中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/32483
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(3) 中文摘要 Ellagic acid (EA)是存在莓類、水果和堅果中的一種多酚類化合 物。在過去的研究中顯示可以抑制癌症的生長與促使癌症細胞的凋 亡。雖然 EA 已經被研究指出具有抗癌的活性，卻沒有明確的證據指 出可以誘發人類膀胱癌細胞 TSHG-8301 的細胞凋亡。因此在本論文 中探討 EA 是否可以誘發膀胱癌細胞 TSHG-8301 的細胞凋亡。首先 我們利用 MTT assay 測試處理完不同濃度的 EA 並培養不同時間後的 細胞存活率。我們也利用的流式細胞儀去偵測細胞中的細胞週期、粒 線體膜電位變化、活性氧基群的表現、以及細胞質中鈣離子濃度的變 化，最後再利用流式細胞儀去偵測 caspase-3 的活性與 Annexin V 親 和力分析，藉此進一步的確認細胞凋亡的現象。實驗結果顯示 EA 可 以抑制細胞的生長。EA 也會使細胞中的粒腺體膜電位下降，並且造 成 DNA 的與染色體凝集。由西方墨點法分析發現 Bid 與 Bax 表現明 顯的增加，同時也發現 cytochrome c、AIF 與 Endo G 由粒線體中釋 放出來並造成下游路徑的活化並造成細胞凋亡。總觀以上結果我們認 為 EA 可以引起粒線體功能的缺失並導致細胞毒性，且使粒線體膜電 位下降與引起 DNA 的損傷最後導致細胞死亡。 關鍵字: Ellagic Acid、粒線體、TSGH-8301 細胞、細胞凋亡.
(4) 英文摘要 Ellagic acid (EA), a polyphenolic compound which was found in berries, fruits and nuts, has been shown to possess growth inhibition and apoptosis promoting activities in cancer cell lines. Although EA has been reported with anticancer activity, there are no direct evidences for EA induces apoptosis in human bladder carcinoma TSGH-8301 cells. In this study, we investigated EA whether or not can induce apoptosis in TSGH-8301 cells. We use MTT assay to determine cell viability from TSGH-8301 cells after treated with different doses of EA and for various time periods. We also used the flow cytometry to examine the levels of mitochondrial membrane potential, the production of reactive oxygen species and the levels of calcium ion after TSGH-8301 cells treated with various doses of EA. Finally, we used the flow cytometry to examine caspase-3 activity and Annexin V affinity assay for apoptosis. Our results indicated that the proliferation of TSGH-8301 cells was inhibited after treated with EA (50M) for 48 hours. EA also caused decreased the levels of MMP in TSGH-8301 cells. In nuclear, we seen the chromatins began to condense in TSGH-8301 cells after EA (50M) treated for 24 hours. Then, DNA was damaged after EA treated for 48 hours. In Western blotting assay, we found Bid and Bax were expressed and cytochrome c, AIF and Endo G were released from mitochondria and activated downstream pathway to cause cell apoptosis. In conclusion, we suggest that EA caused the dysfunction of mitochondria followed by causing cytotoxicity, DNA damaged and MMP decreased, then led to cell death. Keywords: Ellagic Acid, Mitochondria, TSGH-8301 cells, Apoptosis.
(5) 誌謝 兩年的碩士班研究生生涯不算長也不算短，但在這兩年內我學到 了許多新的事物。從一個完全部會做實驗的大學生，慢慢地學著一個 接著一個的新實驗，直到現在成為學了許多實驗的研究生。不僅僅學 到了實驗上的技巧，在研究生活的經驗中學到了待人處事的道理。 而碩士班兩年內最重要的是遇到能夠讓我獲益匪淺的良師益友 們。首先感謝鍾景光老師為我提供如此優質的實驗環境與指導，有老 師對我們的支持，我們才能夠順利的進行實驗。鍾景光老師雖然身上 的事務十分繁重，但仍不時無刻的關心我們的實驗。三不五時的也會 提醒我們的實驗進度。同時我也很感謝楊家欣老師與黃雯雯老師在實 驗上適時的提供幫助。 感謝實驗室中的學長姐:啟程、若華與鈞隆，他們不厭其煩地替 我解決實驗上的問題。也感謝實驗室的同伴們。因為有老師們與實驗 室的同伴們我才能夠完成我的論文。感謝林仁混老師、王朝鐘老師、 鍾景光老師、陳柏源老師與楊家欣老師在百忙之中抽空來為我口試。 最重要的就是要感謝我的父母親，他們無怨無尤地為我的付出更 是讓我永遠銘記在心。最後，謹以此文獻給我摯愛的雙親。.
(6) 總目錄 總目錄 ---------------------------------------------------------------------------- I 表目錄 --------------------------------------------------------------------------- V 圖目錄 -------------------------------------------------------------------------- VI 縮寫表 -------------------------------------------------------------------------- IX 第一章 前言 --------------------------------------------------------------------- 1 第一節 研究背景 -------------------------------------------------------- 1 一、 惡性腫瘤之介紹 --------------------------------------------- 1 二、 膀胱癌(Bladder cancer)之介紹 --------------------------- 4 三、 鞣花酸 (Ellagic acid)之介紹 ------------------------------ 6 四、 細胞凋亡之介紹 --------------------------------------------- 8 五、 內質網壓力 (endoplasmic reticulum stress)之介紹 -- 12 六、 細胞週期 (cell cycle)之介紹------------------------------ 15 第二節 研究目的 -------------------------------------------------------- 17 第二章 材料與方法 --------------------------------------------------------- 18 第一節 實驗材料 -------------------------------------------------------- 18 一、 細胞來源 ---------------------------------------------------- 18 二、 藥品試劑 ---------------------------------------------------- 18 三、 儀器設備 ---------------------------------------------------- 21 I.
(7) 第二節 實驗方法 -------------------------------------------------------- 23 一、 藥物 Ellagic acid 的配製 ---------------------------------- 23 二、 人類膀胱癌細胞 TSGH-8301 細胞培養 --------------- 23 三、 細胞的冷凍保存 ------------------------------------------- 25 四、 冷凍細胞的活化 ------------------------------------------- 25 五、 細胞存活率分析 ------------------------------------------- 26 六、 細胞週期 (Cell cycle) ------------------------------------ 27 七、 彗星試驗 (Comet assay) ---------------------------------- 29 八、 細胞核質濃縮現象 ---------------------------------------- 31 九、 DNA 膠體電泳(DNA gel electrophoresis) -------------- 32 十、 活性氧物質 ------------------------------------------------- 34 十一、粒線體膜電位(Mitochondrial membrane potential, MMP)變化 -------------------------------------------------- 35 十二、鈣離子 (Ca2+)釋出之檢測 ------------------------------- 37 十三、西方點墨法 (Western blotting) ------------------------- 38 十四、免疫螢光染色 ---------------------------------------------- 43 十五、Annexin V affinity assay ----------------------------------- 44 十六、Caspase-3 活性分析 --------------------------------------- 45 十七、Quantitative PCR Analysis -------------------------------- 46 十八、統計分析 ---------------------------------------------------- 48 II.
(8) 第三章 研究結果 ------------------------------------------------------------- 49 第一節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞生長影響 ---------------- 49 第二節 Ellagic acid 對老鼠正常細胞株 A10 毒性的影響 -------- 52 第三節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞週期的影響 ------------- 54 第四節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞 DNA 損傷的影響 ----- 57 一、 DAPI 染色法 ------------------------------------------------ 57 二、 彗星試驗 (Comet assay) ---------------------------------- 60 三、 DNA 膠體電泳 (DNA gel electrophoresis) ------------ 62 第五節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞產生活性氧物質能力 的影響 ---------------------------------------------------------- 64 第六節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞內鈣離子 (Ca2+)釋出 的影響 -------------------------------------------------------- 66 第七節 E l l a g i c a c i d 對 T S G H - 8 4 0 1 細 胞 粒 線 體 電 位 (Mitochondrial membrane potential, MMP)的影響 ------ 68 第八節 Ellagic acid 誘導 TSGH-8401 細胞產生細胞凋亡的影響 --------------------------------------------------------------------- 70 一、 Annexin V affinity assay --------------------------------- 70 二、 Caspase activity assay ------------------------------------ 72 第九節 以西方墨點法探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞產 生細胞凋亡之相關蛋白表現 ----------------------------- 75 III.
(9) 第十節 以西方墨點法探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞的 細胞週期之相關蛋白表現 --------------------------------- 81 第十一節 利用免疫螢光染色探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細 胞中凋亡相關蛋白之表現與轉移之影響 ---------------- 83 第十二節 以 Quantitative PCR Analysis 探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞產生凋亡相關蛋白之 mRNA 表現 ---87 第四章 討論 -------------------------------------------------------------------- 89 第五章 結論 ------------------------------------------------------------------- 98 第六章 參考文獻 ------------------------------------------------------------- 99. IV.
(10) 表目錄 表 2-2-1 Cell cycle 之 PI 染劑 ----------------------------------------------- 28 表 2-2-2 SDS-PAGE 下層膠 (Separating gel)之配置與組成 --------- 41 表 2-2-3 SDS-PAGE 上層膠 (Stacking gel)之配置與組成 ------------ 41 表 2-2-4 電泳緩衝液 (Electrophoresis rinning buffer) --------------- 41 表 2-2-5 轉漬緩衝液 (Transfer buffer) --------------------------------- 42 表 2-2-6 Quantitative PCR 所使用之 primer ------------------------------ 47 表 3-12-1 mRNA 定量分析表 ---------------------------------------------- 87. V.
(11) 圖目錄 圖 1-1-1 鞣花酸 (Ellagic acid)化學結構式 ------------------------------- 7 圖 1-1-2 細胞死亡的三種方式 -------------------------------------------- 10 圖 1-1-3 經由外在、內在與其它相關的凋亡路徑 --------------------- 11 圖 1-1-4 內質網壓力反應誘使細胞走向存活之路徑------------------ 14 圖 1-1-5 內質網壓力誘導細胞走向凋亡之路徑------------------ 14 圖 2-2-1 細胞培養之簡易意示圖 ----------------------------------------- 24 圖 2-2-2 蛋白質轉漬順序 -------------------------------------------------- 42 圖 3-1-1 TSHG-8301 細胞經不同濃度 Ellagic acid 處理 24 小時後 細胞型態之變化 ------------------------------------------------- 49 圖 3-1-2 TSHG-8301 細胞經不同濃度 Ellagic acid 處理 48 小時後 細胞型態之變化 ------------------------------------------------- 50 圖 3-1-3 EA 對於 TSGH-8301 細胞之細胞存活率的影響 ----------- 51 圖 3-2-1 EA 對正常細胞 A10 與 TSGH-8301 存活率的影響 ------ 53 圖 3-3-1 不同濃度 EA 處理 TSGH-8301 細胞 48 小時後，細胞周期 之變化 ------------------------------------------------------------- 55 圖 3-3-2 TSGH-8301 細胞以 25μM 的 EA 處理後，細胞週期之變 化 ------------------------------------------------------------------- 56 圖 3-4-1 EA 對於 TSGH-8301 細胞之染色體凝集的影響-------------- 58 VI.
