以西方墨點法探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞產

將細胞以 50 M Ellagic acid 處理並利用西方墨點法分析處理藥 物後之0、12、24、36、48 小時的蛋白表現

實驗結果顯示 pro-apoptosis 中的 Bax、Bak 表現有上升的情形且 t-Bid 也有表現的情形(圖 3-9-1)。在由粒線體中釋放出的與凋亡相關 蛋白中AIF、Endo G、Cytochrome c 表現量也有明顯的上升(圖 3-9-2)。

Cytochrome c 會引起下游的 Apaf-1 的活化而引起一系列的 Caspase 活 化，實驗結果顯示 Apaf-1 有表現上升的情形且下游的 caspase-9 與 caspase-3 有被裂解的情形(圖 3-9-3)。而外在路徑中的 Fas、FasL、

caspase-8、t-Bid 的表現量上升。此外 anti-apoptosis 蛋白 Bcl-XL、Bcl-2 與XIAP 表現量有隨著處理藥物的時間增加而表現量下降。

76

Ellagic acid (50 M)

(hours) Bid

15 kDa 22 kDa

tBid

1.00 2.19 1.25 1.75 1.61

1.00 1.29 2.00 1.49 2.15 Bak

-actin

42 kDa

1.00 1.03 1.06 0.97 1.08

30 kDa

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.02 1.06 1.10 0.92

Ellagic acid (50 M)

(hours)

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 M)

(hours) Bid

15 kDa 22 kDa

tBid

1.00 2.19 1.25 1.75 1.61

1.00 1.29 2.00 1.49 2.15 Bak

-actin

42 kDa

1.00 1.03 1.06 0.97 1.08

30 kDa

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.02 1.06 1.10 0.92

圖 3-9-1 粒線體路徑之凋亡相關蛋白表現變化。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48 小時後，利用西方墨點 法檢測與粒線體路徑之凋亡相關蛋白t-Bid、Bax、Bak 的表現變化。

77

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 M)

(hours)

cytochrome c 14 kDa

1.00 1.08 1.16 1.17 1.26

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.09 1.05 1.16 1.33

21 kDa Smac/DIABLO

1.00 1.38 1.42 1.61 1.64

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 M)

(hours)

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 M)

(hours)

cytochrome c 14 kDa

1.00 1.08 1.16 1.17 1.26

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.09 1.05 1.16 1.33

cytochrome c 14 kDa

1.00 1.08 1.16 1.17 1.26

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.09 1.05 1.16 1.33

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.09 1.05 1.16 1.33 測有關存於粒線體內之凋亡相關蛋白AIF、Endo G、Cytochrome c、

Smac/DIABLO 的表現變化。

78

-actin

_{42 kDa}

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 M)

(hours)

1.00 1.22 1.24 1.13 1.21

Apaf-1 130 kDa

1.00 1.09 1.06

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.27 1.85 1.59

1.00 1.20 1.20 1.29 1.38

-actin

_{42 kDa}

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 M)

(hours)

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 M)

(hours)

1.00 1.22 1.24 1.13 1.21

Apaf-1 130 kDa

1.00 1.09 1.06

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.27 1.85 1.59

1.00 1.20 1.20 1.29 1.38

圖 3-9-3 與 粒 線 體 相 關 內 在 路 徑 之 凋 亡 相 關 蛋 白 表 現 變 化 。 TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48 小時 後，利用西方墨點法檢測有關於粒線體內在路徑之凋亡相關蛋白 Apaf-1、caspase-9、caspase-3 之表現變化。

79

Ellagic acid (50 M)

(hours)

Fas 45 kDa

FasL 40 kDa

1.00 1.37 1.95 2.18 1.56

1.00 1.33 0.91 0.88 0.76

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.02 1.06 1.10 0.92 Bid

15 kDa 22 kDa

tBid

1.00 2.19 1.25 1.75 1.61 1.00 1.11 1.10 1.09 1.71

Ellagic acid (50 M)

(hours)

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 M)

(hours)

Fas 45 kDa

FasL 40 kDa

1.00 1.37 1.95 2.18 1.56

1.00 1.33 0.91 0.88 0.76

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.02 1.06 1.10 0.92 Bid

15 kDa 22 kDa

tBid

1.00 2.19 1.25 1.75 1.61 Bid

15 kDa 22 kDa

tBid

1.00 2.19 1.25 1.75 1.61

圖 3-9-4 外在路徑之凋亡相關蛋白表現變化。TSGH-8301 細胞以 50

M 的 Ellagic acid 處理後，經過 12、24、36、48 小時後，利用西方 墨點法檢測有關於外在路徑之凋亡相關蛋白 Fas、FasL、t-Bid、

caspase-8 之表現變化。

80

圖 3-9-5 抗凋亡相關蛋白表現變化。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 Ellagic acid 處理後，經過 12、24、36、48 小時後，利用西方墨點法 檢測有關於抗凋亡相關蛋白Bcl-XL、Bcl-2、XIAP 之表現變化。

