開發以粒線體為標靶之奈米藥物載體

國立臺灣大學生命科學院生化科技學系暨研究所 碩士論文

Department of Biochemical Science and Technology College of Life Science

National Taiwan University Master Thesis

開發以粒線體為標靶之奈米藥物載體

Development of nano drug carriers targeting mitochondria

翁松翎

Wong, Song-Ling

指導教授：何佳安 博士 Advisor：Ja-an Annie Ho, Ph.D.

中華民國 103 年 7 月

July 2014

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謝誌

這篇謝誌獻給所有在這兩年中幫助過我的人，我必須很慚愧地說，沒有各位 的協助，我什麼也做不到。尤其感謝何老師，我想我可能是最讓老師操心過的學 生，沒有之一。老師寫給我的信，傳給我的簡訊我都一一留著，雖然老師曾經罵 我罵得兇，但也是想盡辦法找人找資源，幫助我完成我的實驗，有這樣的指導教 授是一件幸福的事。

再來感謝芳如學姊及您的老公小高學長在實驗上的幫忙，感謝楊老師和芝宇 之前合成材料給我，感謝師丈吳老師常常給我意見，感謝徐老師在討論中給了我 許多有用的建議，感謝莊老師偶爾來實驗室順便關心我。您們真的幫了我很多忙，

要感謝的太多，就謝謝天讓我有機會遇見您們。

這裡要單獨一段特別感謝阿嬌和雅茹學姊，在實驗上，在我低落的時候，你 們真的是把我的事當作自己的事在幫忙，回想起來幸虧有你們的幫忙與建議，我 才能突破關卡繼續前進，否則現在還困在那裏。

最後感謝上面沒有提到，但同樣重要的實驗室的大家，你們是我兩年生活中 重要的組成，就在我身邊和我一起做實驗吃飯聊天，很多美好的回憶是和你們有 關的。以下依想到的順序列出：英風學長、念祖學長、廷洋學長、韋晴學姊，可 樂、卡布、多芬、Luby、雨萱、JuJu、衍邦、亭宇、婉玲、介甫、睿霖、嘉慶、智 雯、意琪、靜瑩、宜廷、Mandy、 亞葳，謝謝你們充實了我碩班生活的每一刻。

謝謝大家，我能有這本論文離不開你們的幫忙。

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中文摘要

近年來，以粒線體為標的開發抗癌藥物成為新一代癌症治療的重要研究方向。

粒線體是細胞的能量以及死亡的調控中心，且腫瘤細胞粒線體的功能普遍異常，

因此針對腫瘤細胞和正常細胞在代謝以及死亡調控上的顯著差異尋找標的，是重 要的新藥發展策略。目前已經有多種以粒線體為標靶的藥物進入到臨床試驗階 段。

以奈米藥物載體攜帶抗癌藥物有下列優點：1)奈米藥物載體可以透過 enhanced permeability and retention effect (EPR effect)使抗癌藥物累積在腫瘤，降低對正常組

織及器官的副作用；2)可以使疏水性藥物均勻的分散在生物系統中，避免因使用助

溶劑造成的副作用；3)可以在載體上做各種修飾增加不同功能(ex: targeting, imaging)，而不用改變藥物的分子結構。基於上述奈米藥物載體的優點，及以癌細 胞粒線體為標靶之化學治療策略的發展，開發能有效運送藥物至粒線體之藥物載 體有其必要性。

在本研究中，我們利用修飾有triphenylphosphonium (TPP)分子之磷脂質來包 覆金奈米粒子(phospholipid capped gold nanoparticles, PLGNP)表面，使其成為以粒 線體為標靶之奈米粒子；並利用金奈米粒子可以透過感應耦合質譜儀(ICP-MS)準 確量化的特點，來評估我們的修飾方法是否可以使奈米粒子有效地進入到粒線體。

通過合成方法的最佳化，目前已經合成出適合用來做細胞實驗的PLGNP-TPP。下 一步將會使癌細胞與PLGNP-TPP 共培養後，分離出粒線體並用 ICP-MS 評估其進 入到粒線體的效率。若ICP-MS 測得的數據證明 PLGNP-TPP 可以有效地進入到粒 線體，則此修飾策略將可應用到其他不同種類的奈米藥物載體上，並且PLGNP-TPP 也有機會成為研究奈米粒子與粒線體功能等基本研究的重要工具。

本研究也嘗試利用有無粒線體標靶分子修飾之PLGNP 來闡明金奈米粒子對粒

線體功能的影響。在細胞存活率試驗(MTT assay)發現 PLGNP-TPP 會影響 A549 肺

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癌細胞的存活率，進一步測試和粒線體活性有關的指標，發現細胞中的ATP level 下降，並有粒線體膜電位失常等現象。細胞中針對粒線體受損有一套處理的機制，

受損的粒線體會被細胞自噬清除以維持細胞內整體粒線體的正常功能。觀察細胞 自噬的marker ，即 microtubule-associated protein 1light chain 3 的表現後我們發現，

與PLGNP-TPP 共培養後的細胞有活化細胞自噬的現象。初步的結果顯示

PLGNP-TPP 會造成細胞中粒線體的受損，並開啟細胞中修復粒線體受損的機制。

詳細的過程還需要更進一步研究，以判斷PLGNP-TPP 或是其他以粒線體為標靶的 奈米藥物載體在使用上需注意的事項或是所需要的改良。

關鍵詞：奈米藥物載體、粒線體、藥物傳遞、金奈米粒子

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Abstract

In recent years, targeting mitochondria as a therapeutic target has become an emerging strategy in cancer treatment. Mitochondria are often referred to as a central hub for responses to cellular stress and cell injury; in addition, the well-established functions of mitochondria in energy supply/storage and apoptosis provide novel targets for tumor cell suicide. Therefore the alterations in cancer cells that protect cell from apoptosis can be utilized to inhibit proliferation of cancer cell. Furthermore, strategies of re-programming in cancer cells with metabolic differences from their normal counterparts may lead to alternative therapeutic approaches. Currently there are several drug candidates that are attempted to use in targeting mitochondria are in cancer clinical trials.

Nanodrugs are known to offer several key features, including: (i) site-directing nanodrug can be found to accumulate intensively in tumor site by enhanced permeability and retention effect (EPR effect), avoiding or minimizing side effects to the normal tissue; (ii) improved pharmacokinetic profile for drugs with poor solubility;

(iii) versatility of nanodrugs (can be designed to obtain mutli-functions, including imaging, hyperthermia, stimuli-controlled release). Considering the great potential offered by mitochondrially-targeted nanodrugs, the development of a reliable mitochondria-targeted nanocarrier is desirable.

In this study, the unique characteristics of triphenylphosphonium (TPP) was exploited to design a mitochondrial targeting nanodrug. It was achieved by developing a facile synthetic strategy to conjugate this mitochondria-targeted moiety onto the phospholipid layer of the gold nanoparticles functionalized with phospholipids

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(TPP-PLGNPs). In vitro experimental results confirmed that our TPP-PLGNPs exerted inhibitory effects on the proliferation of lung cancer A549 cells, which was likely due to the malfunction of mitochondria caused by our mitochondria-targeted TPP-PLGNPs.

Parallel studies were conducted to investigate the safety of non-TPP modified PEG-PLGNPs. Further the cellular adenosine triphosphate (ATP) levels was measured, and lower ATP level was observed in TPP-PLGNP treated group, as compared to the control group treated by PEG-PLGNP. Consistently, the mitochondria membrane potential was altered in the PLGNP-TPP treated group. It was well understood that a repairing system that deals with mitochondria damage, including digesting damaged mitochondria by autophagy, exists in mammalian cells. The modification of an autophagy marker, microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3), was thus monitored in this study. It was found that the PLGNP-TPP treated group seemed to trigger autophagy. Detailed mechanism will be thoroughly investigated. In summary, our preliminary results validated that, PLGNP-TPP induced mitochondria damage in A549 cancer cells, and autophagy was also activated. Further investigation is required to evaluate the targeting efficiency and biosafety of PLGNP-TPP in vitro and in vivo.

