第二章 文獻回顧
2.3 粒線體
2.3.2 以粒線體為標靶之奈米藥物載體文獻回顧
近兩年來以粒線體為標靶之藥物載體整理如Table 2 所示。這些奈米藥物載體 大部分是採用修飾lipophilic cation 的方法來 targeting 粒線體。其中最為傑出者是 Shanta Dhar 這名學者。雖然她投入這個領域的時間不久，但是對於一些以粒線體 為標靶之奈米藥物載體是否真的達成他所宣稱的效果，Shanta Dhar 的證據是最具 說服力的。在她2012 年發表在 PNAS 的文章中，她以分離粒線體並以質譜儀分析 奈米藥物載體攜帶的重金屬元素，做為評估標靶粒線體功效的方法。75她以PLGA 修飾TPP 作為 model，建立了一個具有不同大小以及不同電性的奈米粒子 library。
並發現奈米粒子大小越小，正電荷越多，越容易分布在粒線體。75這個結論並沒有 甚麼新奇之處，但是她是少數提供準確定量數據支持的人，如果看表中列出的其 他例子，許多人仍用定性的方法證明他們的奈米藥物載體有抵達粒線體，其實並 不是很嚴謹。
以電子穿透顯微鏡鑑定的證據，很難量化作為定量的數據，只能證明有少數 以粒線體為標靶的奈米藥物有在粒線體中。而將粒線體分離出來以電子穿透顯微 鏡鑑定，更有artifact 之虞，因為分離粒線體的過程會有離心的步驟，無法排除細 胞質中奈米粒子一起離下來的可能性。
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Author (*)
Material Size Zeta (mV)
Incubation time Methods to
assess MT
23
2.4 研究動機
目前的新藥開發以及現有藥物多面臨到藥物動力學不佳以及副作用過強等問 題而中止臨床研究或是在使用上有疑慮，但透過奈米藥物載體來攜帶上述的藥物，
有機會改善這些問題。以奈米藥物載體攜帶藥物有許多優點：1)奈米藥物載體可以
透過enhanced permeability and retention effect (EPR effect)使抗癌藥物累積在腫瘤，
降低對正常組織及器官的副作用。2)可以使疏水性藥物均勻的分散在生物系統中， 覆金奈米粒子(phospholipid capped gold nanoparticles, PLGNP)表面，使其成為以粒 線體為標靶之奈米粒子；並利用金奈米粒子可以透過感應耦合質譜儀(ICP-MS)準 確量化的特點，來評估我們的修飾方法是否可以使奈米粒子有效地進入到粒線體。
若ICP-MS 測得的數據證明 PLGNP-TPP 可以有效地進入到粒線體，則此修飾策略 將可應用到其他不同種類的奈米藥物載體上，並且PLGNP-TPP 也有機會成為研究 奈米粒子與粒線體功能等基本研究的重要工具。
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第三章 實驗藥品與儀器
3.1 實驗藥品
Table 1：實驗藥品表單
藥品名稱, 縮寫 分子式/縮寫 製造廠商
Acrylamide/Bis solution MDBio
(Qingdao, China)
Ammonium persulfate APS Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) Bolvine Serum Albumin BSA Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO, USA) Dimethyl Sulfoxide DMSO Fisher Chemic
EDTA-Trypsin Gibco
Fetal Bovine Serum FBS Gibco
Glutamine Glycine Dulbecco’s minimum essential medium SMEM Hyclone
N,N,N’N’-Tetra-methylethylenediamine TEMED Bio-Rad Penicillin/streptomycin PS Biosource
(Camarillo, MD, USA) Thiazolyl blue tetrazolium bromide MTT Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO, USA)
Tris-base Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO, USA)
Tween 20 Sigma-Aldrich
(St. Louis,
25
MO, USA) 1,2-Dipalmitoyl-sn—3-phosphatidylcholine DPPC Avanti Polar
Lipid
Dimethylformamide DMF J.T. Baker
(Phillipsburg, NJ, USA) Hydrogen tetrachloroaurate (III) HAuCl4 Alfa Aesar
(Ward Hill, MA, USA)
Sodium citrate Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO, USA)