(12) 圖 3-4-2 DAPI 螢光量之量化圖 ------------------------------------------- 59 圖 3-4-3 EA 對於 TSGH-8301 細胞之 DNA 產生受損的影響 -------- 61 圖 3-4-4 EA 對於 TSGH-8301 細胞之 DNA 產生斷裂的影響 -------- 63 圖 3-5-1 EA 對於 TSGH-8301 細胞活性氧化物質(ROS)產生的影響 ---------------------------------------------------------------------- 65 圖 3-6-1 EA 對 TSGH-8401 細胞內鈣離子(Ca2+)釋出的影響 -------- 67 圖 3-7-1 EA 對 TSGH-8401 細胞粒線體電位的影響 ------------------- 69 圖 3-8-1 EA 誘導 TSGH-8401 細胞產生細胞凋亡的影響 ------------- 71 圖 3-8-2 EA 對於 TSGH-8301 細胞 caspase-9 活性的影響 ------------ 73 圖 3-8-3 EA 對於 TSGH-8301 細胞 caspase-3 活性的影響 ------------ 74 圖 3-9-1 粒線體路徑之凋亡相關蛋白表現變化 ----------------------- 76 圖 3-9-2 存於粒線體內之凋亡相關蛋白變化 -------------------------- 77 圖 3-9-3 與粒線體相關內在路徑之凋亡相關蛋白表現變化 -------- 78 圖 3-9-4 外在路徑之凋亡相關蛋白表現變化 -------------------------- 79 圖 3-9-5 抗凋亡相關蛋白表現變化 -------------------------------------- 80 圖 3-10-1 細胞週期相關蛋白表現變化 --------------------------------- 82 圖 3-11-1 EA 對於 TSGH-8301 細胞內 cytochrome c 的表現與轉移 的影響 ------------------------------------------------------------- 83 圖 3-11-2 EA 對於 TSGH-8301 細胞內 Smac/DIABLO 的表現與轉. VII.
(13) 移的影響 ---------------------------------------------------------- 84 圖 3-11-3 EA 對於 TSGH-8301 細胞內 Endo G 的表現與轉移的影 響 ------------------------------------------------------------------- 85 圖 3-11-4 EA 對於 TSGH-8301 細胞內 AIF 的表現與轉移的影響 ------------------------------------------------------------------------ 86 圖 3-12-1 EA 對於 TSGH-8401 細胞 caspase-9 mRNA 表現的影響 ---------------------------------------------------------------------- 88 圖 3-12-2 EA 對於 TSGH-8401 細胞 caspase-3 mRNA 表現的影響 ------------------------------------------------------------------------ 88 圖 5-1. Ellagic acid 誘導人類膀胱癌細胞株 TSGH-8301 細胞凋 亡之路徑模式圖 ------------------------------------------------ 98. VIII.
(14) 縮寫表 AIF︰Apoptosis-inducing factor Apaf-1︰apoptosis-protease activating factor 1 APS︰Ammonium persulfate CDK︰cyclin-dependent kinase DMSO︰Dimethylsulfoxide EA︰Ellagic acid Endo G︰Endonuclease G FasL︰Fas Ligand FBS︰Fetal bovine serum MMP︰mitochondrial membrane potential IAPs︰inhibitor of apoptosis proteins PBS︰Phosphate buffer Saline ROS︰Reactive oxygen species. IX.
(15) 第一章 前言 第一節 研究背景 一、惡性腫瘤之介紹 隨著科技的日新月異，國人的生活品質也大幅的被改善。因此人 們的平均壽命也隨之增加。然而在平均壽命增加的背後，人們的文明 病也與日俱增。最眾所皆知的疾病就是惡性腫瘤了。根據行政院衛生 署從 75 年至 97 年統計中，惡性腫瘤一直是導致國人的十大死因中排 名第一 1。根據世界衛生組織公布在 2004 年全球就有 740 萬人口死於 癌症，占全球死亡人數的 13%。世界衛生組織預估未來因癌症死亡的 人會越來越多，在 2030 年就有 1200 萬人口可能因癌症而死亡 2。 惡性腫瘤，也就是癌症，是一群生長不受控制的細胞所形成的腫塊。 腫塊會不斷的生長並且影響到周邊器官的正常功能，進而使得人體的 機能喪失而死亡。而且腫瘤細胞會經由浸潤 (invasion)或經由淋巴管 轉移 (metastasis)到別的器官或組織 3。由於轉移的現象無法去正確地 被偵測，因此對於根治癌症上更是難上加難。 癌症都有可能發生在任何的年齡層，但是隨著年齡得增加罹患癌 症的風險也就越大。除了年齡的增長所造成的風險外，長期具有不良 的生活習慣，或是處在危險的工作環境中都是發生癌症的高危險群。 最常見的不良生活習慣，如暴飲暴食、作息不正常、抽菸酗酒等這些 1.
(16) 習慣都有可能造成癌症的形成，而長時間處於危險的工作環境，如揮 發性有機顏料、染髮劑、輻射線等也是造能癌症發生的原因之一。以 上所指出的原因常常使細胞的遺傳物質損傷或是突變，而使得原致癌 基因 (proto-oncogene)轉變成致癌基因 (oncogene)，而使得細胞的生 長不被控制進而形成腫瘤 4。 現今醫學上治療癌症的方法有手術、放射線治療、免疫療法、標 定藥物治療、化學療法、荷爾蒙療法、抗血管新生等等。雖然有許多 治療癌症的方法，但是都具有相當大的風險與後遺症。例如利用手術 雖然可以切除腫瘤，但是常常會因為癌細胞清除不完全而復發癌症、 放射線治療最常見的副作用就是毛髮脫落、產生疲倦感與傷害表皮細 胞等，因此越來越多的科學家開始尋求天然且對人體副作用較小的天 然化合物或成分。例如從大蒜中萃取的 diallyl trisulfide 可經由 Bak 與 Bax 的活化路徑引起肺癌細胞株 H358 的細胞凋亡 5。由植物中黃酮類 (flavonoid)所衍生出來的 Quercetin 被發現會誘發乳癌細胞株 MCF-7 活性氧化物質的產生並使 AMPK 與 Apoptosis signal-regulating kinase (ASK)-1 的活化，而引起其細胞凋亡 6。由末食子中發現的 gallic acid 也有研究指出可對抗多種癌症，如︰可誘使異種移植至實驗動物上的 肺癌細胞株 LL-2 的生長 7；也可以抑制子宮頸癌細胞株 HeLa 的生長 並使之細胞凋亡 8。 2.
(17) 在天然藥物慢慢的被重視的同時，鞣花酸 (Ellagic acid)也被認為 是具有抑制癌症增生的活性 9。但其抑制之機制仍不甚明瞭，因此本 研究以 Ellagic acid 做為研究對象，探討其對癌細胞所造成的影響與 其機制。. 3.
(18) 二、膀胱癌 (Bladder cancer)之介紹 膀胱癌顧名思義是發生在膀胱組織的癌症，依組織可分為移形上 皮細胞癌 (transitional cell carcinoma, or TCC)、鱗狀上皮細胞癌 (squamous cell carcinomas)、腺性上皮癌 (adenocarcinomas)。移形上 皮細胞癌為佔所有膀胱癌最多的一種；佔約 90%，鱗狀上皮細胞癌與 腺性上皮癌分別佔約 8%與 2%10。膀胱癌真正發生的原因仍不清楚， 但是仍有幾種可能是會導致膀胱癌的原因，包括抽煙、工作環境暴露 在致癌物質下如橡膠、化學製劑、皮革製造業、染髮劑等、喜食肉類 與高脂肪食物、遭到感染等。膀胱癌的最主要的症狀是血尿，尤其是 不具有疼痛感的血尿、頻尿、解尿時感到疼痛。膀胱癌的治療因疾病 進展程度的不同而有很大差異，一般癌細胞侵犯程度的不同而區分為 以下各期，而有不同的治療的方式： 零. 期：癌細胞只限於黏膜。此時經尿道切除或電燒膀胱腫瘤；術後. 再加上膀胱內灌藥治療即可。八成患者可行這種簡單手術達到良好療 效。 第一期： 侵犯到黏膜下層，但未達到肌肉層，治療與零期同。 第二期： 腫瘤已侵犯肌肉層，但未達到軟部組織。此時可施行經尿 道切除術、膀胱部份切除或全切除，視侵犯大小不同而定。 第三期： 腫瘤已超過肌肉層，而擴及漿膜層和周圍脂肪，但未達周 4.
(19) 圍其他器官，無淋巴腺轉移。此時必須將膀胱根除性切除，加上尿路 改道手術或放射線治療或全身性化學治療。 第四期： 腫瘤已侵犯其他器官，或有淋巴腺及器官轉移。此時只能 靠放射線治療或化學療法。膀胱全切除後，目前可用迴腸來替代，甚 至改作一個新膀胱 11。 預防重於治療，因此預防膀胱癌的發生是相當重要的。以下是關 於預防膀胱癌所要注意的事項。不吃含有防腐劑和化學物質的食物， 可能附有農藥的食物務必要洗淨。每天應多喝水，尿量維持二千西西 以上可減低致癌物質在膀胱的濃度。不要養成憋尿習慣，最好每小時 排尿一次，排尿愈頻繁，致癌可能性愈小。每天服用維生素 A、C 和 B6。不吸菸、少染髮、少接觸染料及有機溶劑 11。. 5.