Key word: nano drug carrier, mitochondria, drug delivery, gold nanoparticles

vi

目錄

謝誌 ... i

中文摘要 ... ii

Abstract ... iv

圖目錄 ... viii

表目錄 ... x

第一章 緒論 ... 1

第二章 文獻回顧 ... 3

2.1 藥物動力學 ... 3

2.2 奈米藥物載體 ... 5

2.2.1 奈米藥物載體的發展現況 ... 8

2.3 粒線體 ... 11

2.3.1 粒線體與癌症 ... 17

2.3.2 以粒線體為標靶之奈米藥物載體文獻回顧 ... 21

2.4 結語 ... 23

第三章 實驗藥品與儀器 ... 24

3.1 實驗藥品 (Chemicals and reagents) ... 24

3.2 實驗儀器 (Apparatus) ... 27

3.3 癌細胞株 (Cancer cell lines) ... 27

第四章 製備方法與鑑定 ... 28

4.1 DSPE-PEG₂₀₀₀-TPP conjugate 合成 ... 28

4.2 金奈米粒子製備 ... 30

4.3 脂質包覆之金奈米粒子之製備 ... 31

4.3. 細胞實驗 ... 33

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4.3.1 細胞存活率測試 ... 33

4.3.2 偵測細胞內 ATP 含量 ... 34

4.3.3 粒線體膜電位之觀測 ... 35

4.3.4 細胞內酸性胞器染色 ... 35

4.3.5 西方點墨法 ... 36

第五章 結果與討論 ... 40

5.1 DSPE-PEG₂₀₀₀-TPP conjugate 合成與鑑定 ... 40

5.2 脂質包覆之金奈米粒子之製備與鑑定 ... 42

5.3 脂質包覆之金奈米粒子之穩定性測試 ... 47

5.4 PLGNP-TPP 造成細胞存活率下降 ... 49

5.5 PLGNP-TPP 造成細胞內 ATP 含量下降... 51

5.6 粒線體膜電位之觀測 ... 53

5.7 PLGNP-TPP 活化細胞自噬 ... 55

5.8 結論與未來展望 ... 57

參考文獻 ... 58

viii

圖目錄

圖 一：典型的藥物在血液中之濃度對給藥後時間作圖 (a) 三種不同的給藥方式，(b)理想的緩釋型

藥劑。¹ ... 4

圖 二：EPR effect 示意圖，奈米藥物載體透過主動及被動 targeting 專一性的作用在腫瘤部位²⁹ ... 7

圖 三：奈米藥物載體的發展示意圖 ... 10

圖 四：粒線體研究統計資料 ... 12

圖 五：呼吸作用示意圖，圖中包含醣解作用的產生的 pyruvate 如何代謝成 Acetyl-CoA 進到檸檬酸 循環；並且檸檬酸循環產生的NADH 在電子傳遞鏈中的 complex I 中氧化成 NAD⁺，提供源源不絕 的電子不斷往下傳遞，電子最終在complex IV 中由氧氣接收變成水。電子傳遞鏈的過程不斷產生 電動勢，推動complex V 合成 ATP。⁶⁶ ... 15

圖 六：細胞凋亡示意圖⁷⁰... 16

圖 七：以粒線體為標靶之抗癌藥物舉例⁶⁸ ... 19

圖 八：粒線體標靶分子⁷⁴... 20

圖 九：DSPE-PEG2000-TPP 合成步驟流程圖 ... 29

圖 十：DSPE-PEG2000-TPP conjugate NMR 鑑定 ... 41

圖 十一：最佳化 PLGNP 合成過程中 DMF：Water 比例與 TPP lipid 添加量 ... 44

圖 十二：(a)PLGNP-PEG 之吸收光譜；(b)PLGNP-TPP 之吸收光譜 ... 45

圖 十三：(a)PLGNP-PEG 以 DLS 量測 zeta potential 結果；(b) PLGNP-TPP 以 DLS 量測 zeta potential 結果 ... 46

圖 十四：以模擬生物環境及 cell culture medium 的 buffer 測試 PLGNP-PEG 及 PLGNP-TPP 的穩定 性 ... 48

圖 十五：A549 肺癌腫瘤細胞與 PLGNP-TPP 共培養後對其細胞存活率作圖 ... 50

圖 十六：與 PLGNP-TPP 共培養後細胞內 ATP level 偵測 ... 52

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圖 十七：JC-1 結構式⁹² ... 53 圖 十八：以 JC-1 染色觀察與 PLGNP 共培養的 A549 細胞粒線體受損 ... 54 圖 十九：PLGNP-TPP 活化細胞自噬(a)酸性胞器染色結果，(b)細胞自噬 maker LC3 western blot 結 果 ... 56

x

表目錄

Table 1：奈米藥物載體改善傳統藥物的缺點² ... 6

Table 2：近兩年以粒線體為標靶之奈米藥物載體整理 ... 22

Table 3：實驗藥品表單 ... 24

Table 4：實驗儀器表單 ... 27

Table 5：實驗細胞株表單 ... 27

1

第一章 緒論

目前的新藥開發以及現有藥物多面臨到藥物動力學不佳以及副作用過強等問 題，因而中止臨床研究或是在使用上有疑慮²；例如根據2003 年的統計，目前新 發展出的藥物有40 %是屬於疏水性藥物³，可能面臨藥物動力學不佳而中止臨床實 驗。而doxorubicin 及 paclitaxol 等常見的抗癌藥物皆對人體有一定的副作用。但透 過奈米藥物載體來攜帶上述的藥物，有機會改善這些問題。以奈米藥物載體攜帶 藥物有許多優點：1)奈米藥物載體可以透過 enhanced permeability and retention effect (EPR effect)使抗癌藥物累積在腫瘤，降低對正常組織及器官的副作用。奈米 材料之大小可以穿過腫瘤周圍較為鬆散的微血管管壁，進而在腫瘤部位造成局部 藥物濃度的上升，使奈米級的藥物傳遞系統具有被動靶向性(passive targeting)。2) 可以使疏水性藥物均勻的分散在生物系統中，避免因使用助溶劑造成的副作用；

3)可以在載體上做各種修飾增加不同功能(ex: targeting, imaging)，而不用改變藥物 的分子結構。

近年來，以粒線體為標的開發抗癌藥物成為新一代癌症治療的重要研究方向。

粒線體是細胞的能量以及死亡的調控中心，且腫瘤細胞粒線體的功能普遍異常，

因此針對腫瘤細胞和正常細胞在代謝以及死亡調控上的顯著差異尋找標的，是重 要的新藥發展策略。目前已經有多種以粒線體為標靶的藥物進入到臨床試驗階段。

基於上述奈米藥物載體的優點，及以癌細胞粒線體為標靶之化學治療策略的發展，

開發能有效運送藥物至粒線體之藥物載體有其必要性。

在本研究中，我們利用修飾有triphenylphosphonium (TPP)分子之磷脂質來包 覆金奈米粒子(phospholipid capped gold nanoparticles, PLGNP)表面，使其成為以粒 線體為標靶之奈米粒子；並利用金奈米粒子可以透過感應耦合質譜儀(ICP-MS)準

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確量化的特點，來評估我們的修飾方法是否可以使奈米粒子有效地進入到粒線體。

若ICP-MS 測得的數據證明 PLGNP-TPP 可以有效地進入到粒線體，此修飾策略 將可應用到其他不同種類的奈米藥物載體上，並且PLGNP-TPP 也有機會成為研 究奈米粒子與粒線體功能等基本研究的重要工具。

3

第二章 文獻回顧

2.1 藥物動力學

藥物動力學幫助我們了解施藥之後，藥物的濃度在血液中能否保持在一個合 適的範圍以達到療效。因此藥物動力學會研究藥物在體內的吸收、分布、代謝、

及排泄，並以此為依據作為給藥的參考。臨床一期的研究除了了解藥物的安全性 之外，還要建立該藥物的藥物動力學資訊，以評估是否要繼續進行臨床研究以及 依據其藥物動力學的特性制定臨床二期的給藥計畫⁴。

一個典型的血藥濃度與時間的關係如圖一所示，口服藥，肌肉注射，靜脈注 射有不同的作用時間。靜脈注射最快，肌肉注射次之，最後是口服。如果藥物的 使用有急迫性，如急救等情況，會使用靜脈注射來給藥。較不急迫的情況，則考 慮肌肉注射或口服來降低副作用以及增加藥物作用時間等目的。一個理想的血藥 濃度會希望藥物的濃度保持在有效濃度以上，造成毒性的濃度以下，如圖一(b)中 的理想緩釋型藥物所示。

輝瑞的科學家曾經統計通過臨床一期的口服藥物特性，希望通過分析這些藥 物的物化性質來得到其與藥物溶解度以及滲透性(permeability, 通過細胞膜等屏障 的能力)的相關性，作為新藥篩選的參考。⁵以下是作者的結論，有下列特性的藥物 可能因為溶解度以及滲透性不佳導致不能通過臨床一期藥物動力學以及生物分布 (biodistribution)的測試：