81

第十節 以西方墨點法探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞的細胞週 期之相關蛋白表現

實驗結果顯示隨著時間的增加，p53 與 p21 的表現量也隨之增 加，而下游的cycline E 與 cdk2 表現量有減少的情形(圖 3-10-1)。因 此可證明Ellagic acid 可誘使 TSGH-8401 細胞的細胞週期停滯在 G0/

G1。

82

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 mM)

(hours)

CDK2 52 kDa

1.00 1.15 1.02 0.83 0.67

Wee1 105 kDa

1.00 1.10 1.01 0.94 0.95

-actin

^{42 kDa}

p21 21 kDa

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.09 1.05 1.16 1.33

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 mM)

(hours)

0 12 24 36 48

Ellagic acid (50 mM)

(hours)

CDK2 52 kDa

1.00 1.15 1.02 0.83 0.67

Wee1 105 kDa

1.00 1.10 1.01 0.94 0.95

-actin

^{42 kDa}

p21 21 kDa

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.09 1.05 1.16 1.33

-actin

^{42 kDa}

1.00 1.09 1.05 1.16 1.33

圖 3-10-1 TSGH-8301 細胞以 50 M 的 Ellagic acid 處理後，經過 12、24、36、48 小時後，利用西方墨點法檢測有關於細胞週期相關 蛋白cyclin E、CDK2、wee1、p21、p53 之表現變化。

83

第十一節 利用免疫螢光染色探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞中 凋亡相關蛋白之表現與轉移之影響

以50 M 的 Ellagic acid 處理 TSGH-8301 細胞 48 小時後，利用 免疫螢光染色與共軛焦顯微鏡觀察之。實驗結果顯示，當細胞以藥物 處理48 小時之後 cytochrome c 與 Smac/DIABLO 大量的表現與釋放 之細胞質中。Endo G 與 AIF 也大量表現並移動至細胞核中。

48 hours Control

Cytochrome c Mito Tracker Merge

48 hours Control

Cytochrome c Mito Tracker Merge

圖 3-11-1 EA 對於 TSGH-8301 細胞內 cytochrome c 的表現與轉移的 影響。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理，並經過 48 小時後，免 疫螢光染色與共軛焦顯微鏡觀察cytochrome c 的表現與轉移。

84 Control

48 hours

PI Merge

Smac/DIABLO

Control

48 hours

PI Merge

Smac/DIABLO

圖 3-11-2 EA 對於 TSGH-8301 細胞內 Smac/DIABLO 的表現與轉移的 影響。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理，並經過 48 小時後，免 疫螢光染色與共軛焦顯微鏡觀察Smac/DIABLO 的表現與轉移。

85

Endo G PI Merge

Control

48 hours

Endo G PI Merge

Control

48 hours

Endo G PI Merge

Control

48 hours

Endo G PI Merge

Control

48 hours

Endo G PI Merge

Control

48 hours

Endo G PI Merge

Control

48 hours

Endo G PI Merge

Control

48 hours

圖 3-11-3 EA 對於 TSGH-8301 細胞內 Endo G 的表現與轉移的影響。

TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理，並經過 48 小時後，免疫螢光 染色與共軛焦顯微鏡觀察Endo G 的表現與轉移。

86 Control

48 hours

AIF PI Merge

Control

48 hours

AIF PI Merge

Control

48 hours

AIF PI Merge

圖 3-11-4 EA 對於 TSGH-8301 細胞內 AIF 的表現與轉移的影響。

TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理，並經過 48 小時後，免疫螢光 染色與共軛焦顯微鏡觀察AIF 的表現與轉移。

87

1.35 0.77

第十二節 以 Quantitative PCR Analysis 探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞產生凋亡相關蛋白之 mRNA 表現 Average CT

Average CT

RQ. Average CT

Average CT

RQ.