(20) 三、鞣花酸 (Ellagic acid)之介紹 鞣花酸是屬於一種多酚類的抗氧化劑，它在許多水果跟蔬菜中被 發現，例如石榴、胡桃、蔓越莓、草莓跟覆盆子等。在植物中，植物 會產生鞣花酸並且會將它轉換成單寧酸 (tannin)。而當植物被食用 時，單寧酸上的糖配體 (glucosides)會被迅速的水解並產生鞣花酸。 鞣花酸(圖 1-1-1)是屬於單寧酸的主要結構成分，而那些單寧酸同時也 會產生另一種單寧酸如沒食子單寧 (gallotannins)。因此這些單寧被水 所水解的時候就會產生鞣花酸跟沒食子酸 (Gallic acid) 動物實驗中被證明具有抗氧化. 12. 。鞣花酸在. (antioxidant) 與 抗 增 生. (antiproliferative)的能力 13。在之前的研究報告指出鞣花酸可避免一些 致 癌 物 質 如 亞 硝 酸 (nitrosamines)14 、 多 環 類 芳 香 族 碳 氫 化 合 物 (polycyclic aromatic hydrocarbons)15 等去結合到 DNA 上面，而導致 DNA 的傷害。就如同其他多酚類的化合物，鞣花酸在細胞中可以藉 由減少氧化壓力而達到化學保護的效果 16。 近年來鞣花酸在抗癌上的研究陸續的被發表。鞣花酸可抑制神經 膠瘤 (glioma)的生長. 10. 。誘發人類黑色素瘤 (human melanoma cell). 的細胞凋亡 17。藉由與橡黃素 (quercetin)共同的作用而誘使人類血癌 (human leukemia cells)的細胞週期停滯與細胞凋亡 18。鞣花酸也會影 響人類神經母細胞瘤 (human neuroblastoma cells)的細胞貼附與生長 6.
(21) 19. 。鞣花酸會抑制胰腺癌 (pancreatic cancer cell)中 NF-B 進而誘導細. 胞凋亡 20。鞣花酸藉由使人類膀胱癌細胞株 T24 的 p21 與 p53 的蛋白 表現並使其細胞週期停滯在 G1 期與細胞凋亡 21。鞣花酸也可以在人 類結腸癌細胞株 Caco-2 中調控 MAPK 的訊號傳遞與細胞週期的停滯 22. 。另外鞣花酸也會抑制 PDGF 和 VEGF receptors 的表現 23。根據以. 上的研究報告顯示，鞣花酸對於抗癌的功效上是非常有潛力的，因此 本論文探討鞣花酸對於人類膀胱癌細胞株 TSGH-8401 是否有抗癌效 果與其相關機制。. 圖 1-1-1 鞣花酸 (Ellagic acid)化學結構式. 7.
(22) 四、細胞凋亡之介紹 當細胞受到外在的影響，如藥物、胞器傷害、生長環境的改變等 時而使得細胞的 DNA 受到傷害，當傷害無法被修復時，細胞會漸漸 的走向死亡。細胞的死亡有分三種，分別是細胞凋亡 (apoptosis)、細 胞自噬 (autophagy )24 與細胞壞死 (necrosis)。(圖 1-1-2)細胞凋亡又稱 為程序性細胞死亡，顧名思義細胞死亡的過程是被調控的而且是有順 序性的。細胞凋亡常常牽扯著很多的訊息途徑(圖 1-1-3)，訊息傳遞途 徑 又 粗 分 為 外 在 路 徑 (extrinsic cell death signling) 與 內 在 路 徑 (intrinsic cell death signling)。內在路徑是藉由粒線體或內質網所引起 的一連串反應 25-26。 其中最重要調節者的為 Bcl-2 蛋白家族 27，Bcl-2 蛋白家族根據功能又分為抑制凋亡蛋白 (anti-apoptosis)與促進凋亡 蛋白 (pro-apoptosis)。抑制凋亡蛋白有 Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-l 等，而 促進凋亡蛋白有 Bax、Bad、Bid、Bak、Bcl-Xs、Bim 等。以粒線體 路徑為例，當細胞受到刺激時 Bax 會轉移至粒線體膜上引起膜電位下 降，Cytochrome c 會釋放到細胞質中。Cytochrome c 會引起 Caspase-9 的活性進而去活化下游的 Caspase-3 活性並引起細胞凋亡 28。除此之 外粒線體也會釋放出 Apoptosis-inducing factor (AIF)與 Endonuclease G (Endo G)這兩種蛋白會直接進入細胞核中對 DNA 進行裂解，而引 起細胞凋亡 28。 8.
(23) 除了內在路徑外，另一條路徑便是外在路徑。外在路徑又稱為死 亡受器路徑。此條路徑主要是由死亡接受體 (death receptors,DRs)所 調控。舉例來說 Fas (CD95)是腫瘤壞死因子接受器的一員，當 Fas 與 其對應的配體 (ligand)Fas Ligand (FasL)結合後會啟動下游蛋白的一 連串反應，最後將 Caspase-8 裂解使之活化。活化的 Caspase-8 再使 Caspase-3 活化而導致細胞凋亡. 29. 。另外活化的 Caspase-8 也會活化. Bid，Bid 會活化 Bax 使之在粒線體上形成孔洞而使得粒線體膜電位 下降，同樣的會使得細胞死亡 30。 不論是外在路徑或內在路徑都會引起 caspase 蛋白家族的活性， 因此 caspase 蛋白家族在細胞凋亡的過程中扮演著相當重要的角色。 caspase 又稱為 cysteine-aspartic proteases (Cysteine dependent aspartate specific protease, 蛋白水解酵素)。一般情況下，caspase 是不具有活性 的存在細胞中 (又稱為 pro-caspase)，當細胞因為開始進行細胞凋亡而 使得這一系列的蛋白被活化時，會先被裂解並變成活化態。被裂解的 Caspase 又會去活化下游的 caspase 並使之裂解成活化態。被裂解的 Caspase 又再進一步的分解其它的 pro-caspase 形成一連串的訊息傳遞 (caspase cascade)，最後形成死亡受質 (death substrate)導致 DNA 產生 斷裂並使細胞的死亡 31。. 9.
(24) 圖 1-1-2 細胞死亡的三種方式 32. 10.
(25) 圖 1-1-3 經由外在、內在與其它相關的凋亡路徑 33 11.
(26) 五、內質網壓力 (endoplasmic reticulum stress)之介紹 細胞內有三分之一得蛋白會轉移至內質網內 34。內質網對於轉譯 出來的蛋白摺疊至合適的第三級結構是相當重要的。當內質網的功能 受到內在或外在的刺激時稱之為內質網壓力。這些刺激包含做醣蛋白 的醣類修飾 (glycosylation)被抑制、雙硫鍵被還原、鈣離子由內質網 內部被釋放出、將蛋白轉移至高基氏體 (Golgi)的傳輸蛋白受到損害 與突變後的蛋白於內質網中表現。細胞處於內質網壓力下，未折疊的 蛋白會累積在內質網中，而這會引起兩種相對的情形產生；細胞凋亡 或存活。 當未摺疊的蛋白累積在內質網中時，內質網會啟動自我防衛機制 稱為內質網壓力反應 (ER stress responses)，此反應使細胞可在內質網 壓力下存活。在真核細胞中，內質網的自我防衛機制包含︰(1) 降低 轉譯速度已減少未折疊蛋白繼續累積於內質網中. 35. 。 (2) 促 使. chaperone (如︰BiP/GRP78 與 GRP94)的基因進行轉錄 36。(3) 內質網 所誘導的降解 (ER-associated degradation；ERAD)，將未摺疊蛋白移 至細胞質中並利用 26S proteasome 將之降解。以便回復內質網摺疊蛋 白的能力. 37. 。而這些反應主要由內質網膜上之接受器︰ATF6、IRE1. 和 PERK 所誘導。當不良摺疊蛋白累積於內質網中時，內質網中的感 測器如: ATF6、IRE1 和 PERK 便會被活化並誘使內質網壓力反應。 12.
(27) IRE1、 ATF4 與 ATF6 會使內質網目標基因的轉錄活化。PERK-eIF2 pathway 則會調控轉譯並降低轉譯速度。IRE1–XBP1 pathway 則會去 調控 ERAD pathway 使內質網摺疊蛋白的能力回復(圖 1-1-4)。 當自我防衛機制無法有效降低內質網壓力時，細胞便會走向細胞 凋亡使受內質網壓力而受損的細胞遭到摧毀。有研究報告指出 CHOP38、caspase-1239、Bax/Bak40、IRE141 和 MAP kinase cascade42 與 內質網壓力所引起的細胞凋亡有關。內質網壓力造成的細胞凋亡主要 由 CHOP 的誘導、caspase-12 與 ASK1–JNK pathway 的活化與 Bax/Bak 引起內質網內鈣離子濃度的改變所誘導(圖 1-1-5)。. 13.
(28) 圖 1-1-4 內質網壓力反應誘使細胞走向存活之路徑 43. 圖 1-1-5 內質網壓力誘導細胞走向凋亡之路徑 43 14.
(29) 六、細胞週期 (cell cycle)之介紹 細胞週期可分為四個階段，分別為 G1 (G 代表 gap)、S、G2、M phase (M 代表 Mitosis)，而細胞在進入 G1 phase 前會有一段維持不分 裂的狀態稱為 G0 phase。在 G1 phase，細胞會開始合成酵素以提供下 一階段 S phase 所使用。細胞週期進入 S phase 後 DNA 開始複製，也 就是染色體複製 44。DNA 合成完便進入 G2 phase。在 G2 phase 中， 細胞繼續合稱分裂所需物質，例如:有絲分裂時所需的 microtubules。 接下來進入 M phase，M phase 又可分為五個期，分別為 prophase (前 期)、 metaphase (中期)、 anaphase (後期)、cytokinesis (細胞質分裂期)、 telophase (末期)。細胞分裂完後會離開細胞週期並停止分裂以等待下 次分裂的開始，此時稱為 G0 phase。 細胞週期主要受到 CDK (cyclin-dependent kinase)與 cyclins 所調 控，它們會形成複合物使得 G1 phase 進入 S phase 或 G2 phase 進入 M phase。cyclin D 與 CDK4 及 CDK6 的結合主要於 G1 phase 的中期至 晚期作用，在 G1 phase 晚期則由 cyclin E 與 CDK2 所調控。S phase 至 G2 phase 由 cyclin A 與 CDK2 所調控，cyclin A 及 cyclin B 與 CDK1 會作用在 G2 至 M 期。 當細胞 DNA 複製出現異常或受損時，細胞會藉由啟動 checkpoint 的機制中斷細胞週期。Checkpoint 可分為(1) Intra-S phase checkpoint： 15.
(30) 進入 M phase 之前確認所有的 DNA 都已複製；(2) Spindle-assembly checkpoint：確認紡綞絲的微管蛋白是否結合至 Kinetochore (著絲點)； (3) Spindle-position checkpoint：確認所有的染色體是否都已準備好分 裂；(4) DNA-damage checkpoint：偵測細胞週期中 DNA 的受損，並 誘使細胞週期停滯並修復。. 16.
(31) 第二節 研究目的. 關於 Ellagic acid 在抗癌的應用上已經出現初步的結果，其中的 機制已經慢慢的被發現。但未有研究指出 Ellagic acid 對於人類膀胱 癌細胞株 TSGH-8401 的抗癌效果與機制。因此本研究利用 Ellagic acid 在體外測試與探討人類人類膀胱癌細胞株 TSGH-8401 經由 Ellagic acid 處理後，Ellagic acid 所引起的細胞凋亡與生長抑制的反應及相關 的機制。. 17.