1. 含有五個以上 H-bond donors 。 2. 分子量超過 500。

3. Log P 大於 5。

4. 超過十個 H-bond receptors。

可以提供或接受氫鍵的基團太多會使得藥物分子不容易通過細胞膜以及腸胃道，

4

分子量太大以及Log P (辛醇-水分配係數)太大都代表水溶性不佳，比較難抵達藥物 在身體裡作用的位置；因此口服藥物需要有合適的親疏水性才會有較好的藥物動 力學。這個規則並不是絕對的，比如一些抗生素可以透過細胞膜上的transporter

運輸，就不在此限。⁵一些過於疏水的藥物只能搭配助溶並以劑靜脈注射的方式給

藥，如抗癌藥物紫杉醇與他的助溶劑Cremophor EL。這樣使用的缺點是助溶劑多 少會有副作用，有安全性的疑慮。

由於現行藥物常碰到的藥物動力學問題，新的藥物傳遞科技如奈米藥物傳遞 系統應運而生。奈米藥物傳遞系統不但可以改善這些問題，還有諸多其他優點，

並且已經有獲得臨床許可的產品上市。²

(a)

(b)

圖 一：典型的藥物在血液中之濃度對給藥後時間作圖 (a) 三種不同的給 藥方式，(b)理想的緩釋型藥劑。¹

5

2.2 奈米藥物載體

以奈米藥物載體攜帶藥物基本上可以有下列優勢：1) 增加藥物的生物可利用 性，即避免藥物在到達作用位置前，就被分解或是與其他分子產生化學反應失去 活性；2)增加疏水藥物的 solubility/suspensibility；3)透過對組織、器官或腫瘤的專 一性減少對身體其他正常組織或器官的副作用；4)增加 circulation time；5)可以在 載體上做各種修飾增加不同功能(ex: targeting, imaging)，而不用改變藥物的分子結

構；6)可以一次輸送不同的藥物而不用擔心不同藥物對血球蛋白的親和力是否影響

藥物動力學。^{2, 6} Table 1 是 Prof. Allen 對奈米藥物載體優點的整理(表中的 DDS 是 drug delivery system 的縮寫，但其實討論的只有奈米藥物載體)。

理想的奈米藥物載體大小應在10-200 nm 之間，大於 10 nm 可以避免藥物載體 被腎臟快速的排出體外⁷，小於200 nm 則可以避免免疫系統的攻擊增加 circulation time⁸。此外，這個大小還能透過enhanced permeability and retention effect (EPR effect) 使抗癌藥物累積在腫瘤，降低對正常組織及器官的副作用。奈米材料之大小可以 穿過腫瘤周圍較為鬆散的微血管壁，進而在腫瘤部位造成局部藥物濃度的上升，

使奈米級的藥物傳遞系統具有被動靶向性(passive targeting)。這個現象最初由 Matsumura 和 Maeda 兩位在 1986 年發表⁹，隨後被認為和腫瘤周圍的血管新生有 關。腫瘤組織周圍旺盛的血管新生現象幫助腫瘤獲得許多養分以及氧氣供給腫瘤 細胞快速的生長^10-12，同時也造成腫瘤組織附近的血管壁較正常血管壁鬆散¹³。因 此相較傳統藥物，奈米藥物載體只能穿透鬆散血管壁如腫瘤組織附近而不能夠自 由穿透正常的血管壁，因此累積在腫瘤周圍，達到標靶腫瘤部位的效果。奈米藥 物載體運用EPR effect 的粒子有許多，包含微脂體¹⁴、micelles^15-22、dendrimers^{23, 24}、 poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles (PLGA nanoparticles)^{25, 26}、hybrid

nanoparticles²⁷等等。

6

Problem Implication Effect of DDS

Poor solubility A convenient pharmaceutical format is difficult to achieve, as hydrophobic drugs may precipitate in aqueous media. Toxicities are associated with the use of excipients such as

Cremphor (the solubilizer for paclitaxel in Taxol).

DDS such as lipid micelles or liposomes provide both hydrophilic and hydrophobic environments, enhancing drug solubility.

Tissue damage on extravasation

Inadvertent extravasation of cytotoxic drugs leads to tissue damage, e.g., tissue necrosis with free doxorubicin.

Regulated drug release from the DDS can reduce or eliminate tissue damage on accidental extravasation.

Rapid breakdown of the drug in vivo

Loss of activity of the drug follows administration, e.g., loss of activity of camptothecins at physiological pH.

DDS protects the drug from premature degradation and functions as a sustained release system. Lower doses of drug are required.

Unfavorable pharmacokinetics

Drug is cleared too rapidly, by the kidney, for example, requiring high doses or continuous infusion.

DDS can substantially alter the PK of the drug and reduce clearance. Rapid renal clearance of small molecules is avoided.

Poor biodistribution Drugs that have widespread distribution in the body can affect normal tissues, resulting in

dose-limiting side effects, such as the cardiac toxicity of doxorubicin.

The particulate nature of DDS lowers the volume of distribution and helps to reduce side effects in sensitive, nontarget tissues.

Lack of selectivity for target tissues

Distribution of the drug to normal tissues leads to side effects that restrict the amount of drug that can be administered. Low concentrations of drugs in target tissues will result in suboptimal therapeutic effects.

DDS can increase drug

concentrations in diseased tissues such as tumors by the EPR effect. Ligand-mediated targeting of the DDS can further improve drug specificity.

表 一：奈米藥物載體改善傳統藥物的缺點²

7

圖 二：EPR effect 示意圖，奈米藥物載體透過主動及被動 targeting 專一性的作用 在腫瘤部位²⁸

8

2.2.1 奈米藥物載體的發展現況

早期的奈米藥物載體研究現已有核准上市的產品，如1995 年美國食品藥物管

理局(FDA)核准的微脂體製劑 DOXIL、2005 年 FDA 核准的白蛋白作為藥物載體的 Abraxane 以及韓國食品藥物管理局核准的 PLGA nanoparticles Genexool-PM。這些

產品都能有效的降低傳統上使用這些藥物帶來的副作用。例如DOXIL 攜帶的

doxorubicin，原先對心血管有嚴重的副作用，因此在使用的劑量上必須審慎考慮；

但以微脂體包裹後，可以明顯降低其對心血管的副作用，並增加藥物的circulation half-life 以及療效。

Abraxane 是第二種核准上市的奈米藥物載體，以白蛋白(albumin)結合抗癌藥 物紫杉醇(paclitaxel)。與傳統使用助溶劑 Cremophor EL (Taxol)的製劑比較，

Abraxane 在乳癌後期的病人有明顯較好的效果。²⁹除此之外，Abraxane 不使用助 溶劑，減輕了來自助溶劑Cremophor EL 的副作用。Genexol-PM 也是基於相同的 理由發展的，但使用的是不同的奈米藥物載體，PLGA nanoparticle。這項產品已經

在韓國、加拿大、澳洲等地上市，並已經在美國進行臨床二期的試驗。²⁹

具有主動標靶(active targeting)功能的奈米藥物載體被稱為是第二代的奈米藥 物載體。這些載體靠著ligand-receptor recognition 使奈米藥物載體被腫瘤細胞外大 量表現的receptor 給辨識，促使奈米藥物載體透過 receptor-mediated endocytosis 有 選擇性的進入腫瘤細胞。這些ligand 包含：folate^30-34、transferrin^35-37、epidermal growth factor^{38, 39}、RGD peptide^40-42或是antibody⁴³。這些具有主動標靶功能的藥物載體，

目前大多在臨床一期或二期。²⁹

更新一代的奈米藥物載體，利用奈米載體本身的可塑性，給予載體本身各式 各樣的功能，使藥物不只有治療的一種用途，更可以結合光學顯影^44-53、電腦斷層

掃描^{47, 54-56}、X-ray 顯影⁵⁵、超音波顯影^{57, 58}、核磁共振造影^{45, 59-64}達成theranositc

9

的作用，在治療同時評估療效結果。⁶⁵另還有結合光熱治療、光動力治療、放射線 治療等等的應用，展現了奈米藥物載體的未來的可能性。⁶⁵

10

圖 三：奈米藥物載體的發展示意圖

11

2.3 粒線體

粒線體會和能量供應，細胞凋亡、生育能力、老化、性、體溫恆定、疾病有 關。⁶⁶這是一個具有雙層膜以及自己的遺傳物質的胞器，是細胞呼吸作用的所在地 以及細胞凋亡發起的中心。它是細胞內能量供應的核心，也是氧化壓力的主要來 源，是一個非常重要的胞器，而非常重要也意味著和許多人類的疾病有關。粒線 體的功能缺失分先天以及後天。先天的粒腺體缺失可能造成嬰兒猝死、生長遲緩、

