，以分光光度計波長 600 nm，菌液經 10 倍稀釋後 OD 吸收值為 0.25 備用。
(二) 搖瓶試驗
(1) 觀察 B. subtilis 生長曲線
為尋求 B. subtilis 菌株的生長曲線，以助於液態發酵的發酵時間 掌握，於是，以接種環在活化後的 LB 帄盤培養基取單一菌落，置
菌液
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入已滅菌含 100 ml LB 培養基的三角搖瓶中，以 37 ℃、180 rpm 的 發酵條件進行培養，每間隔 4 hr 取樣，以分光光度計波長 600 nm 測量 OD 吸收值變化，同時以 LB 帄盤培養基培養每一階段取樣計 數樣品的菌數生長。
(2)菌種培養
將滅完菌備用的 100 ml LB 培養基，接種 0.5 ml 已活化菌液，以 37 ℃、180 rpm 的發酵條件進行培養，測量菌液經 10 倍稀釋後 OD 吸收值為 0.25。
(三) 液態發酵
配製 6 瓶 500 ml LB 培養基於 1 liter 三角搖瓶中調整 pH 7.0±0.1，
置入滅菌釜以 121 ℃、25 min 進行滅菌處理後，分別接種 2.5 ml OD 吸收值介於 0.25~0.27 的菌液，以 37 ℃、180 rpm 的發酵條件進行培 養，分別在發酵 2 hr、4 hr、8 hr、16 hr、24 hr、28 hr 取樣使用低溫 高速離心機或低溫超高速離心機進行離心。
(四) 離心、沉澱
將發酵液在 4 ℃環境下以 12,000 ×g 低溫高速離心機低溫離心 30 min 或 22,000 ×g 低溫超高速離心機離心 20 min 後收集上清液，以 6 N HCL 調整上清液 pH 4.0±0.1 後，將上清液以 3 倍體積的乙醇在 4 ℃
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狀況下進行沉澱 24 hr。
(五) 再離心、回溶
(1) 最後，將沉澱後的溶液以約 5,000 ×g 低溫高速離心機在 4 ℃環 境下離心 10 min 後，收集 γ-聚谷胺酸沉澱物。
(2) 將收集的 γ-聚谷胺酸沉澱物，以 10 倍的二次水回溶，並將其 水溶液冷凍於-20 ℃備用。
(3) 將二次水回溶的 γ-聚谷胺酸粗萃液進行水解。
(4) 把水解後 γ-聚谷胺酸樣品，以 SDS-PAGE 初步觀察 γ-聚谷胺酸 的存在，並以蛋白質定量法測定γ-聚谷胺酸的含量變化。
(六) 固態發酵 (1) 原料前處理
稱取 100 g 屏東萬丹種植紅豆高雄九號或黃豆以 RO 水預泡 2 hr，
倒掉 RO 水，使用滅菌釜(121 ℃、30 min)進行蒸煮，待冷卻後即可 接種。
(2) 選擇菌種接種量
將活化後的菌液分別接種 1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml 到已 滅完菌的黃豆或紅豆發酵基底，並觀察白色黏液的生成變化。
(3) 隨時間的增加白色膜生成變化
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將 OD 吸收值為 0.25 的菌液接種 2.5 ml 於前處理好的黃豆或紅 豆發酵基底進行發酵，設定恆溫培養箱發酵溫度為 37 ℃、每間隔 時間 6 hr 觀察黃豆或紅豆表面白色膜生成的情形。
(七) 抽氣過濾
加入 500 ml 的二次水於發酵完成的黃豆納豆或紅豆納豆中，將容 器置入超音波震盪器時間設定 10 min，使之均勻混合後，黃豆或紅豆 納豆倒入鋪有 2 號濾紙的布氏漏斗中並起動抽氣過濾系統，將發酵液 與固態黃豆納豆或紅豆納豆顆粒分開，收集濾液(此為第一次洗滌的 濾液)進行離心，將過濾後的固態黃豆納豆或紅豆納豆重複(七)步驟，
收集第二次洗滌的濾液進行離心。
(八) 離心、沉澱
將濾液在 4 ℃環境下以 12,000 ×g 低溫高速離心機離心 30 min 或 22,000 ×g 低溫超高速離心機離心 20 min 後收集上清液，以 6 N HCL 調整上清液 pH 4±0.1 後，將上清液以 3 倍體積的乙醇在 4 ℃狀況下 進行沉澱 24 hr。
(九) 再離心、回溶
(1) 最後，將沉澱後的溶液以約 5,000 ×g 低溫高速離心機在 4 ℃環 境下離心 10 min 後，收集 γ-聚谷胺酸沉澱物。
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(2) 將收集的 γ-聚谷胺酸沉澱物，以 10 倍的二次水回溶，並將其 水溶液冷凍於-20 ℃備用。