(32) 第二章 材料與方法 第一節 實驗材料. 一、 細胞來源. 本論文實驗所使用的細胞為人類膀胱癌 (Human bladder cancer) 細胞株 TSGH-8401，購自新竹食品工業發展研究所 (Food Industry Research and Development Institute). 二、 藥品試劑 1. 10X TG-SDS buffer：購自 Amresco 2. 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodine (DiOC6)：購自 calbiochem 3. 40% Acrylamide/Bis (29:1)：購自 Amresco 4. Agarose：購自 MD 生化有限公司 5. Ammonium persulfate (APS)：購自 Amresco 6. Annexin V-FITC apoptosis detection kit：購自 BD 7. Benzyl isothiocyanate：購自 Sigma Chemical Co. 8. BioMax Flim：購自 Kodak 9. Bovine serum albumin (BSA)：購自 Merck 10. Dimethyl sulfoxide (DMSO)：購自 Sigma Chemical Co. 11. Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)：購自 Merck 18.
(33) 12. Ellagic acid：購自 Fluka 13. ELC kit (Enhanced chemiluminescent kit)：購自 Amresco 14. Ethanol：購自 TEDIA 15. Fetal bovine serum (FBS)：購自 Invitrogen 16. Formaldehyle：購自 Sigma Chemical Co. 17. Glycine ：購自 Amresco 18. L-Glutamine：購自 Invitrogen 19. Low melting agarose (LMA)：購自 USB 20. Methanol：購自 TEDIA 21. Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) ：購自 Amresco 22. N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)：購自 Amresco 23. Normal melting agarose (NMA)：購自 USB 24. Penicillin-Streptomycin (PS)：購自 Invitrogen 25. Phenethyl isothiocyanate：購自 Sigma Chemical Co. 26. PhiPhiLux® kit：購自 OncoImmunin (Gaithersburg, MD, USA) 27. Potassium chloride (KCl)：購自 Merck 28. Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ：購自 Merck 29. Propidium iodide (PI)：購自 Sigma Chemical Co. 19.
(34) 30. Protein assay-Dye reagent concentrate：購自 Bio-Rad 31. Protein extraction solution (PRO-PREP) ：購自 iNtRON Biotechnology, Inc. 32. Protein marker：購自 Fermentas 33. RNase A (Ribonuclease A) ：購自 Amresco 34. RPMI-1640 medium ：購自 Invitrogen 35. Sodium chloride (NaCl) ：購自 Merck 36. Sodium dodecyl sulfate (SDS) ：購自 Amresco 37. Tris (Tris(hydroxoymethyl)-aminomethane) ：購自 Amresco 38. Triton X-100：購自 Sigma Chemical Co. 39. Trypan Blue：購自 Sigma Chemical Co. 40. Trypsin-EDTA：購自 Sigma Chemical Co. 41. Tween-20：購自 Amresco 42. 顯影劑：購自 Kodak 43. 定影劑：購自 Kodak 44. Primary antibody (1°antibody) (1) Anti- actin：購自 Sigma Chemical Co. (2) Anti-AIF：購自 BD (3) Anti-Apaf-1：購自 Calbiochem 20.
(35) (4) Anti-Bak：購自 Cell Signaling Technology (5) Anti-Bax：購自 upstate (6) Anti-Bcl-2：購自 biovision (7) Anti-Bcl-XL：購自 Santa cruz (8) Anti-Bid：購自 Chemicon (9) Anti-Caspase-3：購自 Sigma Chemical Co. (10) Anti-Caspase-9：購自 biovision (11) Anti-Cytochrome c：購自 biovision (12) Anti-Endo G：購自 Santa cruz (13) Anti-Smac/Diablo：購自 Cell Signaling Technology (14) Anti-XIAP：購自 Santa cruz 45. Secondary antibody (2°antibody) (1) Goat anti-mouse IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody：購自 Chemicon (2) Goat anti-rabbit IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody：購自 Chemicon (3) Goat anti-sheep IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody：購自 Chemicon 三、 儀器設備 1. 無菌操作台、細胞培養皿、細胞培養箱、冷凍管、恆溫離心機、 21.
(36) 血球計數版、倒立式顯微鏡、Dispenser、1.5/ 15/ 50 mL 離心機、 Pipetmen。 2. 去離子水製造機、電源供應器、酸鹼值測定器 (pH meter)、PVDF menbrane、震盪器、SDS-PAGE 電泳槽套組、Transfer Cell Bolt Kit、 加熱板。 3. 流式細胞儀、高速離心機、酵素免疫分析儀、單細胞電泳槽。. 22.
(37) 第二節 實驗方法. 一、藥物 Ellagic acid 的配製 Ellagic acid 為固體藥物。Ellagic acid 的分子量為 338.23，純度為 98%以上。利用 DMSO 為溶劑配置成 7.5 mM 的庫存液 (stock solution)，並分裝於 1.5 mL 微量離心管。庫存液儲存於-20 C 冰箱中 備用，於每次實驗前利用 DMSO 稀釋成所需之濃度。. 二、人類膀胱癌細胞 TSGH-8301 細胞培養 TSGH-8301 所使用之培養基為 RPMI-1640 medium，額外添加胎 牛血清 (FBS)、抗生素 (PS)與 L-Glutamine，使細胞培養基最終含有 10% FBS、1% PS 與 2 mM L-Glutamine。培養箱環境具有 5% CO2 與 37 C 的溫度。每隔 2 天換一次培養基，等細胞八分滿時進行繼代或 分盤做實驗。 由於 TSGH-8401 為貼附型細胞，因此每次繼代或分盤時需要利用 Trypsin-EDTA 將細胞懸浮。首先要利用磷酸緩衝液 (Phosphate buffer saline, PBS)清洗細胞，再加入 2~3 mL 的 0.5 mg/mL Trypsin-EDTA。 等待 3~5 分鐘，當細胞完全懸浮時，加入培養基以終止 Trypsin-EDTA 的反應。接著取出細胞至離心管中，並離心 1500 rpm，5 分鐘。離心 完後去除上清液，加入培養基稀釋細胞。取出稀釋後的細胞種至新的 23.
(38) 培養瓶中進行繼代。剩餘的細胞則是利用血球計數盤與 Trypan blue 來計算細胞數。Trypan blue 可以染死細胞而活細胞不會被染色，藉此 來分辨出活細胞與死細胞，再配合血球計數盤便可以計算出活細胞 數。計算完細胞數後，再依實驗所需之細胞數種至培養皿或培養盤中 並進行實驗。. 每隔一天換medium. 細胞株: TSGH-8301 培養基: RPMI-1640 medium 10% FBS 2 mM LG 1% PS. 培養至八分滿 繼代或培養. PBS清洗細胞. 加入Trypsin-EDTA. 等待3~5分鐘，待細胞懸浮起 加入medium，減緩Trypsin-EDTA作用. 取至離心管並離心1500 rpm，5 分鐘 加入medium稀釋細胞. 繼代培養. 種至培養盤中進行實驗. 圖 2-2-1 細胞培養之簡易意示圖 24.
(39) 三、細胞的冷凍保存 將 TSGH-8301 細胞大量培養後，在細胞處於生長旺盛與存活率 高的情況下進行冷凍細胞。首先要配置抗凍劑。使用 DMSO 與 FBS 混和配置成含有 7% DMSO 的 FBS。將細胞用 Trypsin 收集後，將抗 凍液加入細胞中並分裝於冷凍小管中。分別依序按照以下步驟進行降 溫，4 C 存放 30 分鐘，-20 C 存放 60 分鐘，最後於-80 C 存放至隔 夜後在移至液態氮桶中保存。. 四、冷凍細胞的活化 解凍細胞的過程需要以快速為原則，以避免冰晶的產生與濃度過 高的 DMSO 對細胞產生傷害。因此將細胞從液態氮桶中取出後，馬 上以 37 C 水浴槽快速回溫。等待溶解後加入培養基並均勻混和以便 稀釋 DMSO 濃度，並使用離心機轉速 1500 rpm，5 分鐘，將抗凍劑 去除。移去上清液後加入新鮮培養基。種細胞於培養瓶中並於隔日更 換新的培養基。. 25.
(40) 五、細胞存活率分析 45 實驗原理 MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)是一種黃色水溶性 固體，它會與粒線體中的去氫酵素 (dehydrogenase)作用並代謝之。去 氫酵素會將 tetrazolium ring 切斷並還原成紫色沉澱物 formazan 累積 在細胞中，之後再利用 DMSO 溶解並利用 Elisa reader 以 570 nm 測 吸光值 (O.D.)。因活細胞才具有去氫酵素活性，所以測得的吸光值大 小會與活細胞數成正比，藉此測量細胞存活率。. 實驗方法 將 TSGH-8401 細胞以 1×105 cell/mL 的濃度接種於 24 孔盤培養盤中， 待貼附後加入不同濃度的 Ellagic acid (5, 10, 15, 25, 50, 60, 75 M )， 分別等待 24 與 48 小時後去除上清液，並且加入 500 L 的 MTT (0.5 mg/mL)，待反應 3.5 小時後，去除上清液並加入 500 L 的 DMSO 使 formazan 溶解出後利用 Elisa reader 以 570 nm 測吸光值以得知存活率。. 26.
(41) 六、細胞週期 (Cell cycle) 分析 46 實驗原理 Propidium iodine (PI)是一種螢光染劑，可專一的與核酸鍵結。實 驗利用酒精固定細胞，酒精除了固定細胞外另一個功能為增加細胞膜 的通透性，使 PI 可以進入細胞及核膜中，形成 DNA 特異性染色。且 酒精固定後的細胞相當穩定，樣品可保存於低溫中而不影響染色結果 及實驗數據。由於 PI 可以與核酸產生鍵結，因此可以利用流式細胞 儀 (Flow cytometry；FACS)偵測 PI 之螢光，就可以知道細胞內 DNA 的狀態而進行細胞週期分析。. 實驗方法 將細胞依照 2×105 接種於 12 孔培養盤中，待細胞貼附後加入不 同濃度的 Ellagic acid。分別在培養 48 小時之後，將上清液收至離心 管中，加入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待懸浮 後加入 1 mL 的培養基中和反應並將細胞收到離心管中。接著離心 1500 rpm，5 分鐘，去除上清液後加入 PBS 清洗，離心 1500 rpm，5 分鐘，去除上清液再一邊震盪一邊緩慢的滴入 3 mL 的 70 %酒精。酒 精固定完後置於-20 C 至少 1 個小時。接著離心去除上清液，加入 PBS 清洗細胞，再離心並去除上清液。將細胞打散後加入 PI 染劑(配 27.
