(一) 原理:
高效液相層析是指一種色譜分離技術，以液體為流動相而設計的一 種液相色譜儀，高效液相層析儀大致區分成 4 個部分高壓輸液裝置、
進料系統、分離系統和檢測系統。它常被使用在分離混合物，是利用 其分析管柱與分析物之間的一種非共價性質的相互作用力將混合物 進行分離，待檢測樣品在不同時間被注入分析管柱中，通過壓力在固 定相中移動，依待檢測樣品的不同與固定相的作用力不同，依序離開 分析管柱而被區分開，確認每個不同成份的比例。
圖七、HPLC 示意圖。(益宏儀器教育訓練資料)
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(二) 高壓輸液泵
高壓輸液泵是液相層析儀的一重要部件，它將流動相注入到柱系統，
使樣品在層析柱中完成分離過程。其性能的好壞直接影響到儀器的穩 定性和分析結果的可靠性。用於分析目的的泵應具備以下幾項性能:
輸出壓力高，最高壓力要求在 35~50 MPa；流量範圍在 0.01~10 ml/min，
流量穩定，輸出流量精密度應為±1 %以內，壓力波動小，更換溶劑方 便，要能耐酸、鹼和緩衝液的腐蝕並能耐各種有機溶劑。
(三) 分離系統(層析柱和恆溫烘箱) (1) 流動相
在液相層析中，流動相它有兩個作用，一是携帶樣品前進，二是 給樣品一個分配相。藉由改變流動相的性質和組成，可使欲分離成 分得到滿意的分離和適當的容量因子，這是選擇合適的液相層析系 統的重要環節。液相層析中流動相通常使用有機溶劑、水、緩衝溶 液等。所以，對於流動溶劑應具備幾項要求。 (a) 化學穩定性佳(b) 與偵測器相適應(c) 黏度小(d) 能溶解樣品且浸潤固定相(e) 純度 高。
(2) 固定相
層析柱是決定分離好壞的 HPLC 的最重要部件，層析柱是由柱管 和固定相組成。一般為內部不繡鋼管，形狀為直型，5~30 cm 即可
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滿足分離的需要。層析柱的內徑 4~6 mm，6 mm 以上的柱主要使用 於半製備或製備柱，填料粒徑為 5 或 10 μm。因為層析柱價格較高 應注意使用時要防止污染，防止壓力突變，保存前要用純有機溶劑 清洗要防止含水流動相滋生細菌堵塞管子。溫度會影響層析柱的分 離效率。提高柱溫能提高樣品的溶解度，降低流動相的黏度改善分 離，恆溫箱用以使層析柱在恆溫條件下工作，一般柱溫應低於流動 相溶劑的沸點，以免產生氣泡。
(三) 檢測系統
偵檢器應具備幾項要求:靈敏度高、線性範圍寬、回應快、穩定性 好、溫度變化不敏感、對洗提劑組成的變化不敏感，以便用於梯度洗 脫、不破壞試樣以便取得純的分離成份。由於液相層析的特點是流動 相與被檢物的許多物理性質相近。紫外線吸收和紫外-可見分光光度 偵檢器是在液相層析最為廣泛的偵檢器。它包括單波長式、多波長式 及紫外-可見分光式。它是屬於選擇性偵檢器，只能用於能吸收紫外-可見光或經由衍生化反應使其能生成紫外-可見光的物質。後者實質 上是一個帶流通池的的紫外-可見分光光度計作液相層析的偵檢器。
對於固定的池體積，在一定的波長下，成份的吸收度正比於其濃度。
一般選擇待測成份的最大吸收波長處進行偵測，流動相溶劑在所選的 波長下不能有強的吸收。
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