(3) 把以二次水回溶的 γ-聚谷胺酸粗萃物進行水解。
(十) 水解
(1) 把 γ-聚谷胺酸粗萃物和 6 N 鹽酸以 1:1 混合。
(2) 油浴 110 ℃分別在 2 hr、4 hr、6 hr、8 hr、10 hr 取樣。
(3) 將水解後 γ-聚谷胺酸樣品調整 pH 7±0.1，取 100 μl 水解樣品以 SDS-PAGE，初步觀察 γ-聚谷胺酸的含量。另外，取 5 ml 水解樣品 做衍生化。
(十一) SDS-PAGE (1) 表三、溶液配製 5 % Stacking Gel
Stacking Gel 5 ml
二次水 3.2 ml 1.5 M Tris-HCL( pH 6.8) 1.25 ml
10 % SDS 50 μl 10 % APS 50 μl 40 % acrylamide 0.5 ml TEMED 5 μl
12 % Resolving Gel
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(4) 退染液
Coomassic Blue 2.5 g Methanol 450 ml Acetic acid 100 ml 二次水 450 ml 將試藥攪拌溶解後，置於室溫備用。
(5) 注膠
(a) 先將 2 片玻璃清洗乾淨拭乾，固定在膠台上，加入二次水靜 置測試是否有滲漏，將二次水倒掉，用濾紙吸去水份。
(b) 依配方配製下膠，混合均勻後，注入已架好的玻璃片膠台中 直到八分滿，加入二次水把下膠壓帄，待下膠凝固後吸乾多餘的
二次水。
(c) 依配方配製上膠，混合均勻。將上膠注入玻璃片中至全滿，
放入齒梳待上膠凝固。
(d) 將注好膠的玻璃片從製膠台取下，架設電泳槽裝置，取下齒 梳並在電泳槽中注入 Running Buffer。
(6) 樣品處理
(a) 取 15 μl Sample+6 x Sample Buffer 3 μl，放入預熱 100 ℃沸水 中加熱 5 min。
(b) 取 15 μl(a)Sample，注入到上膠的孔洞中。
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(c) 設定電壓 100 V，電泳時間 2.5 hr。
(d) 關閉電泳槽電源，取下模組及玻璃，切下上膠，保留下 膠將下膠膠片取出，放入染色盤中。
(e) 加入染色液，放在振盪器搖動 10 -15 min。
(f) 倒去染色液，加入脫色液，再放在振盪器上搖動 10-15 min。
更換脫色液，持續以上步驟直到清晰可見目標蛋白為止。
(十二) 衍生化 衍生化操作步驟:
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(十三) γ-聚谷胺酸含量測定 試劑配製
(1) 衍生試劑配製:
(a) 2 mol/L NaOH (b) 6 mol/L HCL (c) 0.5 mol/L NaH2CO3
(d) 0.1 mol/L 磷酸緩衝液 (e) 6 mol/L 谷胺酸標準品
(f) 配製 10 mmol/L 的 FDNB 溶液 (2) 配製標準溶液:
精秤谷胺酸標準品 3 g 於 50 ml 定量瓶中，定量至 50 ml。
(a) 流動相 A(3.6 g NaAc，溶於 500 ml 的蒸餾水中，調製 pＨ6.4 (b) 流動相 B(乙腈和水 1:1)
(3) 樣品製備:
用 2 mol/L NaOH 中和樣品水解液至中性，取 0.1 ml 置於 1.5 ml 離心管中，加入 0.5 mol/L 碳酸氫鈉溶液 0.1 ml、含 10 mmol/L 的 FDNB 的乙腈水溶液 0.1 ml，置入 60 ℃水浴鍋避光水浴 1 hr，待冷 卻到室溫。加入 6 mol/L 磷酸緩衝溶液 0.35 ml，過 0.45 μm 濾膜過 濾，取 10 μl 進行檢測。
(4) 分析條件:
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(a) 管柱: Mightysil PR-18 GP 250-4.6 (5 μm)；流動相 B 梯度沖提 程序: 0~6 min，16 %；6~12 min，16 %~24 %；12~15 min， 24 %~30 %。
(b) 流動相流速:1.0 ml/min；波長:360 nm；樣品量:10 μl。
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