(42) 方如)。避光反應 30 分鐘後，以流式細胞儀進行分析，再利用 Modfit LT 分析結果。 表 2-2-1 Cell cycle 之 PI 染劑 組成. 體積. 0.2 mg/mL CAT PI stock. 1 mL. 5% Triton X-100. 10 mL. RNase (10 mg/mL). 2 mL. 1X PBS. 37 mL. 28.
(43) 七、彗星試驗 (Comet assay)47 實驗原理 彗星試驗又稱單細胞電泳分析 (Single cell gel electrophoresis assay)主要是用來分析 DNA 損傷 (DNA damage)的程度。是一個簡 單、快速、準確性高的分析 DNA 損傷之技術。當 DNA 受傷而產生 斷裂時，利用電泳的方式將斷裂成片段的 DNA 拖出膜外，再利用與 DNA 具有專一性結合的螢光染劑染色，接著在螢光顯微鏡下觀察便 可看到斷裂的 DNA 形成如彗星狀的拖尾。藉由拖尾的長短來判斷 DNA 的損害程度。. 實驗方法 將 TSGH-8401 細胞以 2×105 cell/mL 的濃度接種於 12 孔盤培養盤 中，待貼附後加入不同濃度的 Ellagic acid (25, 50, 75, 100 M )。等待 48 小時後，加入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待 懸浮後加入培養基中和反應並將細胞收到離心管中。接著離心 5 分 鐘，去除上清液後加入 PBS。在磨砂載玻片上以鉛筆標上號碼，置 70 L 的下層膠於載玻片上，將蓋玻片蓋上並防止氣泡產生，凝固後 拿下蓋玻片。取 10 L 細胞液混合 60 L 上層膠加在下層膠上，將蓋 玻片以 45°角蓋上防止氣泡產生，凝固後拿下蓋玻片。將做好的載玻 29.
(44) 片置於 Lysis buffer 中。反應後，將玻片移至 alkaline buffer 中。接著 移至以 alkaline buffer 作為電泳液的電泳槽中進行電泳；以 25 V、300 mA 的條件電泳。電泳完後將膠移至 0.4 M Tris buffer。接著將膠置於 methanol 中脫水。最後於膠上滴 100 L 的 DAP I 染色，再利用螢光 顯微鏡觀察拍照。. 30.
(45) 八、細胞核質濃縮現象 48 實驗原理 DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)是一種核酸螢光染劑可以與 雙股 DNA 上的小溝 (minor groove)結合，當細胞凋亡時會出現染色 質凝集 (chromosomes condensation)與 DNA 斷裂 (DNA fragmentation) 的現象。當凋亡越嚴重時，DNA 的損害也就越嚴重因此 DAPI 染上 就會變多，在螢光顯微鏡下觀察就會發現螢光量變多。. 實驗方法 將 TSGH-8401 細胞以 5×104 cell/mL 的濃度接種於 6 孔盤培養盤 中，待貼附後加入不同濃度的 Ellagic acid (25, 50, 75, 100 M )，分別 等待 24 與 36 小時後以 PBS 清洗。利用 4% Formaldehyde 在 4 C 下 固定。再以 PBS 清洗並加入 Triton X-100 1 mL 反應。以 PBS 清洗後， 加入 DAPI 染劑室溫避光反應後，利用 PBS 洗去多餘的 DAPI。再利 用螢光顯微鏡以 UV 光激發 DAPI 螢光並觀察照相之。. 31.
(46) 九、DNA 膠體電泳(DNA gel electrophoresis) 49 實驗原理 當細胞凋亡的時候會有 DNA 斷裂現象發生，其細胞核內 DNA 會裂解成 180~200 bp，可藉由提取 DNA 後。再經由電泳跑膠，看出 是否有 DNA 斷裂現象，要是有斷裂則跑膠照相後會出現階梯狀 (ladder)，可藉由 DNA marker 來得知其斷裂鹼基對 (base pair)。.. 實驗方法 將 TSGH-8401 細胞以 2×105 cell/mL 的濃度接種於 12 孔盤培養盤 中，待貼附後利用不同濃度的 Ellagic acid (0, 25, 50, 75 M )處理細 胞。經過 48 小時之後以 Tissue and Cell Genomic DNA Purification Kit (Gene Mark)抽取 DNA。 首 先 將 上 清 液 收 至 離 心 管 中 ， 加 入 PBS 清 洗 細 胞 並 利 用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待懸浮後加入 1 mL 的培養基中和反應並 將細胞收到離心管中。接著離心 1500 rpm，5 分鐘，去除上清液後加 入 PBS 清洗，離心 1500 rpm，5 分鐘，到掉上清液，加入 200 M PBS 混合細胞後移至 eppendorf，以 13000 rpm 離心 10 秒，小心移去上清 液加入 200 L PBS,混和均勻。加入 48 L RNase A (10 mg/ mL)，靜 置室溫 5 分鐘。加入 20 l Proteinase K 和 200 L Binding buffer，混 32.
(47) 和均勻後放入 70℃乾浴鍋，等待 10 分鐘加入 200 μL Ethanol 混和均 勻，移到 spin column，高速離心 13000 rpm，1 分鐘。丟棄下面液體， 加入 300 μL Binding buffer, 以最高速離心 1 分鐘。丟棄下面液體，加 入 600 μL Washing solution, 再以最高速離心 1 分鐘。丟棄下面液體， 加入 600 μL Washing solution, 再以最高速離心 1 分鐘。最高速離心 到乾, 3 到 5 分鐘並更換新已去上蓋的 ependorf。丟棄下面液體。使 用新 ependorf 並放入 55℃烘箱 3 到 5 分鐘，以揮發殘留 Ethanol。丟 棄下面收集管，換上新的 ependorf，將 Elution Solution 取到 ependorf 預熱 70℃，並以每個 sample 約 50 μL 到 60 μL 的量加入。放置室 溫 1 到 2 分鐘，離心 1 分鐘，收集下面液體其內含 DNA。儲存於-20 ℃，待 DNA 跑膠。 將 DNA 與 6X DNA loading dye 以 5：1 比例混勻，loading 至 2% agarose (1 g agarose、50 mL 0.5X TBE buffer、10 L Ethedium bromide) 中，以 100 V 進行電泳約 40 分鐘。將膠拿至 UV 下照射，拍照。. 33.
(48) 十、活性氧物質 50 實驗原理 利用 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (H2DCF-DA)在細胞內一連 串的反應並形成螢光來測量 ROS 的產生。H2DCF-DA 可滲透至細胞 內，在細胞內被乙醯酯酶 (esterases)去乙醯化 (deacetylated)而形成 DCFH，DCFH 無法通過細胞膜因而被留在細胞中。DCFH 接著會被 H2O2 氧化而形成具有螢光特性的 DCF，並聚集在粒線體中，利用流 式細胞儀分析螢光量便可測得細胞內 H2O2 的濃度。. 實驗方法 將 TSGH-8401 細胞以 2×105 cell/mL 的濃度接種於 12 孔盤培養盤 中，待貼附後分別以 50 M 的 Ellagic acid 處理 12、24、36、48 小 時後。加入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待懸浮 後加入 1 mL 的培養基中和反應並將細胞收到離心管中。接著離心 1500 rpm，5 分鐘。離心完去除上清液加入 PBS 再離心 1500 rpm，5 分鐘。去除上清液後加入 H2DCF-DA，混合均勻後於 37 C 水浴槽中 反應半小時。最後再以流式細胞儀分析，收集至少 10000 顆細胞並以 CellQuest®軟體分析。. 34.
(49) 十一、粒線體膜電位 (Mitochondrial membrane potential,m)變化 51 實驗原理 細胞膜電位探針。DiOC6 (3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodine)是 一種可穿透細胞膜，專一性結合並累積在細胞粒線體內，DiOC6 在細 胞膜內外的分布可以反應出細胞膜內外的電位差，其螢光強度的改變 就可以顯示細胞膜電位改變的情形。可發出綠色螢光 (green-fluorescent)之陽離子 (cationic dye)親脂性染劑；不需要固定細 胞會其他處理的情況下可以即時、快速的偵測活細胞內粒線體膜電 位。粒線體膜功能不良 (mitochondrial dysfuction)的時候通常伴隨著 細胞凋亡的發生，因此細胞粒線體膜電位的改變也就當作早期凋亡偵 測上的指標。. 實驗方法 將 TSGH-8401 細胞以 2×105 cell/mL 的濃度接種於 12 孔盤培養盤 中，待貼附後分別以 50 M 的 Ellagic acid 處理 12、24、36、48 小 時後。加入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待懸浮 後加入 1 mL 的培養基中和反應並將細胞收到離心管中。接著離心 1500 rpm，5 分鐘。離心完去除上清液加入 PBS 再離心 1500 rpm，5 分鐘。去除上清液後加入 DiOC6，混合均勻後於 37 C 水浴槽中反應 35.
(50) 半小時。最後再以流式細胞儀分析，收集至少 10000 顆細胞並以 CellQuest®軟體分析。. 36.
(51) 十二、鈣離子 (Ca2+)釋出之檢測 52 實驗原理 胞內鈣離子作為細胞信號傳導的郵差，是細胞激活過程中重要的 功能。利用螢光染劑 Fluo-3/AM 通過細胞膜後，在細胞內被內生性的 (endogenous esterases)水解 (hydrolyze)成 Fluo-3。Fluo-3 才能滯留在 細胞內並跟鈣離子具有專一性的結合力。利用流式細胞儀分析螢光量 便可測得細胞內鈣離子的濃度。. 實驗方法 將 TSGH-8401 細胞以 2×105 cell/mL 的濃度接種於 12 孔盤培養盤 中，待貼附後分別以 50 M 的 Ellagic acid 處理 12、24、36、48 小 時後。加入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待懸浮 後加入 1 mL 的培養基中和反應並將細胞收到離心管中。接著離心 1500 rpm，5 分鐘。離心完去除上清液加入 PBS 再離心 1500 rpm，5 分鐘。去除上清液後加入 Fluo-3/AM，混合均勻後於 37 C 水浴槽中 反應半小時。上機前離心 1500 rpm，5 分鐘，去掉上清液以便去掉多 餘的染劑。接著加入 500 L 的 PBS 再用流式細胞儀分析。收集至少 10000 顆細胞並以 CellQuest®軟體分析。. 37.