88

Time of incubation (hours)

0 24 48

Relative caspase-9 mRNA expression

0.0

TSGH-8401 細胞處理 50M EA 之後，caspase-9 mRNA 表現。

Time of incubation (hours)

0 24 48

Relative caspase-3 mRNA expression

0.0

TSGH-8401 細胞處理 50M EA 之後，caspase-3 mRNA 表現。

89

第四章 討論

許多研究指出 Ellagic acid 誘發癌細胞的凋亡如﹕神經母細胞瘤 (Neuroblastoma）細胞株 SH-SY5Y¹⁹、人類膀胱癌細胞株 T24、胰臟 癌 (pancreatic cancer cell)²⁰細胞與結腸癌細胞株Caco-2²²。且與其他 藥物共同作用時可更有效使細胞凋亡，如: 甲殼素 (Chitosan)與 Ellagic acid 的共同處理可使神經膠質瘤 (glioma)¹⁰ 與黑色素細胞癌 (melanoma)¹⁷產生細胞凋亡。槲皮素(quercetin) 與 Ellagic acid 的共同 處理可以使人類血癌細胞的細胞週期停滯與細胞凋亡¹⁸。而在本研究 中由細胞存活率分析得知Ellagic acid 可抑制 TSGH-8301 細胞的生長 (圖 3-1-3)，因此進一步去觀察 Ellagic acid 對於 TSGH-8301 細胞是否 使之產生細胞凋亡。在實驗中利用了Annexin V affinity assay 來評估 磷脂質絲胺酸(phospholipid phosphatidylserine)的外翻情形。結果顯示 TSGH-8301 細胞株在處理 Ellagic acid 後磷脂質絲胺酸外翻的情形有 隨 著 時 間 的 增 加 而 越 嚴 重 。 因 此 證 明 了 Ellagic acid 也 會 誘 使 TSGH-8301 細胞株的凋亡。

細胞凋亡的特徵也可以由細胞外表與細胞核的變化觀察出來

57 。當細胞進行凋亡時，細胞膜會往內皺縮進而形成凋亡小體，而細 胞 核 內 則 是 DNA 會 凝 集 (DNA condensation) 與 斷 裂 (DNA fragmentation)。由型態照片可以發現處理藥物之後的 TSGH-8301 細

90

胞其隨著濃度與時間的增加，細胞數目逐漸的減少與細胞開始產生皺 縮的現象(圖 3-1-1 與圖 3-1-2)。當細胞凋亡時，DNA 會產生受損的 現象，DNA 受損會出現染色質凝集現象與 DNA 會被活化的 AIF、Endo G 和 Caspase 下游的死亡受質切成較小的片段(約 180~200 bp)⁵⁸ 。首 先由 DAPI 染色實驗中可以發現經過藥物處理過的 TSGH-8301 細胞 的細胞核有隨著濃度的增加與時間的增長，而其DAPI 所發出的螢光 訊號也越來越強(圖 3-4-1 與圖 3-4-2)，也就是說 TSGH-8301 細胞經 過藥物處理後其，DNA 出現凝集的現象。利用 DNA 膠體電泳可以觀 察到DNA 斷裂的現象，實驗結果顯示當隨著處理藥物的時間與濃度 的增加，DNA 所形成的斷裂也越來越嚴重(圖 3-4-4)。另外，彗星試 驗(comet assay)是一種有效且快速觀察 DNA 受損的情形，當 DNA 受 損的越嚴重則彗星拖尾的現象就會越長。⁴⁷由實驗結果可以發現隨著 濃度的增加彗星拖尾的現象也越來越長(圖 3-4-3)。由 DAPI 染色、

DNA 膠體電泳和彗星試驗的結果顯示，當 TSGH-8301 細胞被 Ellagic acid 處理過後 DNA 會出現受損的情形，而且是隨著處理藥物的時間 與濃度的增加，DNA 受損的現象就越來越嚴重。

當 DNA 受損時，細胞週期會停滯並先進行修復的動作。細胞週 期受到許多相關分子的調控，在 G0/ G1 期的部分就受到如:Cyclin D-CDK4/6 complex、Cyclin E-CDK2 complex、chk2、p21 與 p53 等蛋

91

白所調控。其中cyclin 與 cdk 必須要結合並形成 complex 才具有活化 下游基因的能力。當 DNA 受損時 p53 會受到刺激而增加表現。p53 是一種腫瘤抑制蛋白及轉錄因子。它可以調節細胞內的一些功能，

如：細胞週期的調控、DNA 的合成和修復、調控基因的轉錄、誘使 細胞死亡等 ⁵⁹當 p53 受到 DNA 受損的影響時，會被活化並誘使 p21 基因被轉錄並轉譯出 p21 蛋白。被活化的 p21 蛋白會去抑制 Cyclin D-CDK4/6 complex 與 Cyclin E-CDK2 complex 的形成，而造成細胞周 期的停滯⁶⁰ 。有研究指出 Ellagic acid 可使人類膀胱癌細胞株 T24²¹ 與子宮頸癌細胞株CaSki⁶¹的p21 與 p53 活化且使細胞週期停滯在 G1 期。也有研究指出Ellagic acid 可以誘使大鼠神經膠質瘤 C6 細胞株 p53 的活化¹⁰。在本研究中利用流式細胞儀分析細胞週期，結果顯示當隨 著處理藥物的濃度增加細胞週期族逐漸停滯在 G0/G1 期(圖 3-3-1)。