Sodium chloride NaCl Merck
(Whitehouse Station, NJ, USA)
Sodium dodecyl sulfate SDS Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)
1-Dodecanethiol 1-DT Fluka
(St. Louis, MO, USA)
Hydrochloric acid HCl Riedel deHaen
(Seelze, Germany)
Nitric acid HNO3 Fluka
(St. Louis, MO, USA)
26 Potassium phosphate dibasic K2HPO4 Riedel deHaen
(Seelze, Germany) Potassium phosphate monobasic KH2PO4 J.T. Baker
(Phillipsburg, NJ, USA)
Triethylamine TEA Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO, USA) Dicyclohexylcarbodiimide DCC Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO, USA) N-Hydroxysuccinimide NHS Thermo Fisher
Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)
(3-Carboxypropyl)triphenylphosphonium bromide CTPP Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, USA)
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VWR scientific producnts, Aquasonic 75D
(NY, USA) 動態光散射儀
(Dynamic light scattering, DLS)
Malvern Nano ZS (Worcestershire, UK) 高速離心機
(High speed centrifuge)
Hermle Z 36 HK (Wehingen, Germany) 冷凍乾燥機
(Freeze dryer)
Thermo Electron Corporation Modulyod-115 (MA, USA) UV/vis 吸收光譜儀
Varian Cary Eclipse (Palo, VIC, Australia) 微孔盤分析儀
A-549 Human lung carcinoma BCRC No.60074
(Hsinchu, Taiwan)
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第四章 製備方法與鑑定
4.1 DSPE-PEG2000-TPP conjugate 合成
Reagents 1 mL triethylamine/chloroform, 13.4 mg DCC (64.5 mmol) 和 7.5 mg NHS (64.5 mmol)，室溫下攪拌 2hr。
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夾住 (一邊夾兩個可確保夾緊避免在 dialysis 的過程中掉落)。量筒 內置入600 mL 以上 ddH2O，4oC 避光兩天，並定期換水。
6. Dialysate 凍乾後放-20oC 備用。
7. 以 NMR 鑑定 TPP 是否有接上 DSPE-PEG2000-amine。
圖 九：DSPE-PEG2000-TPP 合成步驟流程圖
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4.2 金奈米粒子製備
20 nm 金奈米粒子的合成是參考並修改自 Natan 等人的實驗步驟82。合成前所 有玻璃器皿都需要以王水(3:1 HCl/HNO3)潤洗後再用大量去離子水以及二次水洗 淨，避免重金屬汙染影響金奈米粒子之合成。詳細步驟如下：
1. 取一 25 mL 圓底瓶，自 HAuCl4 stock 溶液中取適量加水稀釋至體積 20 mL，濃 度1.71 mM。
2. 取 40 mg sodium citrate，以 1 mL 二次水溶解後備用
3. HAu Cl4溶液水浴加熱至95oC 並加入攪拌子攪拌，快速加入步驟 2 中的 sodium citrate 水溶液。
4. 此時可觀察到混和後的溶液先是黃色慢慢變澄清，隨後變黑，再變成酒紅色。
顏色製酒紅色時繼續反應15 min。
5. 移開水浴，金奈米粒子溶液繼續攪拌至冷卻。
6. 取 1mL 金奈米粒子溶液加到 Eppendorf 中，以 7000 rpm (約 3000 g) 離心 20 min，
去除上清液，加入0.7 mL DMF 回溶金奈米粒子。合成後的金奈米粒子若要進 行lipid capping，需要在一天內將溶劑置換成 DMF 保存，否則 lipid capping 容 易失敗。