(52) 十三、西方點墨法 (Western blotting)53 實驗原理 藉由抗體抗原反應來觀察蛋白質的變化。藉由特定抗體對特定胺 基酸序列具有專一性特性，當抗體與蛋白質抗原結合後，再以帶有 Horseradish peroxidase (HRP)的二級抗體與一級抗體做結合。再利用 Enhanced chemiluminescent (ECL)呈色後，藉由感光底片吸收冷光而 產生曝光。經過顯影與定影步驟後，根據曝光程度區域大小就可以知 道蛋白質表現量的變化。. 實驗方法 (1) 蛋白質萃取 (protein extration) 將 TSGH-8401 細胞以 2×106 cell/mL 的濃度接種於 10 cm2 培養盤 中，待貼附後分別以 50 M 的 Ellagic acid 處理 12、24、36、48 小 時後。加入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待懸浮 後加入 1 mL 的培養基中和反應並將細胞收到離心管中。接著離心 3000 rpm，5 分鐘。離心完後去除上清液，加入 1 mL 的 PBS 將細胞 移至 1.5 mL 微量離心管中。接著離心 13000 rpm，1 分鐘。離心完後 去除上清液，加入 400 L 的 Lysis buffer (PRO-PREP for Cell/Tissue)。 依照細胞量的多寡決定其加入的量，一般每 2.5×106 cell/mL 的細胞數 38.
(53) 增加 200 L 的 Lysis buffer。將細胞混合後置於-20 C 冰箱中 24 小 時後離心 13000 rpm，10 分鐘。取其上清液至另一微量離心管後進行 蛋白質定量。 (2) 蛋白質的定量分析 以 Bradford 定量法定量，使用胎牛血清白蛋白(Bovine serum albumun；BSA)做為標準品。配置不同濃度的標準品後，利用 Bio-rad 與標準品混和且以相同的混合方式與樣品混合。混合均勻後，取至 96 孔盤培養盤利用酵素免疫分析儀 (ELISA reader)在吸光值 O.D.595 nm 下 測 量 其 吸 光 值 並 以 標 準 品 吸 光 值 做 出 標 準 曲 線 (standard curve)。求出標準曲線的線性回歸方程式與 R2 值。將樣品吸光值帶回 線性曲線方程式並求出蛋白質濃度。 (3) SDS-PAGE 分析 首先配置 SDS gel，其組成如表 2-2-2 與表 2-2-3，將蛋白質利用 1%SDS 稀釋置所需濃度並取出 20 L 與 5 L 的 protein loading dye 混合均勻，以 90C 加熱 10 分鐘。於電泳槽中加入 electrophoresis running buffer (配方如表 2-2-4)後，於樣品槽中加入須分析之蛋白質 與分子量指示劑 (marker)用以對照蛋白質分子量。以電壓 80 volt 電 泳，待樣品通過 stacking gel 之後，電壓調至 110 volt 繼續電泳直到染 劑到達底端並停止電泳。 39.
(54) (4)轉漬步驟 先 將 蛋 白 質 轉 印 膜 (PVDF membrane) 與 濾 紙 浸 泡 於 transfer buffer (配方如)中，取轉漬夾，依照海綿、濾紙、SDS 膠片、蛋白質 轉印膜、濾紙、海綿依序疊於轉漬夾中。膠片與蛋白質轉印膜中不可 以有氣泡。將轉漬夾移至有 transfer buffer 的轉漬槽中，蛋白質轉印 膜面向正極，SDS 膠片面向負極 (圖 2-2-2)。以 80 volt 進行轉漬 2 小時。. (5)影像呈現 轉印完後以麗春紅 (Poncean S)染劑染色，可以看出蛋白質轉漬 至膜上的情形。用 PBST (0.1% Tween 20 in PBS)洗蛋白質轉印膜至紅 色褪去。加入 blocking buffer (5% Fat free milk in PBST)搖晃 2 小時， 可使膜上面未轉漬上蛋白的部分填滿酪蛋白以免抗體非專一性結 合。接著利用 PBST 清洗轉印膜 5 分鐘 3 次後加入 1 級抗體，4C 搖 晃至隔天。回收一級抗體並以 PBST 清洗轉印膜 5 分鐘 3 次後加入 2 級抗體，於室溫下搖晃 1 小時，取出轉印膜。以 PBST 清洗轉印膜 5 分鐘 3 次。最後將轉印膜與 ECL kit 的試劑混合液反應，並將轉印膜 夾於透明投影片中以感光底片顯影之。. 40.
(55) 表 2-2-2 SDS-PAGE 下層膠 (Separating gel)之配置與組成 組成. 10% separating gel. 12% separating gel. ddH2O. 9.6 mL. 8.6 mL. 40% Acrylamide/Bis (29:1). 5 mL. 6 mL. 0.5 M Tris (pH=8.8). 5 mL. 5 mL. 10% SDS. 0.2 mL. 0.2 mL. 10% APS. 0.2 mL. 0.2 mL. TEMED. 30 L. 12 L. 表 2-2-3 SDS-PAGE 上層膠 (Stacking gel)之配置與組成 組成. 5% stacking gel. ddH2O. 4.06 mL. 40% Acrylamide/Bis (29:1). 1.02 mL. 0.5 M Tris (pH=6.8). 1.66 mL. 10% SDS. 66 mL. 10% APS. 33.4 mL. TEMED. 30 L. 表 2-2-4 電泳緩衝液 (Electrophoresis rinning buffer) 組成. 體積. 10X TG-SDS buffer (25 mM Tris, 192mM glycine,0.1% SDS) 200 mL ddH2O. 1800 mL. 41.
(56) 表 2-2-5 轉漬緩衝液 (Transfer buffer) 組成. 體積. Tris. 4.5 g. Glysine. 21.6 g. Methanol. 300 mL. ddH2O. 1200 mL. 圖 2-2-2 蛋白質轉漬順序. 42.
(57) 十四、免疫螢光染色 54 實驗原理 利用抗體與抗原反應，將一級抗體直接送入細胞內與需要偵測之 蛋白質結合，再藉由二級抗體連接 Fluorescein isothiocyanate (FITC) 螢光的方式，且使用不同的螢光染劑標記細胞內胞器，如粒線體、細 胞核等。最後利用共軛焦顯微鏡 (Confocal microscope)觀察螢光呈現 的情形得知蛋白質的表現量或轉移等現象。. 實驗方法 將載坡片固定於 10 cm2 培養盤中接著將 TSGH-8401 細胞以 2×106 cell/mL 的濃度接種於 10 cm2 培養盤中，待貼附後分別以 50 M 的 Ellagic acid 處理 48 小時。取出載坡片並以 PBS 洗過，利用甲醇 (Methanol)將細胞固定，作用 20 分鐘。以 PBS 清洗 3 次再利用 0.1% 的 Triton-X 100 作用 30 分鐘。以 PBS 清洗 3 次加入一級抗體染劑 (50~60 l)放至隔天。PBS 清洗 3 次五分鐘，再染二級抗體 PBS。清 洗 3 次五分鐘，再依其需要染細胞核、粒線體等。最後 PBS 清洗 3 次五分鐘，再以封片膠將其封片並進行共軛焦顯微鏡的觀察。. 43.
(58) 十五、Annexin V affinity assay55 實驗原理 細胞在程序性死亡 (apoptosis)時，phospholipid phosphatidylserine (PS)會從細胞膜內層向外轉移至外層。此時利用 Annexin V 可與之結 合。Annexin V 為一種具有鈣離子依存性的磷脂質，它會與 PS 具有 高度的專一性。因此使 Annexin V 帶有螢光物質，便可偵測 PS 外翻 的情形。再利用 Propidium Iodide (PI)去區別細胞凋亡的時期。. 實驗方法 將 TSGH-8401 細胞以 2×105 cell/mL 的濃度接種於 12 孔盤培養盤 中，待貼附後分別以 50 M 的 Ellagic acid 處理 12、24、36、48 小 時後。加入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待懸浮 後加入的培養基中和反應並將細胞收到離心管中。接著離心 5 分鐘。 離心完去除上清液加入 PBS 再離心 5 分鐘。去除上清液後加入 5 L 的 Annexin V-FITC 與 5 L 的 PI，均勻混合後置於室溫 (25C)避光反 應，再加入 400 L 的 1X binding buffer 終止反應。再用流式細胞儀分 析。收集至少 10000 顆細胞並以 CellQuest®軟體分析。. 44.
(59) 十六、Caspase-3 活性分析 55 實驗原理 利用 Caspase-3 substrate (PhiPhiLux-G1D2)來偵測 Caspase-3 的活/ 性。PhiPhiLux-G1D2 具有螢光物質，當 Caspase-3 具有活性的時候會 將 Caspase-3 substrate 特定的序列裂解，使得含有螢光物質的部分產 生。再經由流式細胞儀偵測，根據螢光的產量就可知道 Caspase-3 的 活性。. 實驗步驟 將 TSGH-8401 細胞以 2×105 cell/mL 的濃度接種於 12 孔盤培養盤 中，待貼附後分別以 50 M 的 Ellagic acid 處理 12、24 小時後，加 入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。待懸浮後加入 1 mL 的培養基中和反應並將細胞收到離心管中。接著離心 1500 rpm， 5 分鐘。離心完去除上清液加入 PBS 再離心 1500 rpm，5 分鐘。去除 上清液後加入 Caspase-3 substrate (PhiPhiLux-G1D2) ，混合均勻後於 37 C 水浴槽中反應。反應後，加入 1 mL 的 PBS 再以 1500 rpm ，5 分鐘離心，並去除上清液後，接著加入的 Flow Cytometer Buffer 再用 流式細胞儀分析。收集至少 10000 顆細胞並以 CellQuest®軟體分析。. 45.
(60) 十七、Quantitative PCR Analysis56 實驗原理 其原理是操作 PCR 的同時，再加入一段可與 DNA 樣品互補的探 針，而這段探針具有螢光標記。當探針與 DNA 樣品互補時，才會發 散出螢光。因此 PCR 的循環次數愈多，DNA 濃度愈高，偵測到的螢 光強度就愈高。此時儀器內部會設定預期達到的螢光強度，達到該螢 光強度所需要的複製次數，又稱為 threshold cycle。也就是說 DNA 樣 品濃度愈多，可以較少的 threshold cycle 達到預測的螢光強度；DNA 樣品濃度愈少，就需較多的 threshold cycle 才達到預測的螢光強度。 因此便能畫出各已知核酸濃度與 threshold cycle 間反比的檢量線。未 知樣品便能從檢量線中求得。. 實驗步驟 將 TSGH-8401 細胞以 2×105 cell/mL 的濃度接種於 12 孔盤培養盤 中，待貼附後分別以 50 M 的 Ellagic acid 處理 24 與 48 小時後，加 入 PBS 清洗細胞並利用 Trypsin-EDTA 使細胞懸浮。離心並利用 PBS 清洗過一次後，萃取 total RNA。接著將 RNA 反轉錄成 cDNA。接著 利用有螢光標記的探針進行 PCR。根據螢光量的產生取得數據。. 46.