肌肉失去協調、視力或聽力問題、學習障礙、心血管疾病、身體重要臟器如肝腎 等器官的問題以及呼吸困難。⁶⁷後天的粒腺體缺失和老化、癌症、心血管疾病、神 經退化性疾病相關。⁶⁷粒線體和許多生命現象息息相關，也反映在學術界對粒腺體 研究的投入上。自從發現粒腺體和細胞凋亡相關後開始，近二十年來和粒腺體有 關的論文發表持續增長，就2013 年而言，在論文資料庫 SCOPUS 中就有九千篇左 右(請見圖四)。

12

圖 四：粒線體研究統計資料

13

雖然粒線體是如此重要，但是它的研究相對於另外一個重要的領域，即分子 生物學來說，是困難重重。粒線體首先在十九世紀末被發現，一開始被認為是一 種和細胞共生的細菌，之後隨著對呼吸作用的研究，才知道粒線體是細胞的能量 工廠。德國科學家Wabburg 發現細胞中會和氧反應的酵素。他從細胞中分離出其 中的呼吸酶(respiratory ferment)，後來命名為細胞色素氧化酶(cytochrome c oxidase)，

發現其會進行氧化還原作用並在沒辦法大量純化的情況下，以巧妙的方法定出呼 吸酶的光譜。⁶⁷Wabburg 也因為對呼吸作用機制的貢獻而獲得 1931 年的諾貝爾生 醫獎。但隨後關於粒線體與呼吸作用的研究陷入了瓶頸。雖然Kerin、Kreb 等人紛 紛解出呼吸作用的重要元件，諸如細胞色素及檸檬酸循環等⁶⁷，但是在這過程當中 能量是如何儲存，而不是像燃燒一樣把能量全部釋放？一開始科學家認為呼吸作

用中有一種高能的中間產物，由他把能量傳給ATP，但這項中間產物從來沒有被

分離出來過。這個問題困擾了整個研究呼吸作用的人三十年。直到1960 年左右才 由米歇爾提出化學滲透假說，引起無數同行的反駁與質疑，最後隨著支持的證據 一一出現，化學滲透假說最後得到同行的認可，米歇爾並在1978 年獲得諾貝化學 獎，並且是唯一的受獎人。⁶⁷自此粒線體與呼吸作用的人密面紗被才被揭開，請見 圖五。最後沃克因為解出使用離子推動力製造ATP 的 ATPase 結構，獲頒一九九 七年的諾貝爾化學獎。⁶⁷

粒線體是細胞的死亡控制中心，細胞凋亡的控制中樞。不論是內因性、外因 性，caspase dependent 或是 caspase independent 的細胞調亡，其核心的凋亡機制都 牽涉到粒線體內的蛋白質。細胞凋亡一開始被研究變態的學者發現，因為線蟲發 育的研究聲名大噪，也和癌化的進程有關，但直到1995 年才知道控制這些計畫性 死亡的竟然是粒線體，而不是細胞核。1995 科學家發現粒腺體的膜電位去極化後 出現含氧自由基大量生成，然後細胞走向凋亡。^{68, 69}這些發現是內生性細胞凋亡的

14

重要表現，抑制他們會延緩細胞凋亡。⁶⁹在失去粒線體膜電位之後，細胞色素c 和 其他蛋白質從粒線體是放到細胞質內，活化細胞內的蛋白酶分解細胞。細胞凋亡 的示意圖請見圖六。

15

圖 五：呼吸作用示意圖，圖中包含醣解作用產生的 pyruvate 如何代謝成 Acetyl-CoA 進到檸檬酸循環；並且檸檬酸循環產生的NADH 在電子傳遞鏈中的 complex I 中氧 化成NAD⁺，提供源源不絕的電子不斷往下傳遞，電子最終在complex IV 中由氧 氣接收變成水。電子傳遞鏈的過程不斷產生電動勢，推動complex V 合成 ATP。⁶⁶

16

圖 六：細胞凋亡示意圖⁷⁰

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2.3.1 粒線體與癌症

因為粒線體在能量代謝上以及細胞死亡扮演的重要角色，它的受損會和老化、

癌症、心血管疾病、神經退化性疾病相關。目前已知粒線體受損的主因來自於它 自身產生的氧化壓力。粒線體中進行的呼吸作用需要電子傳遞鏈上每個元件精密 的配合，如果有些步驟速度變慢，電子就可能會滲漏出來形成自由基。自由基會

去攻擊粒線體的DNA、蛋白質、磷脂質等等。而其中粒線體的遺傳物質並非像核

內的DNA 一樣受到良好的保護，直接暴露在自由基的攻擊之下。現在懷疑腫瘤細

胞的粒線體可能有某種程度的突變影響癌細胞的代謝，也有許多的證據支持這樣 的假設。⁶⁶

大約七十年前，Warburg 發現癌細胞在能量的產生上與正常細胞非常不同。在 有氧氣的情況下，癌細胞仍會進行大量的無氧呼吸，這個現象被稱作Warburg effect。

66, 71雖然有少部分腫瘤細胞例外，但是其已經被應用在癌症的診斷上，利用具有同

位素的葡萄糖類似物作為顯影劑，以正子造影偵測其累積的腫瘤部位。⁷²後續研究 Warburg effect 的學者發現，有些與呼吸作用有關的 mtDNA 則有突變的情形(如 Succinate dehydrogenase、fumarate hydratase 等檸檬酸循環中的酵素 )。⁶⁶在癌細胞 的糖解作用方面，糖解作用第一步將葡萄糖磷酸化的蛋白hexokinase II 被發現在癌 細胞中會過量表現並結合在粒線體上，並與一些控制細胞凋亡的粒線體膜蛋白結 合，可能具有抑制細胞凋亡的效果。⁷³

18

2.3.1.1 以粒線體為標靶之藥物發展

基於粒線體在癌症中的重要性，針對粒線體發展出來的抗癌藥物也就應運而 生。現在主要有三個方向針對癌細胞中的粒線體作文章，分別是1) 針對癌細胞的 能量代謝；2) 針對粒線體中調控細胞凋亡的機制；3) 抑制粒線體中的電子傳遞鏈，

造成reactive oxygen species (ROS)的上升。這三種方法都有發展不少藥物的候選者，

而其中有些更是已經進入到臨床試驗。⁶⁸一些例子如圖七所示。

雖然科學界很早就對粒線體在癌症中扮演的角色有所了解，但是最早蓬勃發 展出粒線體標靶分子的目的卻不是治療癌症，而是在老化研究方面。有一派的老

化假說認為，老化是因為粒線體不斷的製造ROS，使得粒線體不斷的受到損傷。

這些學者認為，使用抗氧化劑去避免ROS 造成粒線體損傷可以延緩老化的速度

74；這些嘗試後來並沒有太大的突破。這些嘗試失敗學者提出一項假說，可能不

是這樣的策略有問題，而是抗氧化物質在進入到粒線體之前就已經和其他物質反

應，因此沒有達到原先預期的效果。⁶⁷這樣的動機促使他們開始粒線體標靶分子

以及其修飾在抗氧化物質的研究。雖然這樣的策略是否有效還不是很明確，但在 標靶粒線體的分子上的確有一些研究成果。⁷⁴

這些分子可以分成兩類，lipophilic cation 和 mitochondria targeting peptide，如 圖八。Lipophilic cation 同時具有可以自由穿梭在膜兩側的能力以及攜帶正電可以 累積在帶負電的粒線體matrix 中，因此具有標靶粒線體的能力。Mitochondria targeting peptide 的機制可能和 lipophilic cation 類似，或者是通過粒線體外膜的 transporter 運送到粒腺體內。⁶⁸

19

圖 七：以粒線體為標靶之抗癌藥物舉例⁶⁸

20

圖 八：粒線體標靶分子⁷⁴

21

2.3.2 以粒線體為標靶之奈米藥物載體文獻回顧

近兩年來以粒線體為標靶之藥物載體整理如Table 2 所示。這些奈米藥物載體 大部分是採用修飾lipophilic cation 的方法來 targeting 粒線體。其中最為傑出者是 Shanta Dhar 這名學者。雖然她投入這個領域的時間不久，但是對於一些以粒線體 為標靶之奈米藥物載體是否真的達成他所宣稱的效果，Shanta Dhar 的證據是最具 說服力的。在她2012 年發表在 PNAS 的文章中，她以分離粒線體並以質譜儀分析 奈米藥物載體攜帶的重金屬元素，做為評估標靶粒線體功效的方法。⁷⁵她以PLGA 修飾TPP 作為 model，建立了一個具有不同大小以及不同電性的奈米粒子 library。

並發現奈米粒子大小越小，正電荷越多，越容易分布在粒線體。⁷⁵這個結論並沒有 甚麼新奇之處，但是她是少數提供準確定量數據支持的人，如果看表中列出的其 他例子，許多人仍用定性的方法證明他們的奈米藥物載體有抵達粒線體，其實並 不是很嚴謹。

以電子穿透顯微鏡鑑定的證據，很難量化作為定量的數據，只能證明有少數 以粒線體為標靶的奈米藥物有在粒線體中。而將粒線體分離出來以電子穿透顯微 鏡鑑定，更有artifact 之虞，因為分離粒線體的過程會有離心的步驟，無法排除細 胞質中奈米粒子一起離下來的可能性。

22

Author (*)

Material Size Zeta (mV)

Incubation time Methods to assess MT targeting

Ref.