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4.3 脂質包覆之金奈米粒子之製備
脂質包覆脂金奈米粒子的製備是參考實驗室先前的方法，並依據實驗的需要
作修改83。相較於先前的脂質包覆金奈米粒子，本論文中使用的脂質配方多了
DSPE-PEG2000-TPP 以及 DPPE- PEG2000，分別作為標靶粒線體以及對照組之用。合 成的步驟如下：
1. 所有 lipid 以及 1-DT 放在 70oC 水浴備用。
2. 從上述 4.2 之 stock solution 中取 350 mL 金奈米粒子溶液加入 Eppendorf 中，
70oC 水浴。
3. 在金奈米粒子溶液中加入 40 μL DPPC (5mg/mL)及 120 μL DSPE-PEG2000-TPP 或 DPPE-PEG2000 (1mg/mL)，等 5 min。
4. 加入 25 μL 1-DT (625 μM, in DMF)至金奈米粒子溶液中，70oC 水浴 1hr。
5. 加入 642 μL 二次水(約 DMF 之 1.2 倍體積)，改變環境極性使 lipid 自組裝 上金奈米粒子，70oC 反應 1hr。
6. 取出 Eppendorf，冷卻至室溫。
7. 以 12000 rpm (約 7000g 左右) 離心 20 min，去上清液。以二次水回溶金奈 米粒子。重複此步驟至少三次以上以去除未自組裝到金奈米粒子的脂質及 其他反應物。本論文稱合成完之脂質包覆金奈米粒子為PLGNP-TPP 或 PLGNP-PEG (對照組)。
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8. 參考 Thaxtan 等人在 2013 年 PNAS 的作法，以原始 bare gold nanoparticle 的吸光值估計脂質包覆金奈米粒子的濃度84。測量PLGNP-TPP/PEG 之吸 收光譜，取吸收光譜的峰值並以Beer’s law:
A = εbc A：吸光值
ε：莫耳消光係數 (cm-1M-1) b：樣品光徑長度 (cm) c：樣品濃度 (M)
換算PLGNP-TPP/PEG 之濃度。消光係數 εpeak = 8.48×108 (cm-1M-1)，是參 考Mirkin 等人在 2006 年發表的數據85。
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4.3. 細胞實驗
人類肺腺癌細胞株是培養在添加了10% FBS 及 1% penicillin/streptomycin 的 DMEM 培養液中，在 5% CO2，37oC 環境下培養。每兩天繼代一次，繼代時的細 胞約八到九分滿，即細胞與細胞外的在視野下的面積約1:1 至 2:1。
4.3.1 細胞存活率測試
在餵藥的前一天，將A549 細胞種 96-well plate 以 10000 cell/well，100 μL/well 的條件培養24 hr。實驗當天先將 PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的PLGNP/medium，依實驗需求共培養不同的時間。共培養時 間結束後，先將medium 吸出，加入 50 μL PBS 潤洗兩次，洗去殘留之 PLGNP；
此步驟要非常小心以免傷害細胞。加入100 μL 與 MTT reagent 預混好之 medium 進行MTT viability test。反應完成後移除 medium，加入 150 μL DMSO 在 shaker 上搖晃約15 min，轉速以 DMSO 不濺出為準。以 ELISA reader 測 570 吸光值，以 各時間之control 組別之吸光值為存活率 100% 對各實驗數值 normalized 作圖。
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4.3.2 偵測細胞內 ATP 含量
在餵藥的前一天，將A549 細胞種 96-well plate 以 10000 cell/well，100 μL/well 的條件培養24 hr。實驗當天先將 PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的PLGNP/medium，培養 12hr。共培養時間結束後，先將 medium 吸出，加入50 μL PBS 潤洗兩次，洗去殘留之 PLGNP。ATP 之偵測是使用
PerkinElmer ATPliteTM 這個產品及所附的 protocol。這是一種利用 Luciferase 再有 氧氣、ATP、substrate D-Luciferin 及催化劑 Mg2+ 時會產生螢光的反應來偵測ATP。
首先加入50 μL cell lysis solution 使 ATP 可以通過細胞膜到膜外；再加入 50 μL substrate solution。反應完成以 plate reader 讀取螢光值，並用產品所附之 ATP 標準 品製成之檢量線得到ATP 之莫爾數。