並且由西方墨點法的蛋白質分析(圖 3-10-1)可以明顯的看出 p53 與 p21 蛋白表現有明顯的增加，且 CDK2 表現有被抑制的情形。因此總 歸以上實驗顯示Ellagic acid 可以造成 TSGH-8301 細胞的細胞周期停 滯在G0/ G1 的現象。

由細胞型態的變化與 DNA 受損的實驗可以初步的觀察到 Ellagic acid 對 TSGH-8301 細胞所引起的凋亡現象。研究細胞凋亡非常有用 的工具之一就是流式細胞儀，我們可以藉由不同螢光染劑將細胞染

92

色，並觀察其細胞內各種物理或化學上的變化，如：鈣離子的濃度的 變化、粒線體膜電位的變化、活性氧化物質的增減、caspase 活性的 增加與磷脂質絲胺酸(phospholipid phosphatidylserine)的外翻等。而以 上所述現象有可能與細胞凋亡的過程有關⁵⁵。有回顧性文章指出，細 胞質內鈣離子的增加、活性氧化物質的增加與粒線體膜電位的下降都 可能會引起細胞凋亡³³。而實驗結果顯示，當利用Ellagic acid 去處理 TSGH-8301 細胞後，用流式細胞儀去檢測上述三種現象可以發現細 胞質內鈣離子與活性氧化物質的螢光量在 36 小時之前會先下降，36 小時會開始上升(圖 3-5-1 與圖 3-6-1)。而粒線體膜電位則是從 12 小 時就開始下降(圖 3-7-1)。此外我們也發現了隨著處理藥物時間的增 加，磷脂質絲胺酸的外翻也越來越明顯(圖 3-8-1)，最後測試了與粒線 體相關凋亡路徑中的caspase-9 與 caspase-3 的活性顯示在處理藥物之 後 caspase-9(圖 3-8-2)與 caspase-3(圖 3-8-3)的活性有上升的情形。由 流式細胞儀的實驗結果推論，Ellagic acid 引起 TSGH-8301 細胞凋亡 的路徑是經由粒線體相關路徑同時會引起caspase-9 與 caspase-3 的活 性的增加。此外利用 Quantitative PCR Analysis 分析 caspase-9 與 caspase-3 的 mRNA 表現也可以發現 Ellagic acid 會誘使 TSGH-8301 細 胞 的 caspase-9 與 caspase-3 之基因進行轉錄 (圖 3-12-1 與圖 3-12-2)。

93

在細胞凋亡的過程中，粒線體是非常重要的關鍵點，因為它能釋 放許多與 caspase 作用的蛋白 ⁶²。而細胞凋亡的內在路徑就是經由粒 線體釋放出存在於粒線體內的蛋白進入細胞質中。在粒線體內啟動細 胞凋亡活化的主要蛋白無疑地便是 cytochrome c。雖然有部分的 cytochrome c 會離開內膜上並移動，但在正常狀況下，多虧 cytochrome c 上的酸性磷酸根使得 cytochrome c 緊密的結合在粒線體的內膜上。

cytochrome c 在粒線體電子傳遞鏈中是不可或缺的要素，它將電子傳 遞於複合物III (complexes III)至 IV(complexes IV)，因此它在生命中 也是不可或缺的蛋白，所以當製造此蛋白的唯一基因產生缺陷時，會 導致胚胎的死亡 ⁶³。當它被釋放至細胞質中時，它驅動著 Apaf-1 (apoptosis-protease activating factor 1)與 caspase-9 集合成 caspase 活化 複合物又稱為｀apoptosome＇。 cytochrome c 在細胞質中可使 Apaf-1 重新排列與結合，每一個 Apaf-1 可在集合成複合物並導致它們的蛋

cytochrome c 在粒線體電子傳遞鏈中是不可或缺的要素，它將電子傳 遞於複合物III (complexes III)至 IV(complexes IV)，因此它在生命中 也是不可或缺的蛋白，所以當製造此蛋白的唯一基因產生缺陷時，會 導致胚胎的死亡 ⁶³。當它被釋放至細胞質中時，它驅動著 Apaf-1 (apoptosis-protease activating factor 1)與 caspase-9 集合成 caspase 活化 複合物又稱為｀apoptosome＇。 cytochrome c 在細胞質中可使 Apaf-1 重新排列與結合，每一個 Apaf-1 可在集合成複合物並導致它們的蛋

在文檔中 中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/32483 (頁 89-118)