Shanta Dhar

PLGA-TPP Systematic 79~200 nm

34 4-6 hr (confocal) 12 hr (ICPMS)

Confocal Fraction->

ICPMS

PNAS (2012)⁷⁵

Lipid capped

PLGA-TPP

~123 nm 39 4 hr (confocal) 12 hr (ICPMS)

Confocal Fraction->

ICPMS, IVIS

PNAS (2013)⁷⁶

Lu

Wan-Liang

DQA- liposome

85 nm 1.93 24 hr Confocal Fraction->flow

Biomaterials (2013) ⁷⁷ DQA-liposom

e

65 nm -0.52 4 hr (confocal) 6 hr (flow)

Confocal Fraction->flow

Biomaterials (2012) ⁷⁸ TPP-liposome 83 nm -0.09 4 hr Confocal

Fraction->flow

Biomaterials (2013) ⁷⁹ Maurizio

Prato,Albe rto Bianco

MTS-CNT 直徑 30 nm 長0.5 μm

no data 24 hr 20 min (isolated mitochondria)

TEM Mice liver mitochodria->

TEM*

Nanoscale, (2013)⁸⁰

Wee Han Ang, Giorgia Pastorin

Rodamine123- CNT

直徑 30-60 nm 長2-10 μm

no data 12 hr (confocal) 6 hr (TEM)

Confocal, TEM Fraction->TEM

Biomaterials (2014) ⁸¹ 表 二：近兩年以粒線體為標靶之奈米藥物載體整理

23

2.4 研究動機

目前的新藥開發以及現有藥物多面臨到藥物動力學不佳以及副作用過強等問 題而中止臨床研究或是在使用上有疑慮，但透過奈米藥物載體來攜帶上述的藥物，

有機會改善這些問題。以奈米藥物載體攜帶藥物有許多優點：1)奈米藥物載體可以

透過enhanced permeability and retention effect (EPR effect)使抗癌藥物累積在腫瘤，

降低對正常組織及器官的副作用。2)可以使疏水性藥物均勻的分散在生物系統中，

避免因使用助溶劑造成的副作用；3)可以在載體上做各種修飾增加不同功能(ex:

targeting, imaging)，而不用改變藥物的分子結構。

近年來，以粒線體為標的開發抗癌藥物成為新一代癌症治療的重要研究方向。

粒線體是細胞的能量以及死亡的調控中心，且腫瘤細胞粒線體的功能普遍異常，

因此針對腫瘤細胞和正常細胞在代謝以及死亡調控上的顯著差異尋找標的，是重 要的新藥發展策略。目前已經有多種以粒線體為標靶的藥物進入到臨床試驗階段。

基於上述奈米藥物載體的優點，及以癌細胞粒線體為標靶之化學治療策略的發展，

開發能有效運送藥物至粒線體之藥物載體有其必要性。

在本研究中，我們利用修飾有triphenylphosphonium (TPP)分子之磷脂質來包 覆金奈米粒子(phospholipid capped gold nanoparticles, PLGNP)表面，使其成為以粒 線體為標靶之奈米粒子；並利用金奈米粒子可以透過感應耦合質譜儀(ICP-MS)準 確量化的特點，來評估我們的修飾方法是否可以使奈米粒子有效地進入到粒線體。

若ICP-MS 測得的數據證明 PLGNP-TPP 可以有效地進入到粒線體，則此修飾策略 將可應用到其他不同種類的奈米藥物載體上，並且PLGNP-TPP 也有機會成為研究 奈米粒子與粒線體功能等基本研究的重要工具。

24

第三章 實驗藥品與儀器

3.1 實驗藥品

Table 1：實驗藥品表單

藥品名稱, 縮寫 分子式/縮寫 製造廠商

Acrylamide/Bis solution MDBio

(Qingdao, China)

Ammonium persulfate APS Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) Bolvine Serum Albumin BSA Sigma-Aldrich

(St. Louis, MO, USA) Dimethyl Sulfoxide DMSO Fisher Chemic

EDTA-Trypsin Gibco

Fetal Bovine Serum FBS Gibco

Glutamine Glycine Dulbecco’s minimum essential medium SMEM Hyclone

N,N,N’N’-Tetra-methylethylenediamine TEMED Bio-Rad Penicillin/streptomycin PS Biosource

(Camarillo, MD, USA) Thiazolyl blue tetrazolium bromide MTT Sigma-Aldrich

(St. Louis, MO, USA)

Tris-base Sigma-Aldrich

(St. Louis, MO, USA)

Tween 20 Sigma-Aldrich

(St. Louis,

25

MO, USA) 1,2-Dipalmitoyl-sn—3-phosphatidylcholine DPPC Avanti Polar

Lipid (Alabaster, AL, USA) 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-

N-[amino(polyethylene

glycol)-2000](ammoniumsalt)

DSPE-PEG2000- amine

Avanti Polar Lipid

(Alabaster, AL, USA)

Dimethylformamide DMF J.T. Baker

(Phillipsburg, NJ, USA) Hydrogen tetrachloroaurate (III) HAuCl4 Alfa Aesar

(Ward Hill, MA, USA)

Sodium citrate Sigma-Aldrich

(St. Louis, MO, USA)

Sodium chloride NaCl Merck

(Whitehouse Station, NJ, USA)

Sodium dodecyl sulfate SDS Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)

1-Dodecanethiol 1-DT Fluka

(St. Louis, MO, USA)

Hydrochloric acid HCl Riedel deHaen

(Seelze, Germany)

Nitric acid HNO3 Fluka

(St. Louis, MO, USA)

26

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]

(ammonium salt)

DPPE- PEG2000

Avanti Polar Lipid

(Alabaster, AL, USA) Potassium phosphate dibasic K2HPO4 Riedel deHaen

(Seelze, Germany) Potassium phosphate monobasic KH2PO4 J.T. Baker

(Phillipsburg, NJ, USA)

Triethylamine TEA Sigma-Aldrich

(St. Louis, MO, USA) Dicyclohexylcarbodiimide DCC Sigma-Aldrich

(St. Louis, MO, USA) N-Hydroxysuccinimide NHS Thermo Fisher

Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)

(3-Carboxypropyl)triphenylphosphonium bromide CTPP Sigma-Aldrich (St. Louis,

MO, USA)

27

3.2 實驗儀器

Table 2：實驗儀器表單

儀器名稱, (英文, 縮寫) 廠牌型號

超聲波液體震盪器 (Ultrasonic Cleaner)

VWR scientific producnts, Aquasonic 75D

(NY, USA) 動態光散射儀

(Dynamic light scattering, DLS)

Malvern Nano ZS (Worcestershire, UK) 高速離心機

(High speed centrifuge)

Hermle Z 36 HK (Wehingen, Germany) 冷凍乾燥機

(Freeze dryer)

Thermo Electron Corporation Modulyod-115 (MA, USA) UV/vis 吸收光譜儀

(UV/vis spectrophotometer)

Varian Cary 300 UV-Vis Bio (Palo Alto, CA, USA)

螢光光譜儀

(Fluorescence spectrophotometer)

Varian Cary Eclipse (Palo, VIC, Australia) 微孔盤分析儀

(ELISA reader)

Tecan, Sunrise

(Männedorf, Switzerland)

3.3 癌細胞株

Table 3：實驗細胞株表單

癌細胞株 所屬種類 取得來源

A-549 Human lung carcinoma BCRC No.60074

(Hsinchu, Taiwan)

28

第四章 製備方法與鑑定

4.1 DSPE-PEG2000-TPP conjugate 合成

Reagents

Chemicals Weight (mg) mole Molar ratio CTPP (MW: 429.29) 11.6 27 17.3

PE-PEG2000 –amine (MW: 2790.486)