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4.3.3 粒線體膜電位之觀測
在餵藥的前一天，將A549 細胞種 24-well plate 以 50000 cell/well，500 μL/well 的條件培養24 hr。實驗當天先將 PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的PLGNP/medium，培養 12hr。共培養時間結束後，先將 medium 吸出，加入50 μL PBS 潤洗兩次，洗去殘留之 PLGNP。粒線體膜電位之偵測是使 用Guava Technologies 的產品 Guava® EasyCyte™ MitoPotential™ Kit，參考 protocol 的指示使用。將 kit 中所附的 JC-1 dye 以新鮮的 medium 稀釋加入 well 中，
共培養30 min 後洗去 dye，以 PBS 潤洗兩次後在螢光顯微鏡下觀察。
4.3.4 細胞內酸性胞器染色
在餵藥的前一天，將A549 細胞種 24-well plate 以 50000 cell/well，500 μL/well 的條件培養24 hr。實驗當天先將 PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的PLGNP/medium，培養 12hr。共培養時間結束後，先將 medium 吸出，加入50 μL PBS 潤洗兩次，洗去殘留之 PLGNP。將 Acridine orange 以新鮮 的medium 稀釋至 3 μg/mL，染色 15 min 後移除 dye 並以 PBS 潤洗兩次。在螢光 顯微鏡下觀察細胞內的酸性胞器。
36 trypsin 處理，待細胞與培養盤的表面分離後，加入含血清的 medium 中指 trypsin 的反應，並離心分離細胞。
2. 去除上清液並以 PBS 使細胞重新懸浮，再離心一次，這樣可以去除先前步驟 中的serum 以及 trypsin。
3. 加入 100 μL RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer; 150 mM sodium chloride, 1.0% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH8.0) 及蛋白酶抑制劑(Sodium orthovanadate, 1mM; Leupeptin, 20 μg/mL; PMSF, 100 μg/mL)。RIPA buffer 可用於萃取 whole cell lysate、membrane bound protein、Nuclear protein 及 mitocondrial protein 等，適用於本研究要分析 的所有蛋白質。
4. 在 4oC 下 sonicate 15 min，再以 4oC，12000 rpm 離心 30 min，核酸以及細胞碎 片會在Eppendorf 底部形成膠狀沉澱，而上清液即為 whole cell lysate。Lysate 可再-20oC 保存，但依蛋白質特性會有不同的保存時間，如果要測量易降解的 蛋白質表現，如膜蛋白等，lysate 不能久放。最好馬上或一兩天內做完。
5. 取 3 μL 之 lysate 以二次水稀釋至 30 μL，以 Coomassie brilliant blue G250 定量 蛋白質濃度。定量以BSA 為標準品並參考廠商提供之步驟進行。
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蛋白質膠體電泳的部分，是要上面萃取出的蛋白質以膠體電泳方法按照分子量 大小分離。其步驟如下：
1. 將 cell lysate 和 5x loading dye (DTT 77 μg/mL; SDS 0.1 g/mL; Tris-base 0.5M, pH6.8; 50% Glycerol; 0.0015% Bromophenol Blue)混合並以 70oC 加熱 10 min (或 是100oC 5min)，加熱完後將樣品至於-20oC 冰箱快速冷卻，使用前離心使壁上 樣品離下。這步驟將蛋白質降解，使其成為一級結構。加熱溫度的選擇是依蛋
白質的需求根據廠商的建議做調整，因為LC-3 是膜蛋白，使用較低的溫度可
以避免膜蛋白變性聚集。
2. 鑄膠。依據下列表格配置 12%的 separation gel 以及 stacking gel：
12% separating gel (5mL) Stacking gel(1mL)
H
2O
1.6 mLH
2O
0.7 mL3. 將 running buffer (Tris-Base, 3g/L; Glycine, 14.4g/L; SDS, 1g/L)加入電泳槽外槽 及內槽中，再把步驟一和loading dye 反應完的蛋白質樣品根據實驗設計加到各
3. 將 running buffer (Tris-Base, 3g/L; Glycine, 14.4g/L; SDS, 1g/L)加入電泳槽外槽 及內槽中，再把步驟一和loading dye 反應完的蛋白質樣品根據實驗設計加到各