(61) Primer Name. Primer sequence. homo caspase-3-F. CAGTGGAGGCCGACTTCTTG. homo caspase-3-R. TGGCACAAAGCGACTGGAT. homo caspase-9-F. TGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTT. homo caspase-9-R. GTGAGCCCACTGCTCAAAGAT. 表 2-2-6 Quantitative PCR 所使用之 primer. 47.
(62) 十八、統計分析 實驗結果以平均值標準差 (mean±SD)表示，使用 Student’s t-test 來決定實驗組與對照組之差異。當 p 值小於 0.05 時則認為具有統計 上的意義，以＊表示之。. 48.
(63) 第三章 研究結果 第一節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞生長影響 人類膀胱癌細胞 TSGH-8301 細胞經過不同濃度(5、10、25、50、 75 M)的 Ellagic acid 處理後，細胞的數量減少與細胞產生皺縮的現 象(圖 3-1-1 與圖 3-1-2)。再由 MTT assay 測試存活率，在量化表發 現 Elligic acid 在 24、48 小時對於 TSGH-8301 細胞的毒殺效果隨著劑 量的上升而增加並隨著時間的增加存活率也隨之下降(圖 3-1-3)，結 果顯示 Elligic acid 對於 TSGH-8301 細胞的毒殺效果具有計量依賴性 (Dose dependent)與時間依賴性 (Time dependent)的現象。. 0 M. 5 M. 10 M. 25 M. 50 M. 75 M. 圖 3-1-1 TSHG-8301 細胞經不同濃度 Ellagic acid 處理 24 小時後細胞 型態之變化。 49.
(64) 0 M. 5 M. 10 M. 25 M. 50 M. 75 M. 圖 3-1-2 TSHG-8301 細胞經不同濃度 Ellagic acid 處理 48 小時後細胞 型態之變化。. 50.
(65) Relative of cell number (% of control). 110. 24 hours 48 hours. 100 90 80 70. *. *. *. *. *. *. *. *. *. 60. *. 50. *. *. 40. *. *. 30 0. 5. 10. 15. 25. 50. 60. 75. Concentration of ellagic acid (M) 圖 3-1-3 EA 對於 TSGH-8301 細胞之細胞存活率的影響。TSGH-8301 細胞以 5、10、15、25、50、60、75 M 之 EA 處理 24、48 小時後， 以 MTT assay 方法檢測細胞存活率。實驗數據以三重複求其平均值與 標準差，並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。. 51.
(66) 第二節 Ellagic acid 對老鼠正常細胞株 A10 毒性的影響 為了更進一步確認 Ellagic acid 對正常細胞是否有毒性，因此利 用老鼠正常動脈平滑肌細胞株 A10 以 MTT 的方式測試處理藥物後的 存活率。實驗結果顯示 A10 細胞株在處理不同濃度藥物並培養 48 小 時後，A10 之存活率呈現非計量依賴性下降，且相較於 TSGH-8301 的存活率還要來的高。結果顯示 Ellagic acid 對於正常細胞所造成毒 性相較於 TSGH-8301 還要來的低。. 52.
(67) Relative of cell number (% of control). A10 cells TSHG-8301 cells. 120 100. *. *. 80. *. 60 40 20 0 0. 25. 50. 75. 100. Concentration of ellagic acid (M) 圖 3-2-1 EA 對正常細胞 A10 與 TSGH-8301 存活率的影響。正常細胞 A10 與 TSGH-8301 細胞以 25、50、75、100 M 之 EA 處理 48 小時 後，以 MTT assay 方法檢測細胞存活率。實驗數據以三重複求其平均 值與標準差，並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。. 53.
(68) 第三節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞週期的影響 利用流式細胞儀檢測細胞內 DNA 的含量用以判別細胞週期的分 布，當 TSGH-8301 細胞與不同濃度之 Ellagic acid 共同培養 48 小時 後 ， 由 分 析 圖 可 發 現 G0/G1 的 比 例 隨 著 濃 度 的 上 升 而 增 加 ( 圖 3-3-1)，由圖 3-3-2 可發現 G0/G1 的比例從不處理藥物組別 (49.5%) 至處理 25 M Ellagic acid (62.2%)增加了 12.7%。TSGH-8301 細胞 25 M Ellagic acid 處理後，在 12、24、36、48、72 小時後觀察其細胞 週期的變化，結果發現處理 25 M Ellagic acid 後的細胞之 G0/G1 期 隨著處理的時間增加其比例也有逐漸增加的情形(圖 3-3-2)，結果顯 示細胞出現停滯在 G0/ G1 期的現象。. 54.
(69) (A) 0 M. 5 M. 15 M. 50 M. 75 M. G0/G1 phase Apoptosis G2/M phase S phase. 25 M. (B) 0 M 5 M 15 M 25 M 50 M 75 M. 70. Cell phase distribution (%). 60 50 40 30 20 10 0 G0/ G1 phase. G2/ M phase S phase. apoptosis. 圖 3-3-1 不同濃度 EA 處理 TSGH-8301 細胞 48 小時後，細胞周期之 變化。TSGH-8301 細胞以 5、15、25、50、75 M 之 EA 處理 48 小 時後，以流式細胞儀檢測細胞周期並利用 Modfit LT 軟體分析結果。 (A) 細胞周期分析圖。(B) Modfit LT 軟體分析後得到之量化圖。 55.
(70) (A) 0 hour. 12 hours. 24 hours. Dip G1 Dip G2 Dip S. Dip G1 Dip G2 Dip S. G0/G1: 38.81% S: 32.01% G2/M: 29.18%. 0. 50. 100. 150. Channels (FL2-A). 200. G0/G1: 43.69% S: 32.04% G2/M: 24.27%. 0. 36 hours. 50. 100. 150. 200. Channels (FL2-A). 0. 100. 150. Channels (FL2-A). 200. 50. 100. 150. Channels (FL2-A). Dip G1 Dip G2 Dip S. G0/G1: 67.00% S: 26.07% G2/M: 6.93%. G0/G1: 69.67% S: 21.30% G2/M: 9.03%. 0. 50. 100. 200. 72 hours Dip G1 Dip G2 Dip S. G0/G1: 64.04% S: 20.78% G2/M: 15.18%. 50. G0/G1: 47.11% S: 26.34% G2/M: 26.55%. 48 hours Dip G1 Dip G2 Dip S. 0. Dip G1 Dip G2 Dip S. 150. 200. Channels (FL2-A). 0. 50. 100. 150. Channels (FL2-A). 200. (B). Cell phase distribution (%). 80. G0/G1 phase G2/M phase S phase. 60. *. 40. *. *. *. 48. 72. *. 20 0 0. 12. 24. 36. Time of incubation (h). 圖 3-3-2 TSGH-8301 細胞以 25μM 的 EA 處理後，細胞週期之變化。 細胞以 25 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48、72 小時後，利 用流式細胞儀觀察細胞週期變化。(A) 細胞週期分析圖。(B) Modfit LT 軟體分析後得到之量化圖。實驗數據以三重複求其平均值與標準差， 並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。 56.
(71) 第四節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞 DNA 損傷的影響 (一) DAPI 染色法 DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)會與 DNA 雙股螺旋小溝的 AT 區結合。當結合時在螢光顯微鏡下觀察到的螢光強度也越強，表 示 DNA 斷裂的情形越嚴重。由圖 3-4-1 與圖 3-4-2 顯示 TSGH-8301 細胞經過 50、75、100 M 的 Ellagic acid 處理 24、36 小時後，可發 現隨著濃度增加其螢光強度明顯增強，表示 DNA 斷裂與核質濃縮的 現象越明顯。. 57.
(72) 24 hours. 36 hours. control. 50 M. 75 M. 100 M. 圖 3-4-1 EA 對於 TSGH-8301 細胞之染色體凝集的影響。TSGH-8301 細胞以 50、75、100 M 之 EA 處理 24 與 36 小時後。利用倒立式螢 光顯微鏡所觀察其染色質凝集之現象與拍攝。 58.
(73) Fluorescence intensity (% of control). 1000. 24 hours 36 hours. 800. * *. 600. *. *. 400. *. *. 200 0 0. 50. 75. 100. Concentration of ellagic acid (M) 圖 3-4-2 DAPI 螢光量之量化圖。TSGH-8301 細胞以 50、75、100 M 之 EA 處理 24 與 36 小時後，觀察染色質凝集之現象。利用倒立式螢 光顯微鏡所觀察與拍攝後，並將 DAPI 之螢光量量化。實驗數據以三 重複求其平均值與標準差，並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。. 59.
(74) (二) 彗星試驗 (Comet assay) 由圖 3-4-3 可得知隨著 Ellagic acid 濃度的增加其細胞拖尾的現 象越明顯，代表細胞受到 Ellagic acid 的處理會使之 DNA 產生斷裂與 受損的情形，且濃度越高其受損越嚴重。. 60.
(75) (A) Positive control 0.5% H2O2. Negative control 2% DMSO. 25 M. 50 M. 0 M. 75 M. Comet length (folds of control). (B) 5. *. 4. *. *. 3. *. 2 1 0. 0. 25. 50. 75. 0.5 % 2 % Concentration of ellagic acid (M) H2O2 DMSO. 圖 3-4-3 EA 對於 TSGH-8301 細胞之 DNA 產生受損的影響。 TSGH-8301 細胞以 25、50、75 M 之 EA 處理 48 小時後，利用彗星 試驗觀察細胞核拖尾之現象。(A) 利用倒立式螢光顯微鏡所觀察並拍 攝圖。(B) 細胞核拖尾之量化圖。實驗數據以三重複求其平均值與標 準差，並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。 61.
(76) (三) DNA 膠體電泳 (DNA gel electrophoresis) 當細胞 DNA 受損的時候，利用 DNA 膠體電泳可看出其成階梯 狀分布，約在 180~200 bp 間的位置有所謂的 DNA ladder 的表現。實 驗結果顯示隨著處理藥物的濃度增加，DNA 斷裂的情況有明顯的表 現(圖 3-4-4)。結果表示 Ellagic acid 會誘使 TSGH-8301 細胞的 DNA 產生受損的現象。. 62.