40 14.4 1

DCC (MW: 206.33) 13.3 64.5 4.5 NHS (MW: 115.1) 7.4 64.5 4.5

1. 每毫升 chloroform 加入 20 μL triethylamine，預混適當體積備用。

2. 準備一個圓底瓶，秤 11.6 mg CTPP (27 mmol) 先以 20 L  DMSO 溶解後加入 1 mL triethylamine/chloroform, 13.4 mg DCC (64.5 mmol) 和 7.5 mg NHS (64.5 mmol)，室溫下攪拌 2hr。

3. 在第二個圓底瓶中加入 50 mg PE-PEG-amine (18 mmol) 和 2 mL chloroform ( 25 mg/mL)，將 lipid 加到步驟一的 CTPP 中，在室溫及氮氣環境下搖晃隔夜。

4. 減壓迴旋濃縮機抽去 chloroform。以 2 mL ddwater 回溶 lipid，加到 12-14K dialysis bag 中。(如果 dialysis bag 是新的，必須在使用前用大量 dH2O 清洗及 浸泡)

5. 準備一段透析管(dialysis tube)，長度為 _. + 7 cm i. 潤濕透析管並用大量一次水及二次水沖去NaN3

ii. 用透析專用的橘色夾一到兩個夾住底部，加入lipid 溶液，在將頂部

29

夾住 (一邊夾兩個可確保夾緊避免在 dialysis 的過程中掉落)。量筒 內置入600 mL 以上 ddH2O，4^oC 避光兩天，並定期換水。

6. Dialysate 凍乾後放-20^oC 備用。

7. 以 NMR 鑑定 TPP 是否有接上 DSPE-PEG2000-amine。

圖 九：DSPE-PEG2000-TPP 合成步驟流程圖

30

4.2 金奈米粒子製備

20 nm 金奈米粒子的合成是參考並修改自 Natan 等人的實驗步驟⁸²。合成前所 有玻璃器皿都需要以王水(3:1 HCl/HNO3)潤洗後再用大量去離子水以及二次水洗 淨，避免重金屬汙染影響金奈米粒子之合成。詳細步驟如下：

1. 取一 25 mL 圓底瓶，自 HAuCl4 stock 溶液中取適量加水稀釋至體積 20 mL，濃 度1.71 mM。

2. 取 40 mg sodium citrate，以 1 mL 二次水溶解後備用

3. HAu Cl4溶液水浴加熱至95^oC 並加入攪拌子攪拌，快速加入步驟 2 中的 sodium citrate 水溶液。

4. 此時可觀察到混和後的溶液先是黃色慢慢變澄清，隨後變黑，再變成酒紅色。

顏色製酒紅色時繼續反應15 min。

5. 移開水浴，金奈米粒子溶液繼續攪拌至冷卻。

6. 取 1mL 金奈米粒子溶液加到 Eppendorf 中，以 7000 rpm (約 3000 g) 離心 20 min，

去除上清液，加入0.7 mL DMF 回溶金奈米粒子。合成後的金奈米粒子若要進 行lipid capping，需要在一天內將溶劑置換成 DMF 保存，否則 lipid capping 容 易失敗。

31

4.3 脂質包覆之金奈米粒子之製備

脂質包覆脂金奈米粒子的製備是參考實驗室先前的方法，並依據實驗的需要

作修改⁸³。相較於先前的脂質包覆金奈米粒子，本論文中使用的脂質配方多了

DSPE-PEG2000-TPP 以及 DPPE- PEG2000，分別作為標靶粒線體以及對照組之用。合 成的步驟如下：

1. 所有 lipid 以及 1-DT 放在 70^oC 水浴備用。

2. 從上述 4.2 之 stock solution 中取 350 mL 金奈米粒子溶液加入 Eppendorf 中，

70^oC 水浴。

3. 在金奈米粒子溶液中加入 40 μL DPPC (5mg/mL)及 120 μL DSPE-PEG2000-TPP 或 DPPE-PEG2000 (1mg/mL)，等 5 min。

4. 加入 25 μL 1-DT (625 μM, in DMF)至金奈米粒子溶液中，70^oC 水浴 1hr。

5. 加入 642 μL 二次水(約 DMF 之 1.2 倍體積)，改變環境極性使 lipid 自組裝 上金奈米粒子，70^oC 反應 1hr。

6. 取出 Eppendorf，冷卻至室溫。

7. 以 12000 rpm (約 7000g 左右) 離心 20 min，去上清液。以二次水回溶金奈 米粒子。重複此步驟至少三次以上以去除未自組裝到金奈米粒子的脂質及 其他反應物。本論文稱合成完之脂質包覆金奈米粒子為PLGNP-TPP 或 PLGNP-PEG (對照組)。

32

8. 參考 Thaxtan 等人在 2013 年 PNAS 的作法，以原始 bare gold nanoparticle 的吸光值估計脂質包覆金奈米粒子的濃度⁸⁴。測量PLGNP-TPP/PEG 之吸 收光譜，取吸收光譜的峰值並以Beer’s law:

A = εbc A：吸光值

ε：莫耳消光係數 (cm^-1M^-1) b：樣品光徑長度 (cm) c：樣品濃度 (M)

換算PLGNP-TPP/PEG 之濃度。消光係數 εpeak = 8.48×10⁸ (cm^-1M^-1)，是參 考Mirkin 等人在 2006 年發表的數據⁸⁵。

33

4.3. 細胞實驗

人類肺腺癌細胞株是培養在添加了10% FBS 及 1% penicillin/streptomycin 的 DMEM 培養液中，在 5% CO2，37^oC 環境下培養。每兩天繼代一次，繼代時的細 胞約八到九分滿，即細胞與細胞外的在視野下的面積約1:1 至 2:1。

4.3.1 細胞存活率測試

在餵藥的前一天，將A549 細胞種 96-well plate 以 10000 cell/well，100 μL/well 的條件培養24 hr。實驗當天先將 PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的PLGNP/medium，依實驗需求共培養不同的時間。共培養時 間結束後，先將medium 吸出，加入 50 μL PBS 潤洗兩次，洗去殘留之 PLGNP；

此步驟要非常小心以免傷害細胞。加入100 μL 與 MTT reagent 預混好之 medium 進行MTT viability test。反應完成後移除 medium，加入 150 μL DMSO 在 shaker 上搖晃約15 min，轉速以 DMSO 不濺出為準。以 ELISA reader 測 570 吸光值，以 各時間之control 組別之吸光值為存活率 100% 對各實驗數值 normalized 作圖。

34

4.3.2 偵測細胞內 ATP 含量

在餵藥的前一天，將A549 細胞種 96-well plate 以 10000 cell/well，100 μL/well 的條件培養24 hr。實驗當天先將 PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的PLGNP/medium，培養 12hr。共培養時間結束後，先將 medium 吸出，加入50 μL PBS 潤洗兩次，洗去殘留之 PLGNP。ATP 之偵測是使用

PerkinElmer ATPlite^TM 這個產品及所附的 protocol。這是一種利用 Luciferase 再有 氧氣、ATP、substrate D-Luciferin 及催化劑 Mg²⁺ 時會產生螢光的反應來偵測ATP。

首先加入50 μL cell lysis solution 使 ATP 可以通過細胞膜到膜外；再加入 50 μL substrate solution。反應完成以 plate reader 讀取螢光值，並用產品所附之 ATP 標準 品製成之檢量線得到ATP 之莫爾數。

35

4.3.3 粒線體膜電位之觀測

在餵藥的前一天，將A549 細胞種 24-well plate 以 50000 cell/well，500 μL/well 的條件培養24 hr。實驗當天先將 PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的PLGNP/medium，培養 12hr。共培養時間結束後，先將 medium 吸出，加入50 μL PBS 潤洗兩次，洗去殘留之 PLGNP。粒線體膜電位之偵測是使 用Guava Technologies 的產品 Guava® EasyCyte™ MitoPotential™ Kit，參考 protocol 的指示使用。將 kit 中所附的 JC-1 dye 以新鮮的 medium 稀釋加入 well 中，

共培養30 min 後洗去 dye，以 PBS 潤洗兩次後在螢光顯微鏡下觀察。

4.3.4 細胞內酸性胞器染色

在餵藥的前一天，將A549 細胞種 24-well plate 以 50000 cell/well，500 μL/well 的條件培養24 hr。實驗當天先將 PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的PLGNP/medium，培養 12hr。共培養時間結束後，先將 medium 吸出，加入50 μL PBS 潤洗兩次，洗去殘留之 PLGNP。將 Acridine orange 以新鮮 的medium 稀釋至 3 μg/mL，染色 15 min 後移除 dye 並以 PBS 潤洗兩次。在螢光 顯微鏡下觀察細胞內的酸性胞器。

36

4.3.5 西方點墨法

西方點墨法的步驟粗分為蛋白質萃取、蛋白質膠體電泳、蛋白質轉印以及抗 體呈色。每個部份皆參考廠商建議的步驟，依照所要分析的蛋白質特性選擇合適 的參數。蛋白質萃取步驟如下：

1. 將癌細胞培養於 6-well plate，待與奈米粒子共培養的實驗完成後，將細胞以 trypsin 處理，待細胞與培養盤的表面分離後，加入含血清的 medium 中指 trypsin 的反應，並離心分離細胞。

2. 去除上清液並以 PBS 使細胞重新懸浮，再離心一次，這樣可以去除先前步驟 中的serum 以及 trypsin。

3. 加入 100 μL RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer; 150 mM sodium chloride, 1.0% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH8.0) 及蛋白酶抑制劑(Sodium orthovanadate, 1mM; Leupeptin, 20 μg/mL; PMSF, 100 μg/mL)。RIPA buffer 可用於萃取 whole cell lysate、membrane bound protein、Nuclear protein 及 mitocondrial protein 等，適用於本研究要分析 的所有蛋白質。

4. 在 4^oC 下 sonicate 15 min，再以 4^oC，12000 rpm 離心 30 min，核酸以及細胞碎 片會在Eppendorf 底部形成膠狀沉澱，而上清液即為 whole cell lysate。Lysate 可再-20^oC 保存，但依蛋白質特性會有不同的保存時間，如果要測量易降解的 蛋白質表現，如膜蛋白等，lysate 不能久放。最好馬上或一兩天內做完。

5. 取 3 μL 之 lysate 以二次水稀釋至 30 μL，以 Coomassie brilliant blue G250 定量 蛋白質濃度。定量以BSA 為標準品並參考廠商提供之步驟進行。

37

蛋白質膠體電泳的部分，是要上面萃取出的蛋白質以膠體電泳方法按照分子量 大小分離。其步驟如下：

1. 將 cell lysate 和 5x loading dye (DTT 77 μg/mL; SDS 0.1 g/mL; Tris-base 0.5M, pH6.8; 50% Glycerol; 0.0015% Bromophenol Blue)混合並以 70^oC 加熱 10 min (或 是100^oC 5min)，加熱完後將樣品至於-20^oC 冰箱快速冷卻，使用前離心使壁上 樣品離下。這步驟將蛋白質降解，使其成為一級結構。加熱溫度的選擇是依蛋

白質的需求根據廠商的建議做調整，因為LC-3 是膜蛋白，使用較低的溫度可

以避免膜蛋白變性聚集。

2. 鑄膠。依據下列表格配置 12%的 separation gel 以及 stacking gel：

12% separating gel (5mL) Stacking gel(1mL)

H

O

H

O

30% acrylamide

30% acrylamide

1.0 M Tris (pH8.8)

1.0 M Tris (pH6.8)

10% SDS

10% SDS

10% APS

10% APS

TEMED

TEMED

3. 將 running buffer (Tris-Base, 3g/L; Glycine, 14.4g/L; SDS, 1g/L)加入電泳槽外槽 及內槽中，再把步驟一和loading dye 反應完的蛋白質樣品根據實驗設計加到各 自的well 中。以 70 伏特電壓先跑 10 min 使蛋白質跑到上膠和下膠的分界，在 以100 伏特電壓繼續電泳直到 loading dye 的藍色色帶行進至膠片底部為止，約 需要兩小時。

38

蛋白質轉印(electrotrasfer)的部分，是要將膠片上的蛋白質轉印到 Polyvinylidene fluoride membrane (PVDF membrane)或是 Nitrocellulose paper 上。因為接下來 immunoblot 的步驟需要大量的搖晃及清洗，膠片容易碎裂，將蛋白質轉印到前述 兩種膜上可以避免這樣的問題。將膠片取出，裁成合適的大小，蓋上與膠片大小 相似(需事先剪裁過)的 PVDF membrane (事前需用 methanol 浸泡 2 min，避免轉印 過程皺縮)，用兩張浸濕的濾紙夾住，再用轉印專用的海綿及卡夾固定並放入 Chamber 中。以 100 伏特跑 2 小時。組裝過程都在裝有 transfer buffer (Tris-Base, 3.1 g/L; Glycine, 14.4 g/L; Methanol, 20% in H2O) 的容器進行。

39

Immunoblotting 的步驟如下：

1. 轉印完將 PDMF membrane 取出，裝載保鮮盒中以 5% blocking buffer (5% 脫脂 牛奶溶於TBS buffer 中)，在室溫下輕微搖晃 1 小時。

2. 移除 blocking buffer，以 TBS-tween buffer 清洗三次，每次輕微搖晃 10 分鐘。

3. 將一級抗體以 TBS-tween 按照廠商建議比例稀釋，以恰好淹過 membrane 的體 積加入容器中。反應1 小時。

4. 反應完後，如前清洗步驟清洗三次。

5. 加入二級抗體反應一小時，以恰好淹過 membrane 的體積加入容器中。

6. 清洗三次，最後加入 enhanced chemiluminescence 試劑和二抗上修飾的酵素進行 反應，產生的冷光以冷光儀偵測並拍照。

40

第五章 結果與討論

5.1 DSPE-PEG2000-TPP conjugate 合成與鑑定

DSPE-PEG2000-TPP conjugate 的合成是利用 DSPE-PEG2000-amine 上的氨基和 CTPP 上的酸基反應形成醯胺鍵，反應加入 DCC 和 NHS 催化，並用透析法純化最 後得到的產物。透析管的大小選擇12-14K，這個大小可以留住 lipid 形成的 micelle 或是liposome，但是沒有 conjugate 上的 CTTP 或其他反應物會因為分子量遠小於 透析管的cut off 值而擴散出透析管外。透析完後的產物凍乾並於-20^oC 保存。

反應完成後以NMR 鑑定最後的產物是否接上 TPP。TPP 上具有 aromatic hydrogen，在大約 7-8 ppm 會有 NMR 的訊號；因為 DSPE-PEG2000-amine 上沒有 aromatic hydrogen，所以如果 NMR 分析最後得到結果有這樣的訊號就代表修飾成 功。分析的結果請見圖十。圖中是CTPP 和產物的分析結果，可以發現 CTPP 上具 有aromatic hydrogen 約 7-8 ppm 的訊號，與預期相符；而且產物在相同位置也有 訊號。另外注意到大約3.6 ppm 的位置，文獻指出 PEG2000上長碳鏈的氫原子訊號 會落在此處。⁷⁹我們的產物同時具有DSPE-PEG2000以及TPP 的訊號，又因為步驟 中透析的過程去除了訊號來自兩者混合物的可能性，因此判斷DSPE-PEG2000-TPP conjugate 的確有成功合成出來。

41

圖 十：DSPE-PEG2000-TPP conjugate NMR 鑑定

42

5.2 脂質包覆之金奈米粒子之製備與鑑定

製備PLGNP-TPP 以及 PLGNP-PEG 的過程有置換穩定保護基(stabilizing ligand)，將檸檬酸置換成帶有硫基的 1-dodecanethiol。反應過程金奈米粒子缺少穩 定保護基，因此實驗的各個條件關係到金奈米粒子是否會聚集。主要考慮的因素 有：磷脂質的濃度、lipid 自組裝時水與 DMF 的比例、DSPE-PEG2000-TPP/PEG 的 添加量。

磷脂質的濃度使用的依據如下：

1. 金奈米粒子的大小為 20 nm，一顆磷脂質所佔的表面積為 0.64 nm²。^86-88 2. 以金的密度 19.3 g/cm³，球的體積為4/3πr³，以及金的分子量196.97 g/mol 計

算，可得一顆20 nm 金奈米粒粒子有 3.70×10^-19 mol 金原子，即 2.23×10⁵個 金原子，此數據與文獻值接近。⁸⁹

3. 以實驗所使用的四氯金酸鹽總量為 3.42×10^-5 mol，假設全部還原成金奈米粒子，

由2.計算出之每個金奈米粒子所含之金原子數，可得每毫升金奈米粒子約有

4.62×10¹²顆金奈米粒子，即7.67×10^-9 M。

4. 以球的表面積 4πr²計算，20 nm 金奈米粒子的表面積約為 1256 nm²，一顆DPPC 表面積約是0.64 nm²，因此約需要1.96×10³顆磷脂質可以鋪滿一顆金奈米粒子。