(77) (A) Ellagic acid Marker. 0. 25. 50. 75. (M). 300 bp 200 bp 100 bp. (B) Marker 0. Ellagic acid 12 24 36. 48 (hours). 300 bp 200 bp 100 bp. 圖 3-4-4 EA 對於 TSGH-8301 細胞之 DNA 產生斷裂的影響。(A) 不 同濃度的 EA 處理細胞 48 小時後，利用 DNA 膠體電泳偵測 DNA 斷 裂之現象。(B) 以 50 M 的 EA 處理細胞不同時間點，利用 DNA 膠 體電泳偵測 DNA 斷裂之現象。 63.
(78) 第五節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞產生活性氧物質能力的影響 TSGH-8301 細胞以 50 M 的 Ellagic acid 處理後，經過 12、24、 36、48 小時利用流式細胞儀偵測 H2DCF-DA 螢光量，觀察 ROS 在細 胞內的表現情形。由圖可以觀察到 H2DCF-DA 螢光量當細胞處理藥 物 12 小時候開始下降，而在 36 小時後開始上升。. 64.
(79) (A). 0 hour 12 hours. 24 hours. 36 hours 48 hours. ROS productions (folds of control). (B) 1.4 1.2 1.0. *. *. 12. 24. *. *. 36. 48. 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0. Time of incubation (hours). 圖 3-5-1 EA 對於 TSGH-8301 細胞活性氧化物質(ROS)產生的影響。 TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48 小時 後，利用流式細胞儀觀察 ROS 在細胞內的表現。(A) 流式細胞儀觀 察 ROS 在細胞內表現分析圖。(B) ROS 在細胞內表現量化圖，實驗 數據以三重複求其平均值與標準差，並以 student’s t-test 統計分析，* 表示 p<0.05。 65.
(80) 第六節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞內鈣離子 (Ca2+)釋出的影響 以 50 M 的 Ellagic acid 處理 TSGH-8301 細胞後，經過 12、24、 36、48 小時利用流式細胞儀偵測 Fluo-3 螢光量，觀察 Ca2+在細胞內 的表現情形。由圖可以觀察到 Fluo-3 螢光量當細胞處理藥物 12 小時 候開始下降，而在 36 小時後開始上升。. 66.
(81) (A). 0 hour 12 hours. 36 hours. 24 hours. 48 hours. Intracellular Ca2+ increase (folds of control). (B). 2.0. *. 1.5. * 1.0. *. 0.5. *. 0.0 0. 12. 24. 36. 48. Time of incubation (hours). 圖 3-6-1 EA 對 TSGH-8401 細胞內鈣離子 (Ca2+)釋 出 的 影 響 。 TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48 小時 後，利用流式細胞儀觀察鈣離子在細胞內的表現情形。(A) 流式細胞 儀觀察鈣離子在細胞質內釋出之分析圖。(B) 鈣離子在細胞質內釋出 之量化圖，實驗數據以三重複求其平均值與標準差，並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。 67.
(82) 第七節 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞粒線體電位(Mitochondrial membrane potential, MMP,m)的影響 以 50 M 的 Ellagic acid 處理 TSGH-8301 細胞後，經過 12、24、 36、48 小時利用流式細胞儀偵測 DiOC6 螢光量來觀察粒線體電位 (Mitochondrial membrane potential, MMP,m)的變化。隨著處理藥物 的時間越長 DiOC6 螢光量顯著的下降，結果顯示 Ellagic acid 會去影 響粒線體膜電位並使之下降。. 68.
(83) (A). 12 hours 0 hour. 24 hours 36 hours 48 hours. Loss of m (folds of control). (B) 1.2. *. 1.0. *. 0.8. *. 0.6. *. 0.4 0.2 0.0 0. 12. 24. 36. 48. Time of incubation (hours). 圖 3-7-1 EA 對 TSGH-8401 細胞粒線體電位的影響。TSGH-8301 細胞 以 50 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48 小時利用流式細胞儀 觀察粒線體膜電位的變化。(A) 粒線體膜電位的變化之分析圖。(B) 粒線體膜電位的變化之量化圖。實驗數據以三重複求其平均值與標準 差，並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。. 69.
(84) 第八節 Ellagic acid 誘導 TSGH-8401 細胞產生細胞凋亡的影響 (1) Annexin V affinity assay 藉由當細胞產生凋亡時，磷脂質絲胺酸. (phospholipid. phosphatidylserine ； PS) 會 從 細 胞 膜 內 層 外 轉 移 至 外 層 。 並 利 用 Annexin V 與之的專一性來偵測細胞凋亡的現象。圖 3-8-1 中顯示隨 著 50 M 的 Ellagic acid 處理的時間越長，TSGH-8301 細胞的細胞凋 亡現象越來越多。證實 Ellagic acid 會誘導 SGH-8301 細胞的凋亡。. 70.
(85) (A) control. 6 hours. 12 hours. 24 hours. 48 hours. (B). Annexin V affinity (%). 50. *. 40 30. *. 20 10. *. *. 0 0. 6. 12. 24. 48. Time of incubation (hours). 圖 3-8-1 EA 誘導 TSGH-8401 細胞產生細胞凋亡的影響。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理，經過 6、12、24、48 小時後，利用流式細 胞儀觀察磷脂質絲胺酸外翻的變化。(A) Annexin V affinity assay 之分 析圖。(B) Annexin V affinity assay 之量化圖。實驗數據以三重複求其 平均值與標準差，並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。 71.
(86) (2) Caspase activity assay 過去研究指出 Caspase-3 的活性常做為細胞凋亡的指標之一，利 用流式細胞儀配合 PhiPhiLux kit 來偵測 Caspase-3 的活性，螢光的強 度越強表示 Caspase-3 的活性越高。由圖可以看出隨著處理 Ellagic acid 時間的增加，Caspase-3 的活性也就越高。實驗結果顯示 Ellagic acid 可以誘發 Caspase-3 的活性也進一步的確認 Ellagic acid 可以引起 細胞的凋亡。此外同時也測試了 Caspase-3 上游蛋白 Caspase-9 的活 性，也發現 caspase-9 的活性在 12 小時便有顯著上升的情形。. 72.
(87) (A). 0 hour 12 hours. 24 hours. Caspase-9 activity (folds of control). (B) 2.5. *. 2.0. *. 1.5 1.0 0.5 0.0 0. 12. 24. Time of incubation (hours). 圖 3-8-2 EA 對於 TSGH-8301 細胞 caspase-9 活性的影響。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 Ellagic acid 處理後，經過 12、24 小時利用流式細胞 儀觀察 caspase-9 活性的變化。(A) caspase-9 活性之分析圖。(B) caspase-9 活性之量化圖。實驗數據以三重複求其平均值與標準差，並 以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。 73.
(88) (A). 0 hour 12 hours. 24 hours. Capase-3 activity (folds of control). (B) 5. *. 4 3 2 1 0 0. 12. 24. Time of incubatoin. 圖 3-8-3 EA 對於 TSGH-8301 細胞 caspase-3 活性的影響。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 Ellagic acid 處理後，經過 12、24 小時利用流式細胞 儀觀察 caspase-3 活性的變化。(A) caspase-3 活性之分析圖。(B) caspase-3 活性之量化圖。實驗數據以三重複求其平均值與標準差，並 以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。 74.
(89) 第九節 以西方墨點法探討 Ellagic acid 對 TSGH-8401 細胞產生細胞 凋亡之相關蛋白表現 將細胞以 50 M Ellagic acid 處理並利用西方墨點法分析處理藥 物後之 0、12、24、36、48 小時的蛋白表現 實驗結果顯示 pro-apoptosis 中的 Bax、Bak 表現有上升的情形且 t-Bid 也有表現的情形(圖 3-9-1)。在由粒線體中釋放出的與凋亡相關 蛋白中 AIF、Endo G、Cytochrome c 表現量也有明顯的上升(圖 3-9-2)。 Cytochrome c 會引起下游的 Apaf-1 的活化而引起一系列的 Caspase 活 化，實驗結果顯示 Apaf-1 有表現上升的情形且下游的 caspase-9 與 caspase-3 有被裂解的情形(圖 3-9-3)。而外在路徑中的 Fas、FasL、 caspase-8、t-Bid 的表現量上升。此外 anti-apoptosis 蛋白 Bcl-XL、Bcl-2 與 XIAP 表現量有隨著處理藥物的時間增加而表現量下降。. 75.
(90) Ellagic acid (50 M) 0. 12. 36. 24. 48. (hours). Bid. 22 kDa. tBid. 15 kDa 1.00 2.19. 1.25 1.75 1.61. -actin. 42 kDa 1.00. 1.02. 1.06. 1.10. 0.92. 21 kDa. Bax 1.00. 2.09. 2.10 2.19 2.16. -actin. 42 kDa 1.00 1.08. 1.04. 1.03. 1.15. 30 kDa. Bak 1.00. 1.29 2.00. 1.49. 2.15. -actin. 42 kDa 1.00 1.03 1.06 0.97 1.08. 圖 3-9-1 粒線體路徑之凋亡相關蛋白表現變化。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48 小時後，利用西方墨點 法檢測與粒線體路徑之凋亡相關蛋白 t-Bid、Bax、Bak 的表現變化。. 76.
(91) Ellagic acid (50 M) 0. 12. 24. 36. 48. (hours) 57 kDa. AIF 1.00. 1.16. 1.39. 1.69. 1.35. 30 kDa Endo G. 25 kDa 1.00. 0.94. 0.92. 14 kDa. cytochrome c 1.00. 1.08. 1.16. 1.17. 1.26. 21 kDa. Smac/DIABLO 1.00 1.38. 1.42 1.61 1.64. 42 kDa. -actin 1.00. 1.09. 1.05 1.16. 1.33. 圖 3-9-2 存於粒線體內之凋亡相關蛋白變化。TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48 小時後，利用西方墨點法檢 測有關存於粒線體內之凋亡相關蛋白 AIF、Endo G、Cytochrome c、 Smac/DIABLO 的表現變化。. 77.
(92) Ellagic acid (50 M) 0. 12. 24. 36. 48. (hours) 130 kDa. Apaf-1 1.00 1.09 1.06. precursor form. Caspase-9. 1.00 1.59. 2.80 3.33 3.19. -actin. cleavaged form 42 kDa. 1.00. 1.22. 1.24. 1.13. 1.21. precursor form. Caspase-3. cleavaged form 1.00 1.27. 1.85 1.59. -actin 1.00. 1.20. 1.20 1.29. 42 kDa. 1.38. 圖 3-9-3 與 粒 線 體 相 關 內 在 路 徑 之 凋 亡 相 關 蛋 白 表 現 變 化 。 TSGH-8301 細胞以 50 M 的 EA 處理後，經過 12、24、36、48 小時 後，利用西方墨點法檢測有關於粒線體內在路徑之凋亡相關蛋白 Apaf-1、caspase-9、caspase-3 之表現變化。. 78.
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