5. 由 3.及 4.可得，每毫升金奈米粒子約需要 9.06×10¹⁵顆磷脂質，即1.50×10^-8 mol。

6. 本實驗每次合成的金奈米粒子所需之磷脂質約為 1.50×10^-8 mol，DPPC 的添加 量約為2.54×10^-7 mol，lipid 約過量 17 倍左右。

水與DMF 的比例決定了環境的極性，和 lipid 自組裝上 1-Dodecanethiol 修飾在

金上的疏水性表面有關。這個過程成功與否大致決定合成是否成功。在此對DMF

與水的比例做了最佳化的探討。之前實驗室的研究已經發現，比起2:1、1:2，兩者 比例1:1 是較合適的比例。⁸³但進一步研究這個範圍內的其他參數，發現1:1.2 可

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能是較安全的一個比例。從圖十一中可以觀察到，1:0.8 有明顯顏色變紫的現象，

而1:1 和 1:1.2 兩組則維持原本金奈米粒子的紅色。這裡可以得知水必須和 DMF 相同比例或是稍微過量會有比較好的穩定性，而且因為DMF 的沸點約 153^oC 高於 水的沸點，在熱水浴過程中可能因此水蒸發速度較快的現象，因此加稍微過量的 水如1:1.2 的比例會比較合適。之後也使用這樣的比例合成。

另外我們的PLGNP-TPP 希望上面攜帶的 DSPE-PEG2000-TPP 在可以合成出來的 前提下越多越好，因此對DSPE-PEG2000-TPP/PEG 添加的量做了最佳化的研究。從 圖十一中可以發現，添加到150 μg/mL 的 DSPE-PEG2000-TPP 濃度時奈米粒子有明 顯沉澱的現象，吸收光譜圖中的鑑定結果也發現這個組別的吸收鋒較寬(圖十二)，

暗示有奈米粒子聚集造成吸收鋒變寬的結果。將這些組別的PLGNP 以動態光散色 儀做表面電荷的分析，預期將看到PLGNP-TPP 的組別會較 PLGNP-PEG 的組別帶 有更多的正電荷，而且隨著添加的DSPE-PEG2000-TPP 量增加。鑑定的結果如圖十 三。圖中的結果顯示，PLGNP-PEG 的各組別表面電荷沒有太大的差異，zeta potential 約在-10 mV 左右，且整體而言都較 PLGNP-TPP 組帶較少正電。而 PLGNP-TPP 的 各組隨著添加的DSPE-PEG2000-TPP 量增加，有 zeta potential 越來越正的趨勢。根 據以上結果，接下來選擇使用以合成條件為添加DSPE-PEG2000-TPP μg/mL 的組別 做接下來的實驗。

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圖 十一：最佳化 PLGNP 合成過程中 DMF：Water 比例與 TPP lipid 添加量

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圖 十二：(a)PLGNP-PEG 之吸收光譜；(b)PLGNP-TPP 之吸收光譜

0

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

400 500 600 700 800

Normaliz ed absorbance

wavelength (nm)

PLGNP-PEG30 PLGNP-PEG60 PLGNP-PEG90 PLGNP-PEG120 PLGNP-PEG150

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

400 500 600 700 800

Normaliz ed absorbance

wavelength (nm)

PLGNP-TPP30 PLGNP-TPP60 PLGNP-TPP90 PLGNP-TPP120 PLGNP-TPP150 (a)

(b)

46

圖 十三：(a)PLGNP-PEG 以 DLS 量測 zeta potential 結果；(b) PLGNP-TPP 以 DLS 量測zeta potential 結果

(a)

(b)

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5.3 脂質包覆之金奈米粒子之穩定性測試

磷脂質包覆之奈米粒子可以增進其生物相容性，在水溶液中的穩定性，改善 奈米粒子不耐鹽及分散性不佳容易沉澱等缺點。83, 84, 90, 91這些缺點在奈米藥物傳遞 上是相當致命的，容易聚集的奈米粒子可能會造成血管堵塞，不只是無法將藥物 送達作用位置，更可能造成嚴重的副作用。

我們將PLGNP-PEG 和 PLGNP-TPP 在模擬生物環境的 buffer 以及 culture medium 中測試他們的穩定性。這些 buffer 分別是模擬人體鹽濃度的 PBS、模擬人 體血液中白蛋白濃度的PBS w/ 4% BSA、添加或沒有添加血清的 cell culture medium、模擬腫瘤組織 pH 值以及模擬 lysosome 內 pH 值的 PBS buffer。⁸³如果奈 米粒子有聚集及沉澱的現象，我們會看到如圖十一中，溶液顏色變藍或是底部有 沉澱的現象。實驗的結果如圖十四，可以發現不論是PLGNP-PEG 和 PLGNP-TPP，

在這些buffer 中都有良好的穩定性，並沒有奈米粒子聚集造成顏色漸漸偏藍或是 底部產生沉澱的現象。這樣的結果顯示我們的奈米粒子在細胞實驗中較不會受到 奈米粒子不穩定而影響到實驗的結果。

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圖 十四：以模擬生物環境及 cell culture medium 的 buffer 測試 PLGNP-PEG 及 PLGNP-TPP 的穩定性

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5.4 PLGNP-TPP 造成細胞存活率下降

將肺癌腫瘤細胞株A549 與 PLGNP-TPP 共培養並偵測其細胞存活率來觀察 PLGNP-TPP 的毒性。在餵藥的前一天，將 A549 細胞種下並培養 24 hr。實驗當天 先將PLGNP 與 medium 預混，將各個 well 中的 medium 吸出後加入預混好的 PLGNP/medium，依實驗需求共培養 3-24 小時。共培養時間結束後，進行 MTT viability test。以 ELISA reader 測 570 nm 吸光值，以各時間之 control 組別之吸光值 為存活率100% 對各實驗數值 normalized 作圖如圖十五。可以觀察到與

PLGNP-PEG 共培養的控制組其最高濃度培養最長時間 24 小時的存活率大約在 85%以上，顯示 PLGNP-PEG 沒有明顯的細胞毒性。但是觀察共培養 PLGNP-TPP 的實驗組可以發現，細胞存活率似乎隨著PLGNP-TPP 濃度增加以及共培養時間增

加有下降的趨勢。但是存活率的下降似乎有極限，大約在存活率60%左右再增加

劑量或是共培養時間也不會造成更顯著的結果。

這樣的結果顯示PLGNP-TPP 具有有限的細胞毒性，而關於以粒線體為標靶的 奈米藥物載體文獻中，對這類型的奈米藥物載體造成的細胞毒性著墨相當少。^{75, 77,}

78, 80基於我們的發現以及以上理由，我們認為研究以粒線體為標靶的奈米藥物載體

造成的細胞毒性是重要的，無論是將來在這類型的藥物載體設計上或使用上，都 需要這方面的研究提供改良的參考。因此以下對此做進一步的探討。

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圖 十五：A549 肺癌腫瘤細胞與 PLGNP-TPP 共培養後對其細胞存活率作圖

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5.5 PLGNP-TPP 造成細胞內 ATP 含量下降

因為PLGNP-TPP 是一種以粒線體為標靶的奈米藥物載體，因此我們懷疑其造 成的細胞毒性是來自對粒線體的傷害。粒線體受損的其中一個指標是細胞內的 ATP 含量下降。我們以 ATPlite 這個市售的 kit 測量細胞內 ATP 的含量。這是一種 利用Luciferase 在有氧氣、ATP、substrate D-Luciferin 及催化劑 Mg²⁺ 時會產生螢 光的反應來偵測ATP 的方法。首先加入 50 μL cell lysis solution 使 ATP 可以通過 細胞膜到膜外；再加入50 μL substrate solution 與 ATP 反應。反應完成後以 plate reader 讀取螢光值，並用產品所附之 ATP 標準品製成之檢量線得到 ATP 之莫爾數。

為了避免各個組別細胞數目不一造成的ATP 差別(如此一來 ATP 含量不同就可能 只是細胞數不同)，因此測量各個 well 的蛋白質量來對 ATP 結果進行 normalize。

結果如圖十六。可以發現與PLGNP-TPP 共培養 12 小時的組別，其每μg 蛋白質所 含的ATP 莫爾數隨著 PLGNP-TPP 劑量的增加而減少。

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圖 十六：與 PLGNP-TPP 共培養後細胞內 ATP level 偵測

0

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

A T P level (pmol/